Isolierung, Charakterisierung und toxikologisches Potential von Alternaria-Mykotoxinen (TeA, AOH und AME) in verschiedenen Alternaria-Spezies aus verschiedenen Regionen Indiens

Sammlung und Isolierung von Alternaria-Spezies

Die befallenen Teile wie Blätter, Früchte und Stängel von erkrankten Pflanzen aus verschiedenen Regionen Indiens wurden gesammelt und ins Labor gebracht. Die Blattproben wurden mit 0,5%iger Natriumhypochloritlösung oberflächensterilisiert, mehrmals gründlich mit sterilem destilliertem Wasser (SDW) gewaschen und für 3-4 Tage in Petrischalen auf Kartoffeldextrose-Agar (PDA) Nährboden gelegt. Die PDA-Platten mit den infizierten Blattstücken wurden bei 28 °C und einer 12-stündigen Hell-Dunkel-Photoperiode 6-10 Tage lang bebrütet57. Um eine bakterielle Kontamination zu vermeiden, wurde das Medium mit Streptomycin versetzt. Die Konidien wurden einzeln sporuliert, um reine Kolonien zu erhalten, die auf sterilisiertes Filterpapier gesetzt wurden.

Pathogenitätstest

Um die Formae-Spezialitäten zu bestimmen, wurde eine Virulenzanalyse der Isolate an Tomatensorten durchgeführt, die für Alternaria anfällig sind. Insgesamt wurden 60 Isolate von Alternaria auf ihre Pathogenität getestet. Die Tomatensamen wurden in Natriumhypochlorit angeritzt, in Leitungswasser gespült und anschließend an der Luft getrocknet. Die Pflanzen wurden separat in Töpfen gezogen. Die physiologischen Bedingungen wie Temperatur und Luftfeuchtigkeit für das Pflanzenwachstum wurden bei 28 °C bis 32 °C bzw. 40 bis 60 % relativer Luftfeuchtigkeit gehalten. Die optimale Inokulumkonzentration wurde beibehalten (2 × 106 Sporen/ml) und auf die Blattflächen gesprüht. Die Versuchspflanzen wurden 8 Stunden lang bei 25 °C in Taukammern gehalten. Diese Pflanzen wurden 2-3 Tage lang regelmäßig auf den Schweregrad der Infektion und die Entwicklung der Krankheit im Vergleich zu den nicht beimpften Kontrollblättern beobachtet. Die ersten Symptome wurden 1 Tag nach dem Sprühen der Sporeninokulationen sichtbar. Die Krankheitsschwere wurde ab dem 1. Tag nach der Inokulation bis zu 6 Tagen bewertet. Die Daten wurden mit Hilfe der Varianzanalyse (ANOVA) und des Duncan-Tests (P ≤ 0,05) statistisch ausgewertet.

DNA-Extraktion und Identifizierung des Erregers

Der Erreger wurde zunächst anhand der morphologischen Merkmale einschließlich Größe und Form identifiziert, Der Erreger wurde zunächst anhand morphologischer Merkmale wie Größe und Form sowie Struktur der Konidien identifiziert und durch ITS-Amplifikation mit den Universalprimern ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′) und ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′), die ITS-Regionen und 5.8S-Gene, die für Pilzarten kodieren. Die DNA-Extraktion wurde nach der von Doyle und Doyle58 vorgeschlagenen Methode durchgeführt. 0,5 g der lyophilisierten Pilzmatte wurden in einem Mörser und Stößel mit 10 ml CTAB-Extraktionspuffer zerkleinert und anschließend 30 Minuten lang bei 65 °C im Wasserbad inkubiert. Die Probe wurde dann mit einem gleichen Volumen gekühlten Chloroform/Isoamylalkohols vermischt und vorsichtig gemischt, gefolgt von einer Zentrifugation bei 10.000 U/min für 10 min bei 4 °C. Der so gewonnene Überstand wurde mit dem gleichen Volumen Isopropanol vermischt und 2 h bei 4 °C stehen gelassen. Die Probe wurde erneut bei 10000 U/min für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Das Pellet wurde dann mit 70 %igem Ethanol gespült und 4 Stunden lang an der Luft getrocknet, um die Spuren von Alkohol zu entfernen. Die ITS-rDNA-Amplifikation wurde in 25 μl Reaktionsgemisch durchgeführt, das 2,5 μl 10X-Reaktionspuffer, 5 μl jedes Desoxyribonukleotidtriphosphats (dNTP) und jeweils 1,0 μl des universellen Vorwärtsprimers (ITS1) und des Rückwärtsprimers (ITS4) der ITS- und 5,8 S-Region, 0,3 μl Taq-DNA-Polymerase, 10-100 ng DNA und 2,5 μl MgCl2 enthielt. Das optimierte thermische Profil der PCR bestand aus einer anfänglichen Denaturierung bei 95 °C für 3 Minuten, einer Denaturierung bei 95 °C für 30 Sekunden, einem Annealing bei 70 °C für 30 Sekunden und einer abschließenden Verlängerung bei 72 °C für 1 Minute mit weiteren 40 Zyklen. Die Amplifikation wurde auf 1%igen Agarosegelen in 0,5X TBE-Puffer bestätigt, parallel zu Standard-DNA-Molekulargewichtsmarkern durchgeführt und unter UV-Transilluminator visualisiert.

ITS-Sequenzanalyse

Die erhaltenen ITS rDNA-Regionen ausgewählter Isolate wurden weiter gekürzt und mit dem QIAquick PCR-Reinigungskit (QIAGEN, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Die gereinigten Produkte wurden schließlich zur Sequenzierung an SciGenome Cochin, Kerala, Indien, geschickt. Die Sequenzen wurden mit Hilfe von NCBI BLAST mit denen in GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) verglichen. Die BLAST-Analyse wurde mit ITS-Sequenzen in voller Länge als Abfrage durchgeführt, um Beziehungen zu veröffentlichten Sequenzen aufzudecken. Die höchste Homologie und Gesamtpunktzahl wurden für die weitere Analyse notiert. Die in der vorliegenden Studie gewonnenen Sequenzen wurden bei GenBank eingereicht. Die ITS-Sequenzen von Alternaria-Stämmen aus anderen formae speciale wurden von der NCBI GenBank-Datenbank heruntergeladen und bei den phylogenetischen Analysen als Referenzsequenzen verwendet. Alle DNA-Sequenzen wurden mit dem Programm Clustal W, das im BioEdit-Sequenzausrichtungseditor enthalten ist, ausgerichtet59, 60. Die sich daraus ergebende Multiple-Alignment-Datei wurde für phylogenetische Analysen verwendet, die mit MEGA 5.0 mit der Neighbor-Joining-Methode durchgeführt wurden, die 500 Bootstrap-Wiederholungen erlaubt61.

Extraktion der Toxine aus Alternaria-Arten

Die Extraktion der toxischen Metaboliten erfolgte nach der Methode von Andersen et al.62 mit einigen Modifikationen. Die Extraktionen dieser Phytotoxine wurden auf Potato Dextrose Broth (PDB) Medium unter Verwendung von 20 Tage alten Kulturen durchgeführt. Drei Agarpfropfen (3 mm) wurden aus der Mitte jeder Alternaria-Kolonie geschnitten und in 200 ml PDB-Medium beimpft. Die Kolonien des Erregers wurden mit Hilfe eines Korkbohrers (5 mm) angeschnitten und dann in das PDB-Medium beimpft. Zwanzig Tage alte Kulturen wurden mit der Vakuumfiltermaschine durch Filterpapier filtriert. Die Kulturfiltrate wurden mit dem gleichen Volumen Methanol versetzt, gut gemischt und 24 Stunden bei 4 °C aufbewahrt. Danach wurde das Filtrat ausgefällt und das Methanol in einem Rotationsvakuumkonzentrator (IKA® RV 10) bei 43 °C zur Trockne eingedampft. Dem extrahierten Filtrat wurde ein gleiches Volumen Ethylacetat zugesetzt und in einem Scheidetrichter gut gemischt. Es wurden zwei Phasen erhalten, eine organische und eine wässrige Phase. Die wässrige Schicht wurde abgetrennt und mit Ethylacetat extrahiert. Der Ethylacetat-Extrakt wurde bei 44 °C im Vakuumverdampfer konzentriert und in Methanol aufgelöst.

Reinigung und Trennung des Alternaria-Phytotoxins durch Säulenchromatographie

Die Reinigung und Trennung der Verbindungen erfolgte nach der Methode von Devi et al.63 mit leichten Modifikationen. Die Säulenchromatographie (CC) wurde mit einer Glassäule (700 mm × 30 mm) durchgeführt, und als stationäre Phase wurde Kieselgel (100-120 Maschenweite Merk) gewählt. Die mobile Phase bestand aus reinem Lösungsmittel oder verschiedenen Lösungsmitteln, je nach Anforderung der Bedingungen. Die Säule wurde mit dem aus Isolaten von Alternaria-Arten extrahierten Rohkomplex beladen. Für die Abtrennung der toxischen Metaboliten wurde eine mobile Phase aus Chloroform: Methanol (80:20 und 95:05), Benzol: Aceton: Essigsäure (60:35:05) zur Trennung der Verbindungen verwendet und eine Gradientenelution durchgeführt. Die verschiedenen Fraktionen, die aus dem CC eluiert wurden, wurden durch Dünnschichtchromatographie (TLC) getrennt und durch die HPLC-Analyse bestätigt.

Dünnschichtchromatographie (TLC) Analyse der Phytotoxine

Die Dünnschichtchromatographie (TLC) wurde verwendet, um die verschiedenen Phytotoxine zu identifizieren, die sowohl von großen als auch von kleinen Sporen der identifizierten Alternaria-Arten produziert werden. Die TLC wurde nach der Methode von Andersen et al.64 durchgeführt. Bei dieser Methode wurden 4,5 g Kieselgel G254 (13% CaSO4 ½ H2O als Bindemittel) mit 25 ml bidestilliertem Wasser versetzt und mit einem Glasstab gerührt, bis sich eine Aufschlämmung von Kieselgel bildete. Danach wurde die Aufschlämmung vorsichtig auf eine Glasplatte aufgetragen und an einem sicheren Ort an der Luft getrocknet. Für die Trennung der verschiedenen Phytotoxine wurden verschiedene mobile Phasen im Verhältnis Chloroform: Methanol (80:20; v/v), Benzol: Aceton: Essigsäure (60:35:5; v/v), Chloroform: Methanol (95:5; v/v), Ethylacetat: Benzol (95:5; v/v) verwendet. Diese Lösungsmittelmischungen wurden dann in Exsikkatoren gegeben und 30 Minuten lang stehen gelassen, um die Umgebung darin zu sättigen. Vor der Durchführung der TLC wurden die mit Kieselgel beschichteten Glasplatten im Ofen bei 60 °C 10 Minuten lang aufgeladen. Nach dem Aufladen wurden 5 µl der Proben an verschiedenen Stellen in einem Abstand von 2 cm vom Boden aufgetupft. Nach dem Tupfen der Proben wurden die TLC-Platten einige Minuten lang in einem Exsikkator getrocknet. Die entstandenen Flecken wurden entwickelt, indem die TLC-Platten mit 0,2 % ethanolischem Eisenchlorid bestrahlt und/oder unter UV-Licht bei 365 nm visualisiert wurden. Die TLC-Platten wurden dann über Nacht an der Luft getrocknet, woraufhin die Rf-Werte berechnet wurden. Die Spots der verschiedenen Metaboliten, deren Rf-Werte mit den Rf-Werten der Standards übereinstimmten, wurden ausgekratzt, in HPLC-Methanol gelöst und für die HPLC-Analyse verwendet.

HPLC-UV-Analyse

Zubereitung des Standards

TeA (Kat.-Nr.: T1952), AOH (Kat.-Nr.: A4675) und AME (Kat.-Nr.: A4678) wurden von Biogenuix (LKT laboratories, Inc., Neu Delhi, Indien) erworben und in kristallisierter Form zur Herstellung des Standards verwendet. Die Stammlösung (1000 µg ml-1) und eine separate Arbeitslösung (10 µg ml-1) der Toxine wurden in HPLC-Methanol hergestellt und zur weiteren Verwendung bei -20 °C aufbewahrt. Diese Toxine wurden als Standards für die HPLC-Kalibrierung und für andere zusätzliche Experimente verwendet, indem die vorbereiteten Arbeitslösungen verdünnt wurden.

Bedingungen für die HPLC-UV-Analyse

Für die HPLC-Analyse wurden die Proben chromatographisch getrennt, indem eine deaktivierte Basis (250 mm lang × 4.6 mm, 5,0 µm Partikelgröße) C18 Waters Spherisorb, ODS2 Säule (Produkt Nr.: PSS831915, USA), die mit der Guardsäule verbunden war, Waters Series System (Waters, Waters Corporation, Milford, USA) mit UV-VIS Detektor (2998 PDA) und Waters 600E System Controller. Der 2998 PDA-Detektor war auf 254 nm als Integrationswellenlänge eingestellt. Die Proben wurden mit einer 10 μl-Schleife des Waters 717plus Autosamplers (Waters Corporation, Milford, USA) injiziert. Die Säule und die Guardsäule wurden thermostatisch auf 28 °C geregelt. Die Durchflussrate betrug 0,70 ml/min, und die mobile Phase bestand zu 75 % aus HPLC-Methanol (Lösungsmittel A) und zu 25 % aus einer wässrigen Lösung (Lösungsmittel B) von 0,1 M Phosphatpuffer, dem 900 ml DW auf 1 Liter zugesetzt wurden, wobei der pH-Wert von 5,8 durch Phosphorsäure aufrechterhalten wurde. Das Gerät wurde in einem linearen isokratischen Modus betrieben und die Detektion wurde im Bereich von 200-400 nm überwacht. Die Zuverlässigkeit der HPLC-Methode für die Analyse von AME, TeA und AOH wurde anhand der Nachweisgrenze (LOD) und der Bestimmungsgrenze (LOQ) validiert.

LC-MS/MS-Analyse

Für eine weitere Bestätigung der Alternaria-Toxine (AME, AOH und TeA) wurde eine chromatographisch-tandem-massenspektrometrische (LC-MS/MS) Methode mit leichten Modifikationen von Tölgyesi et al.65 durchgeführt. Die Methode umfasst eine Fest-Flüssig-Extraktion mit Methanol und eine anschließende Derivatisierung für TeA, AOH und AME. Anschließend wurden die Proben durch Festphasenextraktion auf polymerbasierten Kartuschen gereinigt, und schließlich wurden die Toxine durch LC-MS/MS getrennt. Für die LC-MS/MS-Analyse wurden die Proben schrittweise aufbereitet.

Reagenzien, Lösungsmittel und Herstellung des Standards

Getrocknete analytische Kalibranten von AME, AOH und TeA wurden von Biogenuix (LKT laboratories, Inc., New Delhi, Indien) erworben. Die Standards wurden mit 1,0 ml Methanol rekonstituiert, um 0,1 mg ml-1 Stammlösungen zu erhalten. Alle Stammlösungen wurden bei 4 °C aufbewahrt. 2,4-Dinitrophenylhydrazin (DNPH) und Undecanal wurden von Sigma-Aldrich bezogen. Das Derivatisierungsreagenz (0,58% DNPH in HCl-Lösung) wurde wie von Siegel et al.7 beschrieben hergestellt. Das Stoppreagenz war 5% (v/v) Undecanal in Methanol. Die derivatisierten TeA-, AOH- und AME-Standardlösungen (1,91 μg/ml, 2,54 μg/ml bzw. 2,71 μg/ml Methanol) wurden durch Mischen von 1 ml der 10 μg/ml methanolischen TeA-, AOH- und AME-Lösungen mit 1 ml DNPH-Lösung hergestellt. Die Mischung wurde über Nacht stehen gelassen und wie in den Abschnitten über die Probenextraktion und die SPE-Reinigung beschrieben verarbeitet. Das Endvolumen wurde mit Methanol auf 10 ml eingestellt. Diese Lösungen wurden verwendet, um die LC-MS/MS-Bedingungen für die Analyse zu optimieren. Insgesamt wurden 50 mM Ammoniumformiatpuffer in Wasser hergestellt und der pH-Wert mit Ameisensäure auf 3,0 eingestellt. Methanol und Acetonitril waren LC-MS-Qualität und wurden von Sigma-Aldrich bezogen. Ethylacetat, n-Hexan, Dichlormethan, Ameisensäure und Ammoniumformiat waren HPLC-Qualität und wurden von Merck (Darmstadt, Deutschland) bezogen. Die Kinetex C-18 UPLC LG 500-Säule (3 × 100 mm, 2,6 μm), Strata SPE-Kartuschen (6 ml, 200 mg) und Spritzenfilter aus regenerierter Cellulose (RC) (15 mm, 0,45 μm) wurden von Phenomenex (Utrecht, Niederlande) bezogen. Die Supelco Ascentis Express C-18, Cyano (ES-CN) und Phenyl-Hexyl HPLC-Säulen (2,1 × 100 mm, 2,7 μm) wurden von Sigma Aldrich bezogen. Die für die Methodenentwicklung verwendeten Standardtoxinproben wurden von Biogenuix (LKT laboratories, Inc., New Delhi, Indien) erworben. Die Proben wurden bis zur Analyse bei -20 °C gelagert.

Probenextraktion

Die Proben für die Extraktion der Rohmetaboliten wurden durch Säulenchromatographie gereinigt, die Fraktionen wurden eluiert und in Methanol aufgelöst. 50 ml der Probe jeder Fraktion wurden in 50-ml-Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen (PP) gemischt, die dann verschlossen wurden. Die Proben wurden 5 Sekunden lang vortex-gemischt und 45 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem CAT S50-Schüttler mit einer Geschwindigkeit von 600 min-1 horizontal geschüttelt. Anschließend wurden die Röhrchen bei 5.000 U/min für 10 min bei 20 °C zentrifugiert und die obere Schicht in einem neuen 50-ml-PP-Zentrifugenröhrchen aufgefangen. 100 μl Derivatisierungsreagenz (0,596 % DNPH in 2 mol/lit HCl) wurden der Probe zugesetzt und 5 Sekunden lang mit dem Vortex gemischt. Die Probe wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur derivatisiert. Anschließend wurden 500 μl Stoppreagenz, 5% (v/v) Undecanal in Methanol, zugegeben und 5 Sekunden lang vortex-gemischt. Die Probe wurde 30 Minuten lang stehen gelassen und dann im PP-Röhrchen mit 50 mM Ammoniumformiatpuffer (pH 4, eingestellt mit Ameisensäure) auf 35 ml verdünnt. Die Probe wurde bei 5.000 rpm für 10 min bei 20 °C zentrifugiert und einer Festphasenextraktionsreinigung unterzogen.

Festphasenextraktionsreinigung

Strata-XL (200 mg, 6 ml, 100 μm) Kartuschen wurden mit 6 ml Methanol, gefolgt von 6 ml Wasser und 6 ml 50 mM Ameisenpuffer konditioniert. 75-ml-Reservoirs wurden an die Kartuschen angeschlossen und die Proben in die Reservoirs gefüllt. Dann wurden die Proben tropfenweise weitergegeben. Anschließend wurden die SPE-Säulen mit 6 ml Methanol-Wasser (15/85, v/v) und anschließend mit 6 ml n-Hexan gewaschen. Die Kartuschen wurden 5 Minuten lang im Vakuum getrocknet, bevor die Proben mit 5 ml Methanol in Glasröhrchen eluiert wurden. Die Proben wurden bei 45 °C unter leichtem Stickstoffstrom zur Trockne eingedampft und durch 20 Sekunden langes Vortex-Mischen in 250 μl Methanol wieder aufgelöst. In einem letzten Schritt wurden die Proben durch regenerierte Zellulosefilter in HPLC-Fläschchen filtriert.

Instrumentierung und Ausrüstung

Die Methodenentwicklung wurde mit einem Ascentis Express C-18 (2,1 × 100 mm, 2.7 μm) UPLC LG 500 nm System (Accucore RP-MS 100 × 3.0 MM, 2.6UM, ACQ-TQD-QBB1152, Waters acuity PDA Detektor, Waters Corporation, Milford, MA, USA) gekoppelt an einen MassLynx Triple Quadrupol MS Detektor (Waters, Milford, MA, USA). Die Datenerfassung und -auswertung erfolgte mit MassLynx Version 4.0. Die endgültige Methode wurde auch auf ein Thermo ACQ-TQD Quantum Ultra LC-MS/MS-System (Thermo Finnigan, San Jose, CA, USA) übertragen, das eine Waters acquity QSM Binärpumpe (SN-L10QSM943A), einen Waters acquity fin Autosampler (SN-M10SDI443M), einen Säulenthermostat und einen TQD Quantum Ultra Triple Quadrupol MS-Detektor umfasste. Zielsäulentemperatur und Zielprobentemperatur betrugen 30 °C bzw. 10 °C. Die Datenerfassung und -auswertung erfolgte mit der Software Xcalibur 2.0.7. SP1. Beide Systeme waren mit einer Elektrospray-Schnittstelle (ESI) ausgestattet, bei der während der Akquisition ausschließlich negative Ionisierung verwendet wurde. Stickstoff wurde als Trocknungs- und Kollisionsgas verwendet. Die Parameter der Ionenquellen sind in der ergänzenden Tabelle S2 zusammengefasst. Außerdem wurde die Übertragbarkeit der Methode mit einem LC-MS/MS-System untersucht, das aus einer Agilent 1100 HPLC besteht, die mit einem AB Sciex 4000 Triple-Quadrupol-MS (Framingham, MA, USA) gekoppelt ist.

Instrumentenbedingungen

Die Alternaria-Toxine werden auf einer Ascentis Express C-18 (2,1 × 100 mm, 2,7 μm) UPLC-Säule mit einer 2,1 mm C-18-Vorsäule unter Verwendung einer linearen Gradientenelution getrennt. Vier Lösungsmittel (Lösungsmittel A, B, C und D) wurden von der binären Pumpe gemischt. Das Lösungsmittel A enthielt Acetonitril (ACN) + Wasser (5:95), Lösungsmittel B enthielt ACN: 5% Isopropylalkohol (IPA), Lösungsmittel C enthielt 100% Methanol und Lösungsmittel D enthielt reines Ammoniumacetat. Die Durchflussrate betrug 0,5 ml/min. Die mobile Phase der Lösungsmittel betrug zu Beginn 0,0 % A, 30 % B, 30 % C und 40 % D. Zum Schluss (5 Minuten) waren die Lösungsmittel 0,0 % A, 30 % B, 30 % C und 40 % D. Ein ausreichender Waschschritt im Gradientenprogramm war notwendig, um die angesammelten lipophilen Matrixlösungsmittel zu entfernen. Die Gesamtanalysezeit betrug 5 Minuten. Der Säulenthermostat hielt die Temperatur bei 30 °C, das Injektionsvolumen betrug 1,0 μl. Der Autosampler wurde bei 20 °C betrieben.

Das UPLC LG 500 nm-System wurde über eine Elektrospray-Schnittstelle (ESI), die im negativen Modus arbeitet, mit einem MS/MS-Detektor (Micromass Quattro Ultima PT) gekoppelt. Die optimierten ESI-Einstellungen waren wie folgt: Quelltemperatur 120 °C, Desolvatisierungstemperatur 350 °C, Trocknungsgasfluss 650 L/Std., Kegelgasfluss 30 L/Std. und Kapillarspannung 3,50 kV. Als Trocknungs- und Kollisionsgas wird Stickstoff verwendet (2,67 × 10-6 bar). Während der Detektion wurde im MS der MRM-Modus (Multiply Monitoring Reaction) angewendet, und für jedes Zieltoxin wurden zwei Ionenübergänge gescannt. Im MS/MS-Detektor wurde der MRM-Modus angewandt, und für jede Zielverbindung wurden zwei Ionenübergänge (Quantifizierer und Qualifizierer) aufgezeichnet. Die ausgewählten Ionenübergänge mit den optimierten Spannungen (Kegel- oder Röhrenlinse), Kollisionsenergien (CE) und Verweilzeiten sind in der Tabelle (Supplementary Table S2) zusammengefasst.

Bewertung des toxikologischen Potenzials verschiedener Alternaria-Mykotoxine (TeA, AOH und AME)

Die Messung des Ausmaßes des durch verschiedene Mykotoxine induzierten Zelltods wurde mit der Methode der abgetrennten Blattinokulation bestimmt. Dazu wurden frische Blattproben von den im Gewächshaus gezogenen Pflanzen abgetrennt und 3 bis 4 Minuten lang in fließendem Leitungswasser gewaschen, etwa 1 Minute lang in 1,0 % (0,01 g/ml) Natriumhypochlorit sterilisiert, dann die Oberfläche mit 70 %igem Ethanol abgewischt und schließlich gründlich mit sterilem destilliertem Wasser aseptisch abgespült. Schließlich wurden die Blätter auf angefeuchtetes Filterpapier gelegt und mit einer sterilen Nadel an der Unterseite durchstochen. Die Toxine wurden in sterilem deionisiertem Wasser in einer Konzentration von 100 μg/ml aufgelöst. Tropfen (100 µl) jedes der drei Toxine wurden mit einer feinen Nadel (Dispovan, 1 ml) auf die verwundeten Blätter gespritzt. Eine Kontrollprobe wurde durch Injektion von sterilem destilliertem Wasser eingestellt. Die behandelten Blattproben wurden in einer feuchten Kammer (Temperatur 27 ± 0,5 °C und 60 % relative Luftfeuchtigkeit) unter Gewächshausbedingungen (14 Stunden Licht- und 10 Stunden Dunkelheit bei 27 °C) gehalten. Es wurde eine regelmäßige Beobachtung (alle 24 Stunden für 6 Tage) durchgeführt, um alle Veränderungen festzustellen, die für die toxikologischen Wirkungen relevant sind, die bei den injizierten Proben im Vergleich zu den Kontrollproben auftreten. Der Versuchsaufbau wurde in drei Wiederholungen beibehalten, und der Prozentsatz der betroffenen Blattfläche aufgrund des toxisch induzierten Zelltods wurde mit einem Systronic Blattflächenmessgerät (211) gemessen und nach der folgenden Formel berechnet.

Bestimmung des Zelltods durch Evans-Blau-Aufnahme-Assay

Der Verlust der Zelllebensfähigkeit (Zelltod) wurde mit der Evans-Blau-Färbemethode (Baker und Mock, 1994) bewertet. Die Tomatenblätter wurden mit der gleichen Konzentration (250 μg/ml) aller drei Toxine behandelt. Die behandelten Blätter wurden 15 Minuten lang mit einer 0,25%igen (v/v) wässrigen Lösung von Evans-Blau gefärbt. Nach 30-minütigem Waschen mit destilliertem Wasser wurden die Blätter herausgeschnitten und mit 500 µl N,N-Dimethylformamid für 1 Stunde bei Raumtemperatur getränkt. Die optische Dichte des freigesetzten Evans-Blaus wurde spektrophotometrisch bei 600 nm gemessen.

Statistische Analyse

Die statistische Analyse wurde mit der IBM SPSS Statistics ver. 20 Software mittels Varianzanalyse (einseitige ANOVA) und anschließendem Duncan’s multiple range test auf dem Signifikanzniveau P ≤ 0,05 durchgeführt. Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) von mindestens drei Wiederholungen für jeden Metaboliten angegeben. Die statistischen Datenanalysen wurden bei 48 ausgewählten Isolaten von Alternaria-Arten, die von Natur aus pathogen sind, analysiert.