Inhibitor of Apoptosis Proteins: Translating Basic Knowledge into Clinical Practice

Die Familie der Caspase-Inhibitoren (Inhibitor of Apoptosis Proteins)

Die IAPs sind eine Familie von Caspase-Inhibitoren, die spezifisch die Caspasen 3, 7 und 9 hemmen und dadurch die Apoptose verhindern. Crook et al. (17) identifizierten das erste Mitglied der IAP-Familie zufällig bei der Untersuchung der durch vAcAnh induzierten Apoptose in SF21-Baculoviruszellen. Bei einem Screening nach Baculovirus-Genen, die die Wirkung von p35 nachahmen und die vAcAnh-induzierte Apoptose hemmen, identifizierten sie ein neues 1,6-kb-Gen, das für ein antiapoptotisches 31-kDa-Protein mit einem zinkfingerähnlichen Motiv kodiert (17). In nachfolgenden Studien wurden IAPs in verschiedenen Spezies identifiziert und festgestellt, dass IAPs die Apoptose hemmen, indem sie Caspasen blockieren (Übersicht in Ref. 18).

Die Inhibitor of Apoptosis Protein Familie

Bis heute wurden acht menschliche IAP-Familienmitglieder identifiziert (Abb. 2)⇓, und IAP-Homologe wurden auch in Insekten und Hefe beschrieben. IAP-Proteine werden aufgrund des Vorhandenseins von ein bis drei Baculovirus-IAP-Repeat-Domänen (BIR), einer zinkbindenden Region von ∼70 Aminosäuren, in diese Familie eingeteilt. Obwohl die BIR-Domäne für die Zugehörigkeit zur IAP-Familie erforderlich ist, scheinen nicht alle BIR-haltigen Proteine antiapoptotische Funktionen zu haben (19, 20, 21, 22), so dass das Vorhandensein einer BIR-Domäne zwar notwendig, aber nicht ausreichend für die Aufnahme in diese Proteinfamilie ist. IAP-Proteine können auch eine RING-Domäne oder eine Caspase-Aktivierungs-Rekrutierungs-Domäne (CARD) enthalten (siehe Ref. 18). Die IAP-Proteine wurden anhand des Vorhandenseins oder Fehlens eines RING-Fingers und der Homologie ihrer BIR-Domänen in drei Klassen (Klassen 1, 2 und 3) unterteilt (23).

Klasse 1 Inhibitor of Apoptosis Proteins.

Klasse 1 IAPs enthalten homologe BIR-Domänen und ein RING-Finger-Motiv. Das X-linked IAP hat drei BIR-Domänen und einen RING-Finger. Es war das erste IAP dieser Klasse, das identifiziert wurde, und ist nach wie vor das am besten charakterisierte. Duckett et al. (24) entdeckten XIAP 1996 bei der Suche nach Säugetiergenen, die homolog zum Baculovirus-IAP sind. Es bindet und hemmt die Caspasen 3, 7 und 9 mit nanomolarer Affinität, aber es bindet oder hemmt die Caspase 8 nicht (25, 26). cIAP1 (auch bekannt als MIHB, hiap2 und BIRC2) und cIAP2 (auch bekannt als MIHC, hiap2 und BIRC3) sind strukturell mit XIAP verwandt und besitzen drei BIR-Domänen und einen RING-Finger. Diese IAPs wurden durch die biochemische Reinigung von Proteinen identifiziert, die mit dem Todesrezeptor TNF-R2 assoziiert sind, aber ihre Rolle an diesem Rezeptor bleibt unklar (27). cIAP1 und cIAP2 werden in den meisten menschlichen Geweben exprimiert, wobei die Expression von cIAP1 in Thymus, Hoden und Eierstöcken am höchsten ist und die von cIAP2 in Milz und Thymus (27). cIAP1 und cIAP2 binden und hemmen Caspase 3 und 7, wenn auch weniger stark als XIAP (25). Sie hemmen nicht die Caspasen 1, 6 und 8. ML-IAP (auch bekannt als Livin, KIAP und BIRC7) und ILP-2 haben einen RING-Finger und nur eine BIR-Domäne, aber ihre BIR-Domäne ist am homologsten zu der BIR3-Domäne von XIAP, cIAP1 und cIAP2 (daher ihre Aufnahme in diese Klasse). ML-IAP wird in normaler fötaler Leber, Niere und erwachsenen Hoden und Thymus sowie in Melanom- und Lymphomzelllinien exprimiert. ML-IAP hemmt die Caspasen 3 und 9 mit einer ähnlichen Affinität wie cIAP1, bindet oder hemmt aber nicht die Caspasen 1, 2, 6 oder 8 (28). Die Expression von ILP-2 ist normalerweise auf den erwachsenen Hoden beschränkt, wurde aber auch in einer lymphoblastoiden Zelllinie nachgewiesen. ILP-2 hemmt die Caspase 9, aber nicht die Caspasen 3, 7 oder 8 (29). Es bleibt zu klären, ob die unterschiedliche Affinität der verschiedenen IAPs für Caspasen mit ihren endogenen intrazellulären Funktionen zusammenhängt.

Inhibitor of Apoptosis Proteins der Klasse 2.

Das IAP-Familienmitglied der Klasse 2, NAIP, hat drei BIR-Domänen, aber kein RING-Finger-Motiv. Seine BIR-Domänen sind entfernter mit den BIR-Domänen der Klasse-1-IAPs verwandt. NAIP wurde 1995 von Roy et al. (30) identifiziert, als sie auf der Suche nach dem Gen auf 5q13 waren, das für spinale Muskelatrophien bei Kindern verantwortlich ist. NAIP wird in der Leber, der Plazenta und dem zentralen Nervensystem von Erwachsenen exprimiert. Es hemmt die Caspasen 3 und 7, aber nicht die Caspasen 1, 4, 5 oder 8 (31).

Inhibitor der Apoptose-Proteine der Klasse 3.

IAP-Mitglieder der Klasse 3, wie Survivin, enthalten nur eine einzige BIR-Domäne und keinen RING-Finger. Survivin wird in der fötalen Leber, der Niere, der Lunge und dem Magen-Darm-Trakt exprimiert, aber nicht in den meisten normalen Geweben von Erwachsenen (32). Die bevorzugte Expression von Survivin in fötalem Gewebe lässt vermuten, dass es eine Rolle in der Entwicklung spielt. Survivin wird häufig in einer Reihe von bösartigen Erkrankungen überexprimiert, darunter Adenokarzinome der Lunge, der Bauchspeicheldrüse, des Dickdarms, der Brust und der Prostata (32, 33, 34, 35, 36).

Die unterschiedliche Expression in normalen und bösartigen Zellen kann für therapeutische Zwecke genutzt werden. Zum Beispiel könnte der Survivin-Promotor als tumorspezifischer Promotor verwendet werden, bei dem ein gewünschtes Gen in bösartigen Zellen, nicht aber in normalen Zellen aktiviert wird. Dieses transkriptionelle Targeting könnte für die Gentherapie von Krebs von Nutzen sein (37). Alternativ könnte die Expression von Survivin als Tumormarker für die frühzeitige Erkennung von Malignität verwendet werden, wie weiter unten ausführlich erörtert wird.

Inhibitor of Apoptosis Proteins Inhibit Active Caspases

Die Hemmung von Caspasen ist der am besten verstandene Mechanismus, durch den IAPs die Apoptose verhindern. In enzymatischen Reaktionen hemmt rekombinantes XIAP die Caspase 3, 7 und 9, aber nicht die Caspase 8. In vitro verhindert die Überexpression von XIAP in 293T-Zellen die BAX- und FAS-induzierte Spaltung von Procaspase 3 und die Apoptose (38). Die Wirkung von XIAP auf die Caspase-Aktivierung wurde seinen BIR-Domänen zugeordnet, wobei die BIR2-Domäne die Caspasen 3 und 7 und die BIR3-RING-Domäne die Caspase 9 hemmt.

Strukturelle Grundlage der Caspase-Inhibition durch X-Linked Inhibitor of Apoptosis Protein.

Angesichts der zellulären und enzymatischen Daten, die darauf hinweisen, dass IAPs Caspasen hemmen, wurden Anstrengungen unternommen, die physikalischen Interaktionen zwischen IAPs und Caspasen zu erforschen. Die meisten Studien haben sich auf XIAP konzentriert, da es in rekombinanter Form hergestellt und kristallisiert werden kann. XIAP hemmt die Caspasen 3 und 7 sowie die Caspase 9 über separate Domänen. Seine BIR2-Domäne (Aminosäuren 163-240) mit ihrer NH2-terminalen Verlängerung (Aminosäuren 124-162) hemmt die Caspasen 3 und 7, während seine BIR3-Domäne (Aminosäuren 241-356) die Caspase 9 hemmt (39). Diese Studien bildeten die Grundlage für die Entwicklung von IAP-Inhibitoren, die auf die Caspase-bindenden Taschen des Moleküls abzielen.

BIR2-Domäne hemmt X-Linked Inhibitor of Apoptosis Protein.

Ein „Haken, Leine und Senker“-Modell wurde vorgeschlagen, um zu erklären, wie XIAP die Caspase 3 hemmt (Abb. 3)⇓. Der „Haken“ (Reste 138-146 des NH2-Terminus) hemmt die Caspase 3, indem er sich quer über das aktive Zentrum der Caspase legt und dadurch die Substratbindetasche der aktiven Caspase 3 blockiert. Die „Linie“ stellt zwei Peptidbindungen an Val147 dar, die den Haken mit dem Senker verbinden. Der „Sinker“ (Reste 148-150) stabilisiert die Interaktion zwischen XIAP und Caspase 3 (40). In diesem Modell hemmt XIAP Caspase 3 durch sterische Hinderung. Als solches hemmt es die Caspasen 3 und 7 durch einen Mechanismus, der sich von Peptidyl-Caspase-Inhibitoren wie Benzyloxycarbonyl-VAD-Fluormethylketon unterscheidet, die mit dem Caspasesubstrat um die Bindungstasche konkurrieren.

BIR3-Domäne hemmt X-Linked Inhibitor of Apoptosis Protein.

In frühen Studien wurde festgestellt, dass die BIR3-Domäne von XIAP die Caspase 9 hemmen kann (26, 41), aber erst kürzlich wurde der Mechanismus aufgeklärt. Die BIR3-Domäne von XIAP bildet ein Heterodimer mit monomerer Caspase 9 und verhindert so die Dimerisierung und Aktivierung von Caspase 9. Sie fängt Caspase 9 nicht nur in einer monomeren Form ein, sondern hält auch die aktive Stelle von Caspase 9 in einer inaktiven Konformation (42). Daher ist es interessant, dass XIAP die Caspase 9 hemmt, ohne die aktive Stelle physisch zu berühren.

In Erweiterung der Strukturstudien wurden die Auswirkungen von Mutationen in den BIR-Domänen auf die antiapoptotischen Wirkungen von XIAP untersucht. Mutationen, die die NH2-terminale Verlängerung von BIR2 betreffen (z.B. D148A), heben die schützende Rolle von XIAP bei der Verhinderung von Fas-Ligand (ein Stimulus des extrinsischen Weges der Caspase-Aktivierung) oder Bax-induzierter Apoptose (ein Stimulus des intrinsischen Weges der Caspase-Aktivierung) auf. Im Gegensatz dazu verringern Mutationen, die die BIR3-Domäne betreffen (z. B. W310A), die XIAP-vermittelte Hemmung der durch BAX, aber nicht durch CD95 induzierten Apoptose (43). Somit unterstützen diese Mutationen die Strukturstudien, die zeigen, dass die BIR2-Domäne für die Hemmung von Caspase 3 erforderlich ist und dass die BIR3-Domäne Caspase 9 hemmt.

Survivin.

Während XIAP die Caspasen 3, 7 und 9 durch direkte Interaktionen hemmt, ist der Mechanismus, durch den Survivin Caspasen hemmt, weniger klar. Einigen Studien zufolge (44, 45) bindet und hemmt Survivin die aktiven Caspasen 3 und 7, aber nicht die Caspase 8. Andere Studien (46) hingegen konnten keine Interaktion von Survivin mit Caspase 3 feststellen. In einer Studie von Marusawa et al. (47) wurde berichtet, dass Survivin die rekombinanten Caspasen 3, 7 oder 9 in enzymatischen Reaktionen oder in zytosolischen Extrakten, die zuvor mit Cytochrom c und dATP stimuliert wurden, nicht hemmt. Wird Survivin jedoch zytosolischen Extrakten vor der Aktivierung der Caspase 9 durch Zugabe von Cytochrom c und dATP zugesetzt, verhindert es die Aktivierung der Caspase 3/7. Diese Ergebnisse deuten also darauf hin, dass Survivin die aktive Caspase 9 hemmt, nicht aber die aktiven Caspasen 3 und 7, und dass die Hemmung der Caspase 9 einen Kofaktor erfordert. Um einen solchen Kofaktor zu identifizieren, verwendeten Marusawa et al. (47) einen Two-Hybrid-Screen, um Survivin-bindende Proteine zu ermitteln, und identifizierten HBXIP. In enzymatischen Reaktionen hemmten Survivin und HBXIP in Kombination (aber keines der beiden Proteine allein) die Aktivität von Caspase 9. Weitere Studien werden erforderlich sein, um diese widersprüchlichen Studien zu klären und den Mechanismus zu entschlüsseln, durch den Survivin Caspasen hemmt. Um die Bedeutung von HBXIP als notwendiger Kofaktor für Survivin zu verallgemeinern, muss es außerdem in anderen Zellsystemen untersucht werden. Solche Arbeiten sind ein wichtiger Schritt zur Entwicklung chemischer Survivin-Inhibitoren.

Beyond Caspase Inhibition

Die meiste Aufmerksamkeit wurde den IAPs als Caspase-Inhibitoren gewidmet, aber mehrere Beweislinien deuten darauf hin, dass IAPs die Apoptose durch Auswirkungen auf die Zellzyklusprogression, die Zellteilung und die Signaltransduktion hemmen können.

Apoptose-Inhibitor-Proteine regulieren die Zellteilung.

Die IAP-Proteine spielen wahrscheinlich eine Rolle bei der Zellteilung. Hefen zum Beispiel haben keine Caspasen, aber IAP-Homologe, die eine BIR-Domäne enthalten. Die Deletion von IAP in Hefe führt zu einer ineffizienten Sporenbildung, was darauf hindeutet, dass IAP zumindest in Hefe eine Rolle bei der Meiose spielt (20, 21, 22). In Säugetierzellen kolokalisiert Survivin mit dem mitotischen Apparat einschließlich B-Tubulin, Mikrotubuli, Zentrosomen und Kinetochoren (48, 49, 50). Die Hemmung von Survivin mit einem Anti-Survivin-Antikörper führt zu einer verzögerten Metaphase und erzeugt mitotische Zellen mit kürzeren und weniger dichten mitotischen Spindeln (48, 50).

Inhibitor of Apoptosis Proteins Regulate Cell Cycle Progression.

Evidence impliziert auch IAPs als Regulatoren des Zellzyklus. So führt die Überexpression von XIAP zu einem Stillstand der Zellen in der G0-G1-Phase des Zellzyklus, und dieser Wachstumsstillstand ist mit einer Herabregulierung von Cyclin A und D1 und der Induktion der Cyclin-abhängigen Kinaseinhibitoren p21 und p27 verbunden (51). Darüber hinaus bindet XIAP die Zellzyklusregulatoren MAGE-D1 und NRAGE, aber die Bedeutung dieser Interaktion ist unklar (52). Auch Survivin wird mit der Regulierung des Zellzyklus in Verbindung gebracht. In HeLa-Zellen ist Survivin in G1-Zellen praktisch nicht nachweisbar und steigt in S-Phasen- und G2-M-Zellen um das ∼5- bzw. 40-Fache an (50). Änderungen der Survivin-mRNA-Spiegel korrelieren auch mit einem Anstieg des Survivin-Proteins und der Promotoraktivität.

Apoptose-Inhibitor-Proteine regulieren die Zellsignalisierung.

Die IAP-Proteinfamilie spielt auch eine Rolle bei der Zellsignalisierung, indem sie den Kernfaktor (NF)-κB aktiviert. XIAP und NAIP bilden zum Beispiel einen Komplex mit der TAK1-Kinase und ihrem Kofaktor TAB1, der zur Aktivierung der c-Jun-NH2-terminalen Kinase 1 führt (53). Die aktivierte c-Jun-NH2-terminale Kinase 1 aktiviert anschließend NF-κB über die Phosphorylierungskaskade der Mitogen-aktivierten Proteinkinase (54). Darüber hinaus fördert XIAP die Translokation der NF-κB p65-Untereinheit in den Zellkern, was eine Voraussetzung für die NF-κB-Aktivität ist (55). Schließlich fördert XIAP den Abbau des NF-κB-Inhibitors Iκβ (51).

Wenn die Rolle der IAPs bei der Regulierung von Zellteilung, Zellzyklus und Signaltransduktion geklärt ist, wird es wichtig sein, die für diese Aktivitäten verantwortlichen IAP-Domänen zu identifizieren. Wenn es möglich wird, separate Domänen der Proteine zu identifizieren, die Caspasen, den Zellzyklus und die Signaltransduktion hemmen, könnten mutierte IAPs hergestellt werden, die diese Funktionen aufheben. Diese Arbeit könnte zur Entwicklung von IAP-Inhibitoren führen, die spezifisch die Hemmung von Caspasen durch IAPs blockieren, während IAPs ihre Rolle als Zellzyklus- und Signaltransduktionsregulatoren beibehalten.

Regulierung der Funktion von Apoptose-Inhibitorproteinen durch endogene inhibitorische Proteine

Mitglieder der IAP-Familie werden auf der Ebene des Gens, der Botschaft und des Proteins reguliert, aber die Einzelheiten dieser Regulierung liegen außerhalb des Rahmens dieser Übersicht. Vielmehr konzentriert sich diese Übersicht auf die Regulierung von IAPs durch endogene inhibitorische Proteine, da diese als Prototypen für therapeutische chemische IAP-Inhibitoren dienen.

Regulatorische IAP-bindende Proteine wurden zuerst in Drosophila identifiziert. Es wurde gezeigt, dass die Proteine Reaper, Hid, Grim (56) und Sickle (57) das Drosophila IAP, DIAP1, binden und hemmen können. Später wurden menschliche Versionen von Reaper (Rpr), Hid, Grim (Grm) und Sickle (Skl) identifiziert und SMAC/DIABLO und HTRA2 genannt. Diese IAP-Inhibitoren teilen eine homologe Sequenz in ihrem NH2-Terminus, die für die Bindung und Hemmung von IAPs verantwortlich ist (Abb. 4)⇓.

SMAC und HTRA2.

Menschliches SMAC und HTRA2 sind mitochondriale Proteine, die zusammen mit Cytochrom c beim Aufbrechen der Mitochondrien freigesetzt werden. Bei der Freisetzung werden sie in eine aktive Form gespalten. In ihrem aktiven Zustand binden SMAC und HTRA2 IAPs und verhindern so deren Verbindung mit Caspasen (58, 59, 60, 61). Die IAP-hemmenden Funktionen der SMAC-Proteinfamilie sind in ihrem NH2-Terminus kodiert. Peptide, die den sieben NH2-terminalen Aminosäuren entsprechen, sind in der Lage, XIAP zu binden (62). Die Mutation des NH2-terminalen Alanins zu Glycin hebt die Fähigkeit des SMAC-Peptids auf, IAPs zu binden und seine proapoptotische Funktion auszuüben (63). Wenn Peptide, die den sieben NH2-terminalen Aminosäuren von SMAC entsprechen, in Zellen internalisiert werden, sind sie in der Lage, H460-Lungenkrebszellen für Cisplatin und Taxol (64) und Neuroblastomzellen für den Tumor-Nekrosefaktor-bezogenen Apoptose-induzierenden Liganden zu sensibilisieren. Ähnliche Ergebnisse wurden mit HTRA2 und den IAP-Inhibitoren in Drosophila beobachtet. Die Antitumoreigenschaften von SMAC-Peptiden wurden auf Xenografts ausgedehnt, wo zellpermeable Versionen dieser Peptide in Kombination mit Cisplatin (64) oder TRAIL (65) in Xenografts von Lungenkarzinomen bzw. Gliomen Tumore schrumpfen lassen. Somit dienen diese SMAC-Peptide als Prototypen für kleine Moleküle, die die Wirkungen von SMAC nachahmen und IAPs hemmen und bei einer Vielzahl von bösartigen Erkrankungen therapeutisch nützlich sein könnten.

Strukturstudien.

Angesichts des potenziellen klinischen Nutzens von SMAC-ähnlichen Molekülen wurden Anstrengungen unternommen, um die physikalischen Interaktionen zwischen SMAC und IAPs zu verstehen. Strukturstudien haben gezeigt, dass SMAC an zwei verschiedenen Stellen an XIAP bindet. Der NH2-Terminus des aktiven SMAC (Reste 56-59) bindet an die BIR3-Tasche von XIAP und hemmt die BIR3-Domäne kompetitiv an der Bindung von Caspase 9. Mutationen in der BIR3-Domäne, die die Bindung an Caspase 9 verhindern (z. B. W310), verhindern auch die BIR3-Domäne an der Bindung von SMAC, was darauf hindeutet, dass sich die Bindungsstellen von SMAC und Caspase 9 überschneiden. Die Bindungsstellen sind jedoch nicht identisch, da einige Mutationen in BIR3 (z. B. H343A) die Bindung von BIR3 an Caspase 9, nicht aber von SMAC aufheben (63, 66).

SMAC-Protein in voller Länge und NH2-terminale Peptide binden auch die BIR2-Domäne von XIAP, jedoch mit einer ∼5- bis 10-fach geringeren Affinität als die für BIR3. Der Mechanismus, durch den SMAC die Assoziation von BIR2 mit Caspase 3 unterbricht, ist unklar, könnte aber eher mit sterischer Hinderung als mit kompetitiver Bindung zusammenhängen (63).

HTRA2 bindet an die BIR3-Domäne von XIAP, jedoch mit schwächerer Affinität als SMAC (67). In seinem aktiven Zustand liegt HTRA2 als Trimer vor, und Mutationen, die die Trimerbildung verhindern, machen HTRA2 inaktiv. Neben der Hemmung von IAPs durch Bindung an die BIR3-Tasche kann HTRA2 auch mehrere IAPs spalten und inaktivieren, darunter XIAP, cIAP1 und cIAP2, nicht jedoch Survivin (68).

SMAC β.

SMAC und HTRA2 können ihre proapoptotische Aktivität auch durch Effekte ausüben, die unabhängig von der IAP-Bindung sind. In einer Studie von Roberts et al. (69) wurde eine natürlich vorkommende alternative Spleißform von SMAC beschrieben, die als SMAC β bezeichnet wird und der die Mitochondrien-Zielsequenz fehlt. SMAC β interagierte nicht mit XIAP, cIAP1 oder cIAP2, was wahrscheinlich auf den Verlust des NH2-Terminus zurückzuführen ist. Obwohl es nicht in der Lage ist, IAPs zu binden, verstärkte SMAC β die TRAIL- und VP-16-vermittelte Apoptose in 293-Zellen. Ebenso sind mutierte Versionen von HTRA2 (67), die keine IAPs binden können, immer noch in der Lage, Apoptose auszulösen, wenn sie in MCF7-Brustkrebszellen überexprimiert werden. Aus dieser Studie geht nicht hervor, wie diese alternativen Spleißformen dennoch Apoptose auslösen können. Vielleicht behalten sie ihre Fähigkeit zur Ubiquitinierung von IAPs bei und fördern so die Zerstörung von IAPs. Möglicherweise haben SMAC und HTRA2 aber auch zusätzliche Bindungspartner, die nichts mit den IAPs zu tun haben und über die sie einen proapoptotischen Einfluss ausüben. Im Falle von HTRA2 hat es eine Proteaseaktivität, die unabhängig von seiner Rolle bei der Bindung von IAPs ist, und diese Proteaseaktivität kann die Apoptose in einigen Systemen regulieren (68).

XAF1.

XAF1 ist ein weiterer IAP-Inhibitor. XAF1 ist ein Kernprotein, das XIAP bindet und im Zellkern sequestriert. In biochemischen Reaktionen bindet und hemmt XAF1 XIAP. In Zellen blockiert eine Überexpression von XAF1 die durch XIAP vermittelte Hemmung der Apoptose. Es bleibt jedoch unklar, ob die Sequestrierung von XIAP im Zellkern lediglich die XIAP von den zytosolischen Caspasen trennt oder ob es zusätzliche Wirkungen von XIAP im Zellkern gibt (70). Moleküle, die XAF1 nachahmen, würden wahrscheinlich anders funktionieren als SMAC und wären eine alternative Strategie zur Entwicklung eines XIAP-Inhibitors.