Frontiers in Pharmacology

Introduction

Biologisch aktive Peptide sind der allgemeine Begriff für verschiedene Peptide, die unterschiedliche Zusammensetzungen und Anordnungen von natürlichen Aminosäuren darstellen. Es ist bekannt, dass sie aufgrund multifunktionaler Verbindungen, die aus tierischen oder pflanzlichen Proteinen gewonnen werden, eine Vielzahl biologischer Funktionen wie antioxidative, immunfördernde, hormonmodulierende, antibakterielle, antithrombotische, antivirale und blutdrucksenkende Aktivitäten besitzen (Wang et al., 2017). Darüber hinaus weisen sie eine hohe Lebensmittelsicherheit und eine hohe Bioverfügbarkeit auf, was sie zu potenziellen Kandidaten für die Entwicklung funktioneller Peptidarzneimittel und funktioneller Lebensmittelzusatzstoffe macht (Sarmadia und Ismaila, 2010).

Nach Schätzungen der Weltgesundheitsorganisation ist CVD für die Sterblichkeit von mehr als 17,5 Millionen Menschen pro Jahr verantwortlich. Unter den wichtigen Merkmalen von CVD ist Bluthochdruck ein wesentliches Ziel für die Prävention und Behandlung von CVD (Celermajer et al., 2012). Die derzeit verwendeten blutdrucksenkenden Medikamente wie Captopril und Enalapril sind aufgrund von Nebenwirkungen wie Husten, Hautausschlag und Kopfschmerzen nur begrenzt einsetzbar (Yu et al., 2018). Die immer häufiger auftretenden Fälle von Herz-Kreislauf-Erkrankungen erfordern jedoch neue und sichere Alternativen wie aktive Peptide aus der Nahrung. In letzter Zeit wurden erhebliche Fortschritte bei der Identifizierung und dem Screening von Lebensmittelbestandteilen erzielt, die sich positiv auf die kardiovaskuläre Gesundheit auswirken (Martinez-Maqueda et al., 2012; Liu et al., 2018). Unter diesen Verbindungen haben Peptide aufgrund ihrer blutdrucksenkenden Wirkung besondere Aufmerksamkeit erlangt. Bisher wurde die blutdrucksenkende Wirkung von Peptiden in vitro in erster Linie durch die Messung der hemmenden Wirkung von Angiotensin Converting Enzyme (ACE) bestimmt, einer Dipeptidyl-Carboxypeptidase, die an der Zellmembran lokalisiert ist und durch die Störung des Gleichgewichts zwischen den beiden Hormonsystemen, die den Blutdruck und den Flüssigkeitshaushalt regulieren, große Schäden verursachen kann (Clayton et al., 2015; Gebre et al., 2018). Darüber hinaus wurde bestätigt, dass aus Lebensmitteln gewonnene blutdrucksenkende Peptide eine blutdrucksenkende Wirkung auf Bluthochdruckpatienten ausüben, ohne toxisch zu sein oder Nebenwirkungen zu haben (Martinez-Maqueda et al., 2012). Die Abtrennung und Reinigung von blutdrucksenkenden Peptiden aus Nahrungsproteinen würde eine neue Richtung für die Entwicklung natürlicher blutdrucksenkender Medikamente eröffnen.

Ginkgo biloba-Samen wurden aufgrund ihrer bemerkenswerten biologischen Aktivität und pharmakologischen Wirkung weltweit umfassend untersucht. Ginkgo-Samen haben als traditionelle chinesische Medizin eine mehr als 600 Jahre alte Geschichte, aber es ist wenig über ihre wichtigsten aktiven Bestandteile bekannt. Nur wenige Studien berichteten über die antioxidative, ermüdungshemmende und bakteriostatische Wirkung von G. biloba-Samen-Proteinisolat (Lena und Philip, 2002; Huang et al., 2010). Wu et al. (2013) hydrolysierten Ginkgo-Peptide mit Alcalase und Pepsin, um zwei antioxidative Peptide zu erhalten, die in der Lage sind, freie Radikale abzufangen und die Lipidperoxidation zu hemmen. Die blutdrucksenkenden Ginkgo-Peptide müssen jedoch noch weiter erforscht werden, um die ihnen zugrundeliegenden Mechanismen für eine höhere Wirkung zu entschlüsseln.

In diesem Projekt haben wir vier Arten von Proteasen zur Hydrolyse von GPI verwendet, um eines der Hydrolysate mit hoher ACE-hemmender Aktivität auszuwählen und eine Ultrafiltration durchzuführen, um Komponenten mit unterschiedlichen MWs zu erhalten. Die Auswirkungen der MWs auf die ACE-hemmende Aktivität der GPHs wurden untersucht. Außerdem wurde die Beziehung zwischen der Aminosäurezusammensetzung und der Peptidaktivität ermittelt. Die neu extrahierten ACE-hemmenden Peptide wurden gereinigt, identifiziert und synthetisiert; ihre IC50-Werte wurden getestet und die Peptidhemmungsmuster durch Lineweaver-Burk-Plots untersucht. Außerdem wurde der Mechanismus der ACE-Hemmung durch eine molekulare Docking-Analyse aufgeklärt.

Materialien und Methoden

Materialien

Die Samen von G. biloba L. wurden in der Stadt Linyi in der Provinz Shandong, China, gekauft. Die Samen wurden geschält, geschält und für weitere Experimente verwendet. Angiotensin I-umwandelndes Enzym und Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucin (HHL), Hippursäure wurden von Sigma (St. Louis, MO, Vereinigte Staaten) bzw. Yuanye Bio-Technology (Shanghai, China) erworben. Captopril wurde von MedChem Express (NJ, USA) bezogen.

Zubereitung von GPI

Die Samen von G. biloba L. wurden bei 45°C getrocknet, dann zu Pulver zerkleinert und durch 80 Mesh gesiebt. Das Pulver wurde nach der Entphenolisierung und Entfettung gefriergetrocknet. Das so entstandene G. biloba-Samenpulver wurde in DW (1:20, w/v; pH 10,0) aufgelöst. Die obige Suspension wurde 12 Stunden lang gerührt und extrahiert und anschließend 30 Minuten lang bei 10.000 g zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde auf den isoelektrischen Punkt des Ginkgo-Proteins mit einem pH-Wert von 4,62 eingestellt und 60 Minuten lang inkubiert, gefolgt von einer weiteren Zentrifugation bei 10.000 g für 30 Minuten. Das erhaltene Präzipitat wurde mit destilliertem Wasser resuspendiert und die Lösung auf pH 7 eingestellt. Anschließend wurden die erhaltenen GPI bis zur nächsten Verwendung gefriergetrocknet.

Zubereitung von Ginkgo-Protein-Hydrolysaten (GPHs)

Zu diesem Zweck wurde eine 4%ige GPI-Lösung hergestellt und 5 h lang mit vier Proteasen bei ihren optimalen Hydrolysebedingungen getrennt hydrolysiert. Die Enzymdosierungen betrugen 2.000 U. Nach der Hydrolyse wurden die Enzyme bei 90°C für 10 min inaktiviert und die Lösung wurde bei 3.000 g für 30 min zentrifugiert, um die einzelnen Überstände der vier Enzyme zu erhalten.

Hydrolysegrad

Der Hydrolysegrad (DH) wurde nach der Methode von Kimatu et al. (2017) wie folgt:

wobei B die Menge (mL) an NaOH darstellte, die hinzugefügt wurde, um den pH-Wert während des Hydrolyseprozesses konstant zu halten; Nb war die molare Konzentration der NaOH-Lösung; MP war die Masse (g) des Proteins; α bezeichnete den durchschnittlichen Dissoziationsgrad in Proteinsubstraten während der Hydrolyse; htot war die Gesamtzahl der Peptidbindungen im Protein.

Isolierung und Aufreinigung des ACE-hemmenden Peptids

Die Ultrafiltration der Probe wurde mit einem MSC300 Becher-Ultrafilter (MoSu, Shanghai, China) durchgeführt. Die Probe wurde über die Zufuhröffnung zugegeben und die Stickstoffflasche wurde an den Schlauchanschluss des Ultrafiltrationsbechers angeschlossen. Danach wurde der Ultrafiltrationsbecher auf den Magnetrührer gesetzt und mit der Stickstoffflasche verbunden, wobei der Druck nicht mehr als 0,22 MPa betrug. Die Proben wurden nacheinander durch Ultrafiltrationsmembranen mit 1, 3, 5 und 10 kDa geleitet, und es wurden vier Komponenten erhalten (<1, 1-3, 3-5 und 5-10 kDa). Die vier Fraktionen wurden gesammelt, gefriergetrocknet und dann zur Prüfung der ACE-hemmenden Aktivität verwendet. Die Komponenten mit höherer ACE-Aktivität wurden für die weitere Aufreinigung gemäß dem von Zheng et al. (2017) beschriebenen Verfahren ausgewählt. Das nach der Ultrafiltration erhaltene gefriergetrocknete Hydrolysat (200 mg) wurde in gereinigtem Wasser resuspendiert, um eine Endkonzentration von 50 mg/mL zu erhalten, und einer weiteren Reinigung mit einer Sephadex G-15-Gelfiltrationssäule (1,5 cm × 60 cm) unterzogen. Die Proben wurden mit einer Mikrofiltrationsmembran filtriert, und die Elution erfolgte mit destilliertem Wasser bei einer Durchflussrate von 1 mL/min. Die Probe wurde bei einer Wellenlänge von 220 nm mit der semipräparativen HPLC P270 (Aixin, Guangzhou, China) überwacht und getrennt. Die Fraktionen (jeweils 7,5 mL) wurden gesammelt und gefriergetrocknet.

Bestimmung der ACE-hemmenden Aktivität

Dieser Test wurde gemäß den Beschreibungen in dem früheren Bericht von O’Loughlin et al. (2014) mit einigen Änderungen durchgeführt. Kurz gesagt, das Substrat Hippuryl-Histidyl-Leucin (HHL, 5 mM) und die Proben wurden in 0,1 M Na2 (pH 8,3) mit 0,3 M Natriumchlorid gemischt. Anschließend wurden 50 μl der Probe und 150 μl des Substrats in ein Zentrifugenröhrchen gegeben, gemischt und 5 Minuten lang in Wasser bei 37 °C stehen gelassen. Anschließend wurde die ACE-Lösung (50 mU/mL) zugegeben und 45 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 250 μl 1M HCl beendet und die Lösung wurde durch einen 0,45 μM Nylon-Spritzenfilter filtriert, bevor sie mittels RP-HPLC (Waters, Milford, MA, USA) auf einem Inertsil ODS-3 (250 × 4,6 mm, 5 μm Partikelgröße) analysiert wurde. Die mobile Phase bestand aus destilliertem Wasser: Acetonitril = 75:25 (V/V, mit 0,1 % TFA) mit einer Flussrate von 0,5 ml/min und einer Detektion bei 228 nm. Captopril wurde als Kontrolle verwendet und die hemmende Aktivität (%) wurde wie folgt bestimmt:

wobei A die Peakfläche von Hippursäure mit der Probe, B ohne die Probe war.

LC-MS/MS-Analyse und Identifizierung der gereinigten Peptidsequenzen

Die gereinigten Proben wurden mit Q Exactive (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) unter Verwendung eines Easy-nLC 1000 (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) analysiert. Die Probe wurde entsalzt und lyophilisiert, in 0,1%iger FA-Lösung rekonstituiert und bis zur nächsten Verwendung bei -20°C gelagert. Die beiden mobilen Phasen waren wie folgt: Die mobile Phase A bestand aus einer wässrigen Lösung von 0,1 % Ameisensäure, und die mobile Phase B war eine wässrige Lösung von Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure (Acetonitril 84 %). Nach der Äquilibrierung der Säule mit 95% der A-Lösung wurde die Probe vom Autosampler auf die Trap-Säule geladen. Das Masse-Ladungs-Verhältnis der Peptidfragmente wurde wie folgt ermittelt: Nach jedem vollständigen Scan wurden insgesamt 20 Fragmentmuster erfasst. Die Rohdatei des Massenspektrometrietests wurde mit der Software Mascot 2.2 nach der entsprechenden Datenbank durchsucht.

Peptidsynthese

Die durch LC-MS/MS identifizierten potenziellen ACE-Hemmerpeptide wurden bei GL Biochem (Shanghai, China) synthetisiert. Die Reinheit der synthetischen Peptide wurde durch HPLC bestätigt und betrug mehr als 95 %.

Kinetik der ACE-Hemmung

Das kinetische Hemmungsmodell des G. biloba-Peptids wurde nach der Methode von Lin et al. (2017) getestet. Kurz gesagt, wurden verschiedene Konzentrationen des Substrats HHL (0,5, 1, 2 und 5 mM) mit ACE reagieren gelassen. Das Lineweaver-Burk-Diagramm basiert auf dem Kehrwert der Reaktionsgeschwindigkeit (1/v) und der Substratkonzentration (1/). Die Schnittpunkte auf der X- und Y-Achse stellten die Kehrwerte von Km bzw. Vmax dar.

Docking-Analyse

Dazu wurde die dreidimensionale Strukturdatei des ACE-Proteins (PDB ID: 1O8A) aus der RCSB Protein Data Bank (PDB1) heruntergeladen. Die dreidimensionale Struktur der Peptide von G. biloba wurde mit der Molekularsimulationssoftware Discovery Studio 3.5 gezeichnet. Das Hydroprocessing wurde durchgeführt, und die Energie wurde mit dem Programm CHARMM minimiert. Darüber hinaus wurde Zn2+ im ACE-Modell beibehalten. Die Software DS 3.5 bewertete die Docking-Ergebnisse nach ihrer eigenen Bewertungsfunktion, die auf den Punktzahlen und der kombinierten freien Energie der einzelnen Ergebnisse basierte. Unter allen Ergebnissen wurde das am besten passende Ergebnis ausgewählt.

Statistische Analyse

Einfache ANOVA, gefolgt von Duncan’s Multiple-Range-Tests unter Verwendung von SPSS Statistics 20.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, Vereinigte Staaten) wurde für die Datenanalyse mit einem Signifikanzunterschied (P ≤ 0,05) verwendet.

Ergebnisse

DH und ACE hemmende Aktivität von GPHs

Wie aus Abbildung 1A ersichtlich ist, wurde die DH mit der Zeit während des gesamten Hydrolyseprozesses verlängert. Vor dem 2-Stunden-Intervall stieg die DH schnell an, danach verlangsamte sich die Anstiegsrate allmählich mit der Zeit. Im Allgemeinen war die Hydrolysegeschwindigkeit in den ersten 1 Stunden hoch, danach verringerte sie sich oder wurde konstant. Von den vier Proteasen wies Alcalase die höchste DH auf, die nach 5 Stunden 14,7 % erreichte, gefolgt von Trypsin (8,91 %) und Dispase (6,91 %). Die niedrigste DH wurde für Flavourzyme beobachtet, die nach 5 Stunden nur 3,23% betrug. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass GPI von den Proteasen an verschiedenen Stellen gespalten wurde, was zu Proteinhydrolysaten mit unterschiedlicher Peptidzusammensetzung führte.

Abbildung 1. DH und ACE hemmende Aktivität von GPHs. (A) Hydrolysegrad (DH %) von GPI, das durch Alcalase, Disase, Trypsin und Flavozym hydrolysiert wurde. Die Werte sind als Mittelwerte ± SD (n = 3) angegeben. (B) Zeitlicher Verlauf der ACE-hemmenden Aktivität der durch verschiedene Proteasen erzeugten Hydrolysate. Probenkonzentration (2 mg/ml). (C) ACE-hemmende Aktivität von GPHs und Membranfraktionen. Konzentration der Probe (1 mg/ml). (D) IC50-Werte von GPHs und Membranfraktionen. Captopril als positive Kontrolle. Mittelwert ± SD (n = 3); unterschiedliche Buchstaben in derselben Zeile weisen auf signifikante Unterschiede hin (p < 0,05).

Was die ACE-hemmende Aktivität der vier Proteasehydrolysate betrifft, so stieg die Aktivität mit DH im Laufe der Zeit an. Wie in Abbildung 1B dargestellt, betrugen die hemmenden Aktivitäten von Alkalase, Trypsin, Dispase und Flavozym nach 5 Stunden 62,70, 39,81, 48,39 bzw. 25,95 %. Aufgrund ihrer unterschiedlichen Spaltstellen wurden verschiedene Peptide mit unterschiedlichen ACE-hemmenden Aktivitäten erhalten. Unter ihnen war die Aktivität des alkalischen Hydrolysats relativ stärker, was darauf hindeutet, dass die alkalische Protease effektiv ein Hydrolysat mit höherer ACE-Hemmwirkung produzieren kann.

ACE-Hemmwirkung von GPHs und Membranfraktion

Die ACE-Hemmwirkung der GPHs und der resultierenden Fraktionen war signifikant vom MW abhängig, wie in den Abbildungen 1C und D dargestellt. Bei einer Probenkonzentration von 1 mg/ml nahm die ACE-Hemmaktivität allmählich zu, je geringer das MW der Komponenten war. Die Hemmaktivität bei 3-5 und 5-10 kDa betrug 44,94 % (IC50 = 1,257 mg/mL) bzw. 44,04 % (IC50 = 1,765 mg/mL). Anschließend nahm die Aktivität mit dem niedrigeren MW allmählich zu und erreichte das höchste Niveau (69,86%; IC50 = 0,224 mg/mL) bei <1 kDa.

Reinigung von Ginkgo-Peptiden

Alcalase wird aufgrund ihrer breiten Spezifität und starken Fähigkeit, Proteine abzubauen, häufig für die Herstellung aktiver Peptide verwendet. Bei der Ultrafiltrationsbehandlung zeigte sich, dass die ACE-hemmende Aktivität mit abnehmendem MW des Polypeptids zunahm. Daher wurde das Peptid der <1 kDa-Fraktion mit einer Sephadex G-15-Säule weiter gereinigt. Wie aus Abbildung 2A ersichtlich, wurde die Sephadex G-15 in drei Komponenten (A1, A2 und A3) aufgeteilt. Die drei Komponenten wurden gesammelt und gefriergetrocknet, und ihre ACE-hemmenden Aktivitäten wurden gemessen. Die Ergebnisse sind in Abbildung 2B dargestellt. Die ACE-hemmenden Aktivitäten der drei Komponenten (1 mg/mL) betrugen 64,08, 58,55 bzw. 74,96 %. Daher wurde die aktivste A3-Komponente für die strukturelle Identifizierung des nächsten Schritts ausgewählt.

Abbildung 2. Chromatogramme und ACE-hemmende Aktivität. (A) Reinigung aus der Fraktion <1 kDa durch Sephadex G-15 Chromatographie. (B) ACE-Hemmaktivität der einzelnen Fraktionen. Unterschiedliche Buchstaben in derselben Zeile weisen auf signifikante Unterschiede hin (p < 0,05).

Identifizierung von Ginkgo-Peptiden und Peptidsynthese

Um das potenzielle ACE-hemmende Peptid zu identifizieren, wurde die aktivste Komponente A3 mittels LC-MS/MS analysiert (ergänzende Tabelle S1). Auf dieser Grundlage wurden drei Peptide aus der Komponente A3 gescreent, deren Aminosäuresequenzen Thr-Asn-Leu-Asp-Trp-Tyr (TNLDWY), Arg-Ala-Asp-Phe-Tyr (RADFY) und Arg-Val-Phe-Asp-Gly-Ala-Val (RVFDGAV) lauteten (Abbildung 3). Die identifizierten Sequenzen dieser Peptide setzten sich aus 5-7 Aminosäureresten zusammen. Um die ACE-hemmende Aktivität dieser drei Peptidfraktionen zu ermitteln, wurden die Peptide chemisch synthetisiert. Die erhaltenen synthetisierten Peptide wurden durch Massenspektrometrie identifiziert (Abbildungen 4A-C). Die Ergebnisse zeigten, dass die IC50-Werte von TNLDWY, RADFY und RVFDGAV bei 1,932, 1,35 bzw. 1,006 mM lagen (Abbildung 4D).

Abbildung 3. Massenspektren der durch LC-MS/MS identifizierten Peptide. (A) TNLDWY, (B) RADFY, (C) RVFDGAV.

Abbildung 4. Massenspektren der synthetischen Peptide und IC50-Werte der synthetischen Peptide. (A) TNLDWY, (B) RADFY, (C) RVFDGAV, (D) IC50-Werte der synthetischen Peptide. Die Werte sind als Mittelwerte ± SD (n = 3) angegeben. Unterschiedliche Buchstaben in derselben Zeile weisen auf signifikante Unterschiede hin (p < 0,05).

Hemmmechanismus der Ginkgo-Peptide

Der Hemmungsmodus des G. biloba-Peptids wurde anhand des Lineweaver-Burk-Plots analysiert. Wie aus Abbildung 5 ersichtlich ist, änderten sich bei Zugabe des Ginkgo-Peptids TNLDWY sowohl Vmax als auch Km, wobei Vmax mit zunehmender Peptidkonzentration anstieg; wohingegen sich Km nicht signifikant mit der Peptidkonzentration änderte, was darauf hindeutet, dass es sich bei dem Hemmungsmuster um einen nichtkompetitiven Hemmungsmodus handeln könnte. Bei RADFY und RVFDGAV änderte sich Vmax nicht signifikant mit der Konzentration, während Km mit zunehmender Peptidkonzentration anstieg, was darauf hindeutet, dass beide Peptide kompetitive Inhibitoren sind, die an die aktiven Stellen von ACE binden können und somit die Bindung von ACE an das Substrat blockieren und die Aktivität von ACE hemmen.

Abbildung 5. Lineweaver-Burk-Diagramm der hemmenden Wirkung von Peptiden auf die ACE-Aktivität. (A) TNLDWY, (B) RADFY, und (C) RVFDGAV. Die ACE-Aktivitäten wurden in Abwesenheit und Anwesenheit verschiedener Konzentrationen der Peptide (0, 15 und 30 μM) bestimmt.

Molekulare Docking-Simulation zwischen Peptiden und ACE

In dieser Studie wurde die Wechselwirkung von drei Peptiden mit ACE bewertet. Die Ergebnisse zeigten, dass alle Peptide gut an ACE binden und einen stabilen Komplex bilden konnten, was auf ihre Verwendung als potenzielle ACE-Hemmer hindeutet. Der Wert der Cdocker-Interaktionsenergie ist in Tabelle 1 dargestellt. Die Werte der Fraktionen TNLDWY, RADFY und RVFDGAV betrugen 102,995, 105,335 bzw. 117,706. Die Ergebnisse des molekularen Dockings sind in Abbildung 6 und Tabelle 2 dargestellt. Die optimale Docking-Position von TNLDWY kann sechs Wasserstoffbrückenbindungen ausbilden, darunter Wasserstoffbrückenbindungen mit Ala 354, Tyr523 in der aktiven Tasche von S1, His353, His513 in der aktiven Tasche von S2 und Zn2+-Resten, und es wurde festgestellt, dass es mit allen von ihnen stabil verbunden ist. Dies könnte mit der starken ACE-hemmenden Aktivität des Peptids zusammenhängen. Aus Abbildung 6B geht hervor, dass RADFY sieben Wasserstoffbrückenbindungen mit Aminosäureresten und intermolekulare Wasserstoffbrückenbindungen mit den Resten Gln281, His353, His513 und Tyr520 in der aktiven Tasche von S2 bilden kann. Die Bildung dieser Wasserstoffbrücken stabilisierte den Enzym-Peptid-Komplex erheblich. Darüber hinaus bildete RADFY eine Ionenbindung mit Zn2+, konjugierte Kräfte mit Val380, His383, Glu384, His387, Glu411, Lys511 und Tyr523 sowie eine Van-der-Waals-Kraft mit dem Aminosäurerest Trp356. Diese Wechselwirkungen können zu einer Verformung des Zn2+-Liganden und zur Inaktivierung von ACE führen. Im Vergleich zu TNLDWY und RADFY kann RVFDGAV vier Wasserstoffbrückenbindungen mit Aminosäureresten ausbilden, die stabil mit ALA354, TYR523 in der aktiven Tasche von S1 und Glu162 in der aktiven Tasche von S1′ verbunden waren. RVFDGAV konnte jedoch ionische Bindungen mit Zn2+ bilden, was direkt zur Deaktivierung von ACE-Molekülen führte. Außerdem bildete es ein Konjugat mit den Aminosäureresten wie Glu162, His353, Glu376, Val379, His387, Phe391, His410, Phe457 und Phe527 (Abbildung 6C).

Tabelle 1. Computermodellierungs-Energiewerte und Interaktionsergebnisse der bestplatzierten Posen der angedockten Peptide und ACE (PDB: 1O8A).

Abbildung 6

Abbildung 6. Die molekularen Docking-Simulationen von TNLDWY, RADFY und RVFDGAV mit ACE (PDB: 1O8A). (A) Allgemeiner Überblick, lokaler Überblick und 2D-Diagramm der Docking-Position des Peptids TNLDWY; (B) Allgemeiner Überblick, lokaler Überblick und 2D-Diagramm der Docking-Position des Peptids RADFY; (C) Allgemeiner Überblick, lokaler Überblick und 2D-Diagramm der Docking-Position des Peptids RVFDGAV.

Tabelle 2. ACE-Reste in Koordination mit Zn2+ und Aminosäuren des S1-, S2- und S1′-Aktivzentrums, die an der Interaktion mit ausgewählten Peptiden nach der molekularen Docking-Simulation beteiligt sind.

Diskussion

In den letzten Jahren haben aus Lebensmitteln gewonnene ACE-hemmende Peptide aus Pflanzenprotein aufgrund ihrer geringeren Nebenwirkungen immer mehr Aufmerksamkeit erregt. In dieser Studie wurden Alcalase, Disase, Trypsin und Flavourzyme zur Hydrolyse von Ginkgo-Protein verwendet. Die DH- und ACE-hemmende Aktivität des Ginkgo-Proteinhydrolysats, das durch die Hydrolyse von Alkalase gewonnen wurde, war die höchste. Der Hydrolyseprozess verlief in der Anfangsphase schnell, was zur Hydrolyse vieler Peptidbindungen führte, danach verlangsamte sich die Hydrolysegeschwindigkeit aufgrund der allmählichen Verringerung der für die Hydrolyse verfügbaren Substrate (Ketnawa et al., 2017; Hu et al., 2018; Wei et al., 2018). Diese Ergebnisse standen im Einklang mit einem früheren Bericht über Rapsproteinhydrolysate mit wirksamer ACE-Hemmwirkung, wenn sie mit Alcalase hydrolysiert wurden (He et al., 2013).

Angiotensin Converting Enzyme ist eine multifunktionelle extrazelluläre Dipeptidase, die in verschiedenen Geweben vorkommt. Die hemmende Aktivität von ACE senkt den Blutdruck, indem sie die Produktion von Angiotensin II reduziert und die Zerstörung von Kininen verringert (Zheng et al., 2017). Die ACE-hemmende Aktivität des Hydrolysats wurde mit der Molekulargewichtsverteilung in Verbindung gebracht. Die Ultrafiltration wurde verwendet, um das Ginkgo-Hydrolysat in fünf Komponenten zu trennen. Beim Molekulargewicht <1 kDa war die ACE-hemmende Aktivität des Ginkgo-Hydrolysats am höchsten. Diese Beobachtung steht im Einklang mit früheren Studien, in denen eine höhere ACE-Aktivität von Polypeptiden mit niedrigem Molekulargewicht festgestellt wurde (Wang et al., 2015; Ola et al., 2017). Darüber hinaus bestätigten Silvestre et al. (2012), dass die Ultrafiltrationsbehandlung Peptide (AAA) an der C-terminalen Position zurückhalten kann, um die ACE-hemmende Aktivität zu fördern.

Um das hochaktive ACE-hemmende Peptid weiter zu reinigen, wurde die Ginkgo-Komponente (<1 kDa) durch Gelfiltrationschromatographie abgetrennt, und die Aminosäuresequenz wurde mittels LC-MS/MS identifiziert. So wurden drei neue ACE-hemmende Peptide gewonnen: TNLDWY (1,932 mM), RADFY (1,35 mM) und RVFDGAV (1,006 mM), die eine starke ACE-hemmende Wirkung zeigten. Laut dem Bericht von Hernández-Ledesma et al. (2011) handelte es sich bei den meisten ACE-hemmenden Peptiden um kurze Sequenzen, die aus 2-12 Aminosäuren bestanden. Darüber hinaus hing die Aktivität des ACE-hemmenden Peptids stark mit dem Vorhandensein seiner C-terminalen Aminosäure, einer aromatischen Aminosäure und einer hydrophoben Aminosäure zusammen. So verstärkte beispielsweise das Vorhandensein der aromatischen Aminosäure (Tyr, Phe und Trp) die Aktivität des ACE-hemmenden Peptids erheblich. Darüber hinaus ist auch bekannt, dass Arg eine wichtige Rolle im hemmenden Peptid spielt. Toopcham et al. (2017) zeigten, dass die hemmende Aktivität des Polypeptids nach Entfernung von Arg signifikant reduziert wurde. Darüber hinaus wiesen Liu et al. (2018) nach, dass eine Aminosäure wie Leu im Peptid die ACE-Hemmaktivität unabhängig von ihrer Position am C-Terminus oder am N-Terminus signifikant beeinflusst. Ähnliche Ergebnisse wurden auch von Lee und Hur (2017) berichtet. Diese Studien berichteten, dass die Peptide KPLL, VLAQYK und DLP aus verschiedenen Proteinmaterialien in Gegenwart einer hydrophoben Aminosäure (Leu) eine nennenswerte ACE-hemmende Aktivität aufweisen. In unserer Studie befand sich Tyr am C-Terminus von TNLDWY und RADFY. Darüber hinaus enthielten die beiden Peptide von RADFY und RVFDGAV Arg am N-Terminus, und der Gehalt an hydrophoben Aminosäuren war in den drei Peptiden höher. Vor allem die Peptidfragmente entsprachen den strukturellen Merkmalen von ACE-hemmenden Peptiden.

Die Art der Hemmung von ACE-hemmenden Peptiden wurde im Allgemeinen als nichtkompetitiv, kompetitiv und gemischt beobachtet. Bei kurzen Peptiden (2-12 Aminosäuren) waren die meisten von ihnen kompetitive Inhibitoren, die sich an das ACE-Enzym anlagerten, um die Bindung des Substrats HHL zu verhindern. Eine ähnliche Studie von Lin et al. (2017) zeigte, dass die Peptide KYIPIQ und LPLPLL aus Qula-Casein einen kompetitiven Hemmungsmodus aufweisen. Bei nicht-kompetitiven Inhibitoren binden sie jedoch an andere Stellen als die Substratbindungsstelle des Enzyms und beeinträchtigen letztlich die Bindung des Substrats an das Enzym. Ähnliche Muster wurden bei lebensmittelbedingten hemmenden Peptiden wie PFPGPIPN aus Qula-Casein und dem Haselnusspeptid YLVR beobachtet (Lin et al., 2017; Liu et al., 2018). In diesem kompetitiven Modus bildeten ACE, Substrat und Peptid einen Enzym-Substrat-Hemmstoff-Komplex, der die weitere Freisetzung des Produkts verhinderte und zu einer Abnahme der Vmax führte (Barbana und Boye, 2011).

Die Untersuchung des molekularen Interaktionsmechanismus zwischen ACE und hemmenden Peptiden ist hilfreich für das Screening und die Entwicklung neuer ACE-hemmender Peptide. Es liegen jedoch nur unzureichende Informationen über die molekularen Wechselwirkungen von hemmenden Peptiden vor. Das molekulare Docking basiert auf dem „Schlüssel-Schloss-Prinzip“ von Liganden und Rezeptoren und simuliert die Interaktion zwischen kleinen Molekülliganden und Rezeptor-Biomakromolekülen. Die Art der Bindung und die Affinität zwischen ihnen ermöglicht das virtuelle Screening von Arzneimitteln. ACE ist ein Zn2+-abhängiges Carboxydipeptid-Enzym, bei dem Zn2+ ein wichtiger Bestandteil des aktiven Zentrums von ACE ist (Pina und Roque, 2009). Nach den zuvor berichteten Daten (Pan et al., 2012) wurden die wichtigsten Interaktionsreste im aktiven Zentrum von ACE in drei aktive Taschen (S1, S2 und S1′) unterteilt. S1 (Ala354, Glu384 und Tyr523); S2 (Gln281, His353, Lys511, His513 und Tyr520); und S1′ (Glu162-Rest). Am aktiven Zentrum von ACE bildeten zwei Histidine (His383 und His387) zusammen mit Glu 411 einen Zn2+-Liganden. Es wurde berichtet, dass die Hemmung der Peptid-induzierten ACE-Aktivität durch die Kombination von wasserstoffbrückenstabilen Enzym-Peptid-Komplexen erreicht werden kann (Fu et al., 2017). Darüber hinaus kann die Bildung von Van-der-Waals-Kräften mit Aminosäureresten wie His353, Ala 354, Ser355, Glu384, His513 und Pro519, die konjugierte Wechselwirkung mit Tyr360 und nicht-kovalente Wechselwirkungen mit Glu384, Arg522 ebenfalls zur Stabilität von Enzym-Peptid-Komplexen beitragen. Das Vorhandensein dieser Kräfte macht die Struktur des Enzym-Peptid-Komplexes stabiler und begünstigt die Hemmung der ACE-Aktivität, was der Grund für die starke ACE-hemmende Aktivität von TNLDWY, RADFY und RVFDGAV sein könnte.

Schlussfolgerung

In dieser Studie wurden die Samen von G. biloba zur Herstellung potenzieller ACE-hemmender Peptide verwendet. Die aus verschiedenen Proteasen hergestellten GPHs zeigten in vitro unterschiedliche ACE-hemmende Aktivität. Die höchsten DH- und In-vitro-ACE-Hemmaktivitäten wurden bei GPHs beobachtet, die aus Alkalase hergestellt wurden. Bei den durch Ultrafiltration mit Alkalase gewonnenen Komponenten zeigte sich, dass die Peptide mit kleinerem Molekulargewicht eine stärkere ACE-hemmende Wirkung hatten. Drei potenziell ACE-hemmende Peptide (TNLDWY, RADFY und RVFDGAV) wurden aus der Peptidfraktion (<1 kDa) durch LC-MS/MS gewonnen. RVFDGAV zeigte die höchste ACE-hemmende Aktivität mit einem IC50-Wert von 1,006 mM und erwies sich als kompetitiver Inhibitor. Die Ergebnisse des molekularen Dockings zeigten, dass die Peptide fest an ACE binden konnten und darüber hinaus mit Aminosäureresten am aktiven Zentrum von ACE interagierten. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die durch enzymatische Hydrolyse von Alkalase gewonnenen Peptide in vitro eine wirksame ACE-Hemmaktivität aufweisen, was sie zu potenziellen Kandidaten für die Entwicklung von funktionellen Lebensmitteln oder blutdrucksenkenden Medikamenten in der Zukunft macht.

Beiträge der Autoren

F-FM, HW, C-KW und KT waren an der Projektplanung beteiligt, führten die meisten Experimente durch und verfassten das Manuskript. Z-JW und LJ waren an der Versuchsplanung, der Vorbereitung des Manuskripts und der Einreichung beteiligt. Alle Autoren waren an der Abfassung des Manuskripts beteiligt und/oder überarbeiteten es kritisch auf wichtige intellektuelle Inhalte.

Finanzierung

Diese Studie wurde von den Großprojekten für Wissenschaft und Technologie in der Provinz Anhui (17030701024, 17030701058 und 17030701028) und dem Schlüsselprojekt für Forschung und Entwicklung der Provinz Anhui (1704g07020110 und 1804b06020347) unterstützt.

Erklärung zu Interessenkonflikten

HW war bei Anhui Habopharmqnceutical Co, Ltd. Z-JW war bei Anhui Qiangwang Seasoning Food Co., Ltd. angestellt.

Die übrigen Autoren erklären, dass die Forschung in Abwesenheit jeglicher kommerzieller oder finanzieller Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Ergänzendes Material

Das ergänzende Material zu diesem Artikel finden Sie online unter: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2018.01579/full#supplementary-material

Fußnoten

1. ^ http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do