Integrative genomische Analysen der APOBEC-Mutationssignatur, der Expression und Keimbahndeletion von APOBEC3-Genen und der Immunogenität bei mehreren Krebsarten

Unterschiedliche Muster der APOBEC3-Gene, im Zusammenhang mit der APOBEC-Mutationssignatur bei mehreren Krebsarten

In Anlehnung an die frühere Analyse der APOBEC-Mutationssignatur haben wir die Mutationen anhand der Anzahl der Deaminase-C-Mutationen innerhalb des TCW-Trinukleotid-Motivs gemessen, die in jeder Probe bei 10 Krebsarten zu T- oder G-Mutationen wurden (siehe Methoden). Wir führten univariate Analysen durch, um die Assoziationen zwischen der APOBEC-Mutationssignatur und dem Gesamtniveau der Genexpression von APOBEC3A und APOBEC3B zu bewerten. Wir stellten fest, dass das APOBEC3A-Expressionsniveau bei insgesamt sechs Krebsarten – Blasen-, Brust-, Gebärmutterhals-, Lungenadenokarzinom, Kopf-Hals- und Schilddrüsenkrebs – positiv mit der APOBEC-Mutationssignatur verbunden war. Bei den übrigen Krebsarten wurden keine signifikanten Assoziationen beobachtet, obwohl die gleichen Assoziationsrichtungen zu beobachten waren (Zusatzdatei 1: Tabelle S1). Interessanterweise stellten wir fest, dass das APOBEC3B-Expressionsniveau bei allen Krebsarten mit Ausnahme des Plattenepithelkarzinoms der Lunge positiv mit der APOBEC-Mutationssignatur assoziiert war (Zusätzliche Datei 1: Tabelle S1). Im Vergleich zu den Assoziationen von APOBEC3A war APOBEC3B spezifisch mit der APOBEC-Mutationssignatur bei Magen-, Bauchspeicheldrüsen- und Nierenkrebs assoziiert, mit einem P = 5,2 × 10- 11, P = 2,0 × 10- 3 bzw. P = 1,1 × 10- 4 (Zusätzliche Datei 1: Tabelle S1). Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit früheren Studien. Darüber hinaus untersuchten wir auch die Assoziationen der APOBEC-Mutationssignatur mit der Genexpression anderer APOBEC3-Gene: APOBEC3C, APOBEC3D, APOBEC3F, APOBEC3G und APOBEC3H. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Expression dieser Gene mit der APOBEC-Mutationssignatur in verschiedenen Krebsarten verbunden war (Additional file 1: Tabelle S2). Zum Beispiel war die Expression von APOBEC3C mit einer erhöhten APOBEC-Mutationssignatur bei Gebärmutterhals- und Kopf-Hals-Krebs verbunden, während seine Expression mit einer verringerten APOBEC-Mutationssignatur bei Magenkrebs verbunden war. Unser Ergebnis zeigte auch, dass die Expression von APOBEC3D, APOBEC3F und APOBEC3G mit einer erhöhten APOBEC-Mutationssignatur assoziiert war, während das Ergebnis der Assoziation von APOBEC3G im Einklang mit dem früheren Befund stand. Interessanterweise beobachteten wir, dass die Expression von APOBEC3H mit einer erhöhten APOBEC-Mutationssignatur bei Gebärmutterhalskrebs assoziiert war, aber nicht bei Brustkrebs beobachtet wurde.

Unterschiedliche Muster der Isoformen von APOBEC3A und APOBEC3B, die mit der APOBEC-Mutationssignatur bei verschiedenen Krebsarten assoziiert sind

Wir untersuchten ferner die Assoziationen zwischen der APOBEC-Mutationssignatur und den Expressionsniveaus jeder der Isoformen, die von APOBEC3A und APOBEC3B transkribiert werden. Insgesamt wurden sechs Isoformen analysiert, darunter uc003awn und uc011aob, die von APOBEC3A transkribiert werden, uc003awo, uc003awp und uc003awq, die von APOBEC3B transkribiert werden, sowie eine weitere Isoform, uc011aoc, die aus einem Fusionsereignis stammt, das in einer Region stattfindet, die das letzte Intron von APOBEC3A bis zum letzten Exon von APOBEC3B umfasst (Abb. 1a, b). Wir konnten bestätigen, dass die Isoformen uc003awn und uc003awo primär von APOBEC3A bzw. APOBEC3B transkribiert wurden (Additional file 1: Abbildung S1). Wie erwartet, stimmte die Richtung der Assoziation zwischen den Expressionsniveaus von uc003awn und uc003awo und der APOBEC-Mutationssignatur mit den Beobachtungen der allgemeinen Genexpressionsniveaus bei allen Krebsarten überein (Abb. 1c, d; Zusatzdatei 1: Tabelle S3). Überraschenderweise war das Expressionsniveau von uc011aoc (APOBEC3A/B) nur bei Brustkrebs positiv mit der APOBEC-Mutationssignatur assoziiert (P = 5,0 × 10- 10) (Abb. 1e; Zusatzdatei 1: Tabelle S3). Für die übrigen Isoformen wurden jedoch bei keiner Krebsart Assoziationen beobachtet, mit Ausnahme einer schwachen Assoziation für uc011aob (APOBEC3A) mit Kopf- und Halskrebs (P = 0,02; Zusatzdatei 1: Tabelle S3).

Unter Verwendung multipler Regressionsanalysen, die alle Isoformen sowohl von APOBEC3A als auch von APOBEC3B einschlossen, fanden wir heraus, dass die Expressionsniveaus von uc003awn (APOBEC3A) und uc003awo (APOBEC3B) unabhängig voneinander und gemeinsam mit der ausgewerteten APOBEC-Mutationssignatur bei mehreren Krebsarten assoziiert waren: Blasenkrebs (eine marginale Assoziation für uc003awn), Brustkrebs, Gebärmutterhalskrebs, Adenokarzinom der Lunge sowie Kopf- und Halskrebs (Tabelle 1). Ebenso wurde eine zusätzliche Assoziation für uc011awn (APOBEC3A) bei Schilddrüsenkrebs beobachtet, während Assoziationen für uc003awo (APOBEC3B) bei Magen-, Pankreas- und Nierenkrebs festgestellt wurden. In Übereinstimmung mit der univariaten Analyse wurde eine auffällige Assoziation für uc011aoc (APOBEC3A/B) mit der APOBEC-Mutationssignatur bei Brustkrebs beobachtet (P = 5,3 × 10- 11), und eine zusätzliche Assoziation wurde auch bei Lungenadenokarzinomen beobachtet (P = 0,01) (Tabelle 1). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass uc011aoc eine gewebespezifische Rolle bei der Beeinflussung der APOBEC-Mutationssignatur vor allem bei Brustkrebs spielt, während uc003awn und uc003awo eine ubiquitäre, aber ausgeprägte Rolle im gesamten Spektrum menschlicher Krebserkrankungen spielen. Bemerkenswerterweise zeigte unsere zusätzliche Analyse die positive Expressionskorrelation zwischen der Isoform uc011aoc und APOBEC3A bei einer Vielzahl von Krebsarten, insbesondere bei Brustkrebs (Zusatzdatei 1: Tabelle S4).

Zusätzlich führten wir eine Assoziationsanalyse durch, die nach klinischen Subtypen bei Brustkrebs geschichtet war. Wir stellten fest, dass die Assoziationen der Isoformen von uc003awn (APOBEC3A) und uc011aoc (APOBEC3A/B) mit der APOBEC-Mutationssignatur über verschiedene klinische Subtypen hinweg variierten, wobei die signifikanteste Assoziation beim LumA-Subtyp beobachtet wurde (Zusatzdatei 1: Tabelle S5).

Deletion von APOBEC3A/B in der Keimbahn beeinflusst die Expression der Isoformen der Gene APOBEC3A und APOBEC3B

Um zu untersuchen, wie die Deletion von APOBEC3A/B in der Keimbahn die Expression der Isoformen von APOBEC3A und APOBEC3B beeinflusst, identifizierten wir zunächst 30 Proben, bei denen eine homozygote Deletion vorhergesagt wurde, 239 Proben, bei denen eine heterozygote Deletion vorhergesagt wurde, und 2287 Proben, bei denen keine Deletion vorhergesagt wurde (Additional file 1: Tabelle S6, siehe Methoden). Als Nächstes untersuchten wir die Assoziationen zwischen der APOBEC3A/B-Deletion in der Keimbahn und den Expressionsniveaus der einzelnen Isoformen mittels univariater Analyse (siehe Methoden). Wie erwartet beobachteten wir, dass die Deletion von APOBEC3A/B in der Keimbahn signifikant mit einer verringerten Expression der Isoform uc003awo (APOBEC3B) bei allen Krebsarten verbunden war (P < 0,05), mit Ausnahme von Bauchspeicheldrüsenkrebs mit einem P = 0,14. Signifikante Assoziationen mit verringerten Expressionsniveaus von uc003awn (APOBEC3A) wurden auch bei drei Krebsarten – Blase, Brust und Schilddrüse – beobachtet (Abb. 2; Tabelle 2). Im Gegensatz dazu zeigten unsere Ergebnisse, dass die Deletion von APOBEC3A/B in der Keimbahn bei allen Krebsarten signifikant mit einer erhöhten Expression von uc011aoc (APOBEC3A/B) verbunden war, außer bei Magen-, Bauchspeicheldrüsen- und Nierenkrebs. Für diese gab es keine statistische Signifikanz, aber die gleichen Assoziationsrichtungen (Abb. 2; Tabelle 2). Insbesondere Kopf- und Halskrebs zeigte die signifikanteste Assoziation mit P = 3,8 × 10- 65, und Brust- und Blasenkrebs zeigten die signifikanteste Assoziation mit P = 3,0 × 10- 8 bzw. P = 2,9 × 10- 7. Darüber hinaus führten wir dieselbe Analyse stratifiziert nach Population durch, und ein ähnlicher Trend wurde bei diesen Krebsarten beobachtet (Daten nicht gezeigt). Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Deletion von APOBEC3A/B in der Keimbahn bei fast allen untersuchten Krebsarten signifikant mit einer verminderten Expression von uc003awn und uc003awo verbunden war, während die Expression von uc011aoc erhöht war.

Die Keimbahndeletion von APOBEC3A/B beeinflusst die APOBEC-Mutationssignatur, Neoantigenbelastung und relative Zusammensetzung der Immunzellen, insbesondere bei Brustkrebs

Eine frühere Studie hat gezeigt, dass eine APOBEC3A/B-Deletion in der Keimbahn mit einer erhöhten APOBEC-Mutationssignatur bei Brustkrebs verbunden ist, während ein ähnliches Muster, jedoch ohne statistische Signifikanz, bei vielen anderen Krebsarten, wie z. B. Blasenkrebs, beobachtet wurde. Bei der univariaten Analyse zur Bewertung der Gesamtwirkung der APOBEC3A/B-Deletion in der Keimbahn auf die APOBEC-Mutationssignatur stellten wir fest, dass die Deletion nur bei Brustkrebs signifikant mit einer erhöhten APOBEC-Mutationssignatur verbunden war (P = 5,6 × 10- 3; Tabelle 3; Abb. 3a). Bei den meisten anderen Krebsarten wurde jedoch ein entgegengesetzter Trend beobachtet, obwohl die meisten Zusammenhänge statistisch nicht signifikant waren (Tabelle 3). Insbesondere bei Blasenkrebs beobachteten wir, dass eine APOBEC3A/B-Deletion in der Keimbahn signifikant mit einer verminderten APOBEC-Mutationssignatur verbunden war (P = 1,7 × 10- 3; Tabelle 3). Um weiter zu klären, ob der Einfluss der APOBEC3A/B-Deletion in der Keimbahn auf die APOBEC-Mutationssignatur auf ihre Auswirkung auf die Genexpression zurückzuführen ist, haben wir die Assoziationen zwischen der APOBEC-Mutationssignatur und der Deletion mit einer Anpassung für die Expression der Isoformen weiter untersucht (siehe Methoden). Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Keimbahndeletion von APOBEC3A/B nur bei Brustkrebs signifikant mit einer erhöhten APOBEC-Mutationssignatur assoziiert war (P = 2,8 × 10- 6; Tabelle 3; Abb. 3b). Im Vergleich zur ursprünglichen Beobachtung des Gesamteffekts (Beta = – 0,281; Tabelle 3) wurde eine höhere Effektgröße (Beta = – 0,620) der Deletion mit einer angepassten Isoformexpression beobachtet. Um zu beurteilen, ob die Keimbahndeletion zum Anteil der APOBEC-Mutationssignatur beitragen kann, analysierten wir auch den Anteil der APOBEC-Mutationssignatur im Verhältnis zu den Gesamtmutationen für jede Probe (siehe Methoden). In Übereinstimmung mit der anfänglichen Beobachtung der APOBEC-Mutationssignatur stellten wir fest, dass die Keimbahndeletion nur bei Brustkrebs signifikant mit einem erhöhten Anteil der APOBEC-Mutationssignatur verbunden war (Beta = – 0,287, P = 4,8 × 10- 3 und Beta = – 0,5, P = 1,4 × 10- 4 für den Gesamteffekt und die Effekte mit angepasster Genexpression; siehe Tabelle 3). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Keimbahndeletion von APOBEC3A/B, die zu einer erhöhten APOBEC-Mutationssignatur führt, wahrscheinlich auf die unterschiedliche Funktion von uc011aoc zurückzuführen ist, die von der Deletion transkribiert wird, abgesehen von ihrer Wirkung auf die erhöhte Expression von uc011aoc. Es wurde berichtet, dass der APOBEC3H-Haplotyp I (APOBEC3H-I) hauptsächlich zur APOBEC-Mutationssignatur bei Proben mit Keimbahndeletionen von APOBEC3A/B bei Brustkrebs beitragen kann. Wir analysierten den APOBEC3H-I-Haplotyp für insgesamt 76 Proben, bei denen eine Keimbahndeletion von APOBEC3A/B vermutet wurde (siehe Methoden). Unsere Ergebnisse zeigten, dass die APOBEC-Mutationssignatur nicht signifikant mit dem APOBEC3H-I-Haplotyp korreliert war, unabhängig von den Proben, bei denen homozygote oder heterozygote Keimbahn-APOBEC3A/B-Deletionen vermutet wurden (Daten nicht gezeigt). Unsere Ergebnisse stehen jedoch im Einklang mit dem früheren Befund, dass das durch die Deletion erzeugte APOBEC3A/B-Protein eine höhere Expression aufweist als das APOBEC3A-Protein, basierend auf der Untersuchung von in vitro-Funktionstests.

Um die unterschiedliche Funktion und die potenziellen Pfade, an denen die Isoform uc011aoc-Expression (transkribiert von der APOBEC3A/B-Deletion) beteiligt sein könnte, weiter zu erforschen analysierten wir Gene, die mit der Isoform uc011aoc in den Proben koexprimiert wurden, für die eine Keimbahndeletion von APOBEC3A/B vorhergesagt wurde (siehe Methoden). Eine IPA-Analyse der Anreicherung in kanonischen Signalwegen zeigte, dass diese ko-exprimierten Gene in verschiedenen kanonischen Signalwegen der verschiedenen Krebsarten signifikant angereichert waren. Insbesondere beobachteten wir, dass die am stärksten angereicherten Signalwege HIPPO für die Blase, PTEN für die Brust, iNOS und Interferon für das Lungenadenokarzinom, Acyl-CoA-Hydrolyse für den Magen, DNA-Doppelstrangbruchreparatur und Fettsäure-α-Oxidation für die Bauchspeicheldrüse, EIF2 für die Schilddrüse und GPCR-vermittelte Integration für die Niere waren (P < 0,01 für alle; Additional file 1: Table S7). Darüber hinaus wurde eine funktionelle Anreicherung bei Zelltod und Überleben bei mehreren Krebsarten beobachtet, darunter Blasen-, Brust-, Gebärmutterhals-, Lungenadenokarzinom und Lungenkarzinom (P < 0,05 für alle).

Wir untersuchten ferner den Zusammenhang zwischen der Keimbahndeletion von APOBEC3A/B und der Neoantigenbelastung. In Übereinstimmung mit der Beobachtung der APOBEC-Mutationssignatur zeigten unsere Ergebnisse, dass die APOBEC3A/B-Deletion in der Keimbahn nur bei Brustkrebs signifikant mit einer erhöhten Neoantigen-Belastung verbunden war (P = 6,5 × 10-3; Abb. 3c), während bei vielen anderen Krebsarten ein entgegengesetzter Trend beobachtet wurde (Zusatzdatei 1: Tabelle S8). In ähnlicher Weise fanden wir heraus, dass die Keimbahndeletion geringfügig mit der relativen Häufigkeit der Zusammensetzung von T-Zellen (CD8+) in TILs verbunden war, allerdings nur bei Brustkrebs (P = 0,08; Abb. 3d). Ein signifikanter Zusammenhang wurde festgestellt, als wir Proben mit homozygoter und heterozygoter Deletion durchkämmten und mit den Proben ohne Deletion verglichen (Wilcoxon signed-rank test, P < 0,05). Für andere Immunzellen wurde jedoch kein Zusammenhang festgestellt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Keimbahndeletion von APOBEC3A/B eine gewebespezifische Rolle bei der Beeinflussung der APOBEC-Mutationssignatur und der Immunogenität bei Brustkrebs spielt, was wahrscheinlich die Ergebnisse früherer genomweiter Assoziationsstudien über mögliche Mechanismen für ihre Assoziation mit einem erhöhten Brustkrebsrisiko untermauert.

APOBEC-Mutationssignatur trägt signifikant zu Neoantigenen bei

Um zu untersuchen, inwieweit die APOBEC-Mutationssignatur zu Neoantigenen beiträgt, analysierten wir die vorhergesagte Neoantigenbelastung für jede Probe aus einer früheren Studie (siehe Methoden). Mithilfe einer univariaten Analyse haben wir die Assoziationen zwischen der APOBEC-Mutationssignatur und der Neoantigenbelastung für jeden Krebstyp untersucht. Wie erwartet war die APOBEC-Mutationssignatur bei allen Krebsarten positiv mit der Neoantigenbelastung assoziiert (P < 1,0 × 10- 4 für alle Vergleiche), wobei die signifikantesten Assoziationen bei Brust- und Blasenkrebs mit P = 5,1 × 10- 125 bzw. P = 1,5 × 10- 90 beobachtet wurden (Zusatzdatei 1: Tabelle S9). In ähnlicher Weise wurde ein insgesamt positiver Assoziationstrend zwischen der vorhergesagten Neoantigenbelastung und dem Anteil der APOBEC-Mutationssignatur beobachtet, mit Ausnahme von Magenkrebs (Abb. 4; Zusatzdatei 1: Tabelle S10). Die signifikanten Assoziationen wurden bei mehreren Krebsarten beobachtet, darunter Blasen-, Brust-, Gebärmutterhals-, Lungenadenokarzinom, Kopf- und Halskrebs sowie Schilddrüsenkrebs. Insbesondere Brust- und Blasenkrebs zeigten die besten Assoziationen mit P = 8,9 × 10- 29 bzw. P = 2,8 × 10- 27 (Zusatzdatei 1: Tabelle S10). Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die APOBEC-Mutationssignatur eine wichtige Rolle bei der Biogenese von Neoantigenen bei menschlichem Krebs spielt.

Assoziationen zwischen der relativen Häufigkeit von Immunzellzusammensetzungen in TILs mit Neoantigenbelastung und APOBEC-Mutationssignatur

Um die Beziehung zwischen Neoantigenbelastung und TILs zu untersuchen, verwendeten wir Genexpressionsdaten in Tumorgeweben, um die Häufigkeit der relativen Zellzusammensetzungen jedes Immunzelltyps zu messen, einschließlich naiver B-Zellen, B-Zell-Gedächtniszellen, CD8-T-Zellen und CD4-Gedächtnis-aktivierter T-Zellen in TILs (siehe Methoden). Mithilfe einer univariaten Analyse untersuchten wir den Zusammenhang zwischen der Neoantigen-Belastung und der relativen Häufigkeit der Immunzell-Zusammensetzungen für jeden Krebstyp. Wir stellten fest, dass es bei allen Krebsarten außer Schilddrüse und Niere einen positiven Assoziationstrend zwischen der Neoantigenbelastung und den CD8+ und CD4+ gedächtnisaktivierten T-Zelltypen gab (Binomialtest P = 0,11 bzw. P = 0,02 für CD8+ und CD4+ gedächtnisaktivierte T-Zelltypen). Ein entgegengesetztes Muster wurde sowohl für naive als auch für memory-aktivierte B-Zellen bei allen Krebsarten beobachtet, mit Ausnahme des Lungenadenokarzinoms (Binomialtest P = 0,02 bzw. P = 2,2 × 10-16 für naive und memory-aktivierte B-Zellen). Insbesondere zeigten unsere Ergebnisse, dass die Neoantigenbelastung mit der relativen Häufigkeit der CD8+ und CD4+ gedächtnisaktivierten T-Zellen sowie der naiven und gedächtnisaktiven B-Zellen bei Blasenkrebs zusammenhing. Bei Brustkrebs gab es einen Zusammenhang zwischen naiven und gedächtnisaktivierten B-Zelltypen und bei Lungenadenokarzinomen, Kopf- und Halskrebs sowie Bauchspeicheldrüsenkrebs mit gedächtnisaktivierten CD4-T-Zelltypen (Zusatzdatei 1: Tabelle S11). Da die APOBEC-Mutationssignatur signifikant zu Neoantigenen beiträgt, haben wir zusätzlich die Assoziation zwischen den relativen Häufigkeiten der Immunzellzusammensetzungen in TILs und der APOBEC-Mutationssignatur untersucht. In Übereinstimmung mit der Beobachtung aus der Assoziationsanalyse der Neoantigen-Belastung wurde ein ähnliches Muster auch für die APOBEC-Mutationssignatur gefunden (Zusatzdatei 1: Tabelle S12). Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die APOBEC-Mutationssignatur einen Einfluss auf die immunogenen Fähigkeiten des Krebses hat, wie z. B. das Anlocken bestimmter Immunzellen in TILs, was möglicherweise durch die erhöhte Neoantigenbelastung vermittelt wird.