Komplexe Struktur von Arrestin-2, das an einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor gebunden ist

Funktionelle Charakterisierung und Strukturbestimmung des Arr2-NTSR1-Komplexes

Die Wechselwirkung von Arrestinen mit nicht sichtbaren GPCR ist relativ schwach und hochdynamisch, aber die Erlangung eines stabilen Komplexes ist ein wesentlicher Schritt für Strukturstudien. Daher haben wir vor unseren Strukturstudien die Interaktion von NTSR1 mit Arrestinen mit Hilfe des kommerziellen NanoBiT-Systems charakterisiert, einer effektiven Methode zum Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen.17 Es wurde festgestellt, dass NTSR1 sowohl mit Arr2 als auch mit Arr3 interagiert, was durch die erhöhten Konzentrationen des Peptidagonisten Neurotensin (NTS) verstärkt wird. Arrestin-Mutanten, bei denen drei C-terminale hydrophobe Reste zu Alanin mutiert sind (3 A-Mutanten; I386A, V387A und F388A in Arr2 und I387A, V388A und F389A in Arr3),18,19 die als voraktivierte Form der Arrestine bekannt sind, zeigten eine erhöhte Bindungsaktivität an NTSR1 (Abb. 1b).

Weiterhin testeten wir die Interaktion zwischen Arrestin und NTSR1 mit dem Tango-Assay, einem zellbasierten Assay, der die Bindungsaktivitäten von Membranproteinen an lösliche Bindungspartner bestimmt.7,20 Unsere Tango-Assays zeigten, dass die Bindungsaktivität von NTSR1 an Arr2 um das Zwei- bzw. Dreifache erhöht wurde, wenn der Peptidagonist NTS oder der niedermolekulare Agonist ML314, ein bekannter positiv-allosterischer Modulator (PAM),21,22 hinzugefügt wurde. Die Bindungsaktivität von Arr2 an NTSR1 wurde um etwa das Vierfache erhöht, wenn sowohl NTS als auch ML314 verwendet wurden. Die Bindung von NTSR1 an Arr2 wurde durch die Einführung von 3A-Mutationen weiter verstärkt (Abb. 1c).

Auf der Grundlage der obigen Ergebnisse führten wir Strukturstudien mit der 3A-Mutante von Arr2 im Komplex mit NTSR1 in Gegenwart von NTS und ML314 durch, aber der Komplex dissoziierte in Kryo-EM-Gittern aufgrund der nachteiligen Auswirkungen, die mit der Vitrifizierung der Proben verbunden sind. Um dieses Dissoziationsproblem zu überwinden, fusionierten wir den Wildtyp des menschlichen NTSR1 mit der menschlichen 3A-Mutante Arr2 an seinem C-Terminus mit einem Drei-Aminosäure-Linker (GSA). Die Cytochrom b562 RIL-Domäne (BRIL) wurde ebenfalls an den N-Terminus des Rezeptors fusioniert, um die Expression des Komplexes zu erhöhen. Arr2 wurde weiter stabilisiert, indem die leichte Kette Fab30, ein Antikörperfragment zur Stabilisierung der aktiven Form von Arr2,23 an seinem C-Terminus mit einem 12-Aminosäure-Linker (GSAGSAGSAGSA) fusioniert wurde. Das Konstrukt des Fusionskomplexes wurde zusammen mit der His8-markierten schweren Kette Fab30 und einer GPCR-Kinase, GRK5, exprimiert, die den Rezeptor phosphoryliert, um eine bessere Arrestinbindung zu erreichen. Das Komplexprotein wurde mit Hilfe einer Nickel-Affinitätssäule in Gegenwart von 2 µM NTS und 10 µM ML314 gereinigt, anschließend konzentriert und für Strukturuntersuchungen durch Gelfiltrationschromatographie weiter gereinigt (Abb. 1d, e, siehe Abschnitt „Materialien und Methoden“).

Das gereinigte BRIL-NTSR1-Arr2-Fab30-Komplexprotein wies eine relativ hohe Schmelztemperatur (Tm) von 58 °C auf, die durch einen Thermostabilitätsverschiebungstest24 bestimmt wurde (Abb. 1f). Bei der Inspektion durch EM mit negativer Färbung zeigte es eine gleichmäßige Verteilung (Abb. 1g). Die Kryo-EM-Daten einzelner Partikel wurden mit einem FEI Titan Krios Mikroskop aufgenommen. Insgesamt wurden 17 206 Mikroaufnahmen gemacht, und über 5 Millionen komplexe Partikel wurden für die weitere Datenverarbeitung ausgewählt und sortiert. Bei der 2D-Klassifizierung wurden mehrere Konformationen komplexer Partikel identifiziert. Nach intensiver 3D-Klassifizierung wurden 220 464 Partikel (~ 4,5 % der gesamten Ausgangspartikel) für die Strukturrekonstruktion ausgewählt (ergänzende Informationen, Abb. S1). Die Dichtekarte zeigte eine durchschnittliche Auflösung von 4,8 Å, bestimmt durch das Kriterium der Fourier-Shell-Korrelation (FSC) von 0,143, wobei die Kernstruktur, bestehend aus Arr2 und der variablen Fab-Region (Fv), einen Auflösungsbereich von bis zu 4,5 Å aufweist (Abb. 2a und ergänzende Informationen, Abb. S1, S2). Die Konformationsheterogenität zwischen NTSR1 und Arr2 ist jedoch immer noch vorhanden, wie die Mehrkörperanalyse zeigt (ergänzende Informationen, Abb. S3), obwohl nur ein sehr geringer Teil des gesamten Datensatzes für die endgültige Rekonstruktion verwendet wurde.

Trotz mäßiger Auflösung ermöglichte die EM-Karte eine klare Bestimmung der Position und Ausrichtung von NTSR1, Arr2 und Fab30 im Komplex (Abb. 2). Das Komplexmodell wurde durch Andocken der Kristallstruktur des NTSR1-NTS-Komplexes (PDB: 4GRV)14 und der Struktur von Arr2, das an das phosphorylierte C-terminale Vasopressin-Peptid (V2Rpp) und Fab30 (PDB: 4JQI)23 gebunden ist, an die Dichtekarte erstellt, gefolgt von einer manuellen Modellanpassung, einer Verfeinerung im realen Raum und iterativen Zyklen der Rosetta-Verfeinerung und des Wiederaufbaus des Modells anhand der EM-Karte.25 Das endgültige Komplexmodell enthält NTSR1-Reste von R49 bis T416, wobei ICL3 (A270 bis P292) und der Linker-Bereich zwischen Helix 8 und dem C-terminalen Schwanz (P384 bis S404) fehlen. Das Modell von Arr2 umfasst die Reste T6 bis M352 und das Modell von Fab30 enthält insgesamt 409 Reste, die sowohl die leichte als auch die schwere Kette des Fabs bilden. Das N-terminal fusionierte BRIL und das kleine Molekül ML314 sind in der Dichtekarte nicht sichtbar und daher auch nicht im Komplexmodell enthalten. Die Statistiken und die Geometrie des Strukturmodells sind in den ergänzenden Informationen, Tabelle S1, zusammengefasst.

Die Gesamtstruktur des Arr2-NTSR1-Komplexes

Der Arr2-NTSR1-Komplex wird durch asymmetrischen Zusammenbau der beiden Komponenten gebildet, wobei die horizontale Achse von Arr2 die innere Oberfläche der Zellmembran in einem Winkel von etwa 20° schneidet, was zu einer Wechselwirkung der hydrophoben C-Kantenschleifen (L191 und M192 sowie L334 bis L338) des Arrestins mit der Zellmembran führt (Abb. 2a, b). Dies stimmt mit der Kristallstruktur des visuellen Arrestin-Rhodopsin-Komplexes überein, die zum ersten Mal die asymmetrische Arrestin-GPCR-Assemblierung zeigte und die Funktion der hydrophoben C-Edge-Schleifen von Arrestin als Membrananker bestätigte, der die Bindung von Arrestin an den in die Membran eingebetteten Rezeptor stabilisiert, was später auch experimentell bestätigt wurde.7,26,27 Die Interaktion der hydrophoben C-Edge-Schleifen von Arr2 mit der Zellmembranschicht legt nahe, dass die Fähigkeit zur Lipidbindung eine allgemeine Eigenschaft der Mitglieder der Arrestin-Familie ist.

Trotz der Ähnlichkeit des asymmetrischen Aufbaus des Arr2-NTSR1-Komplexes mit dem des Arr1-Rhodopsin-Komplexes ist die relative Ausrichtung von Arrestin zum Rezeptor bei diesen beiden Arrestin-Rezeptor-Komplexen sehr unterschiedlich. Die Überlagerung der Rezeptor-TMDs dieser beiden Komplexe zeigt, dass die Ausrichtung von Arr2 um 90° um die Transmembranachse gegenüber der des visuellen Arrestins gedreht ist (Abb. 2c). In dieser neuen Ausrichtung sind die Positionen von ICL3 und sowohl TM5 als auch TM6 des Rezeptors auf die N-terminale Domäne von Arr2 gerichtet, was es ICL3 ermöglicht, dem C-terminalen Schwanz zu ähneln, um mit der N-Domäne von Arr2 zu interagieren (Abb. 2b).

Um die Konformationsstabilität des Komplexes zu beurteilen, führten wir sechs unabhängige, zwei Mikrosekunden lange molekulardynamische Simulationen des Arr2-NTSR1-Komplexes ohne das stabilisierende Fab30 durch. Während des gesamten Simulationsverlaufs blieb die C-Kantenschleife L334 bis L338 mit den Membranlipiden assoziiert und der C-terminale Schwanz von NTSR1 blieb in Wechselwirkung mit der N-terminalen Domäne von Arr2 (ergänzende Informationen, Abb. S4 und S5). Die Arrestin-Kernstruktur kann jedoch in begrenztem Umfang um die Kryo-EM-Struktur rotieren, und die verlängerte Fingerschleife kann sich vom NTSR1-TMD-Kern lösen (ergänzende Informationen, Abb. S5). Diese Simulationsdaten deuten darauf hin, dass sowohl die Fingerschleife als auch die Kernschnittstelle zwischen Arr2 und dem Rezeptor hochdynamisch sind und dass der Aufbau des Arr2-NTSR1-Komplexes, der von der Kryo-EM-Struktur erfasst wird, wahrscheinlich einen von vielen Konformationszuständen darstellt, was mit der Tatsache übereinstimmt, dass die konformationelle Heterogenität des Arr2-NTSR1-Komplexaufbaus in den Partikeln der 3D-Klasse, die in der endgültigen Kryo-EM-Rekonstruktion verwendet wurde, noch vorhanden ist (ergänzende Informationen, Abb. S3).

Die Arr2-NTSR1-Kernschnittstelle

Der Arr2-NTSR1-Komplex wird durch intermolekulare Wechselwirkungen zusammengesetzt, die aus zwei getrennten Hauptschnittstellen bestehen: eine Kernschnittstelle, die aus zwei getrennten Bereichen zwischen den zentralen Crest-Schleifen von Arrestin und der intrazellulären Seite des Rezeptor-TMD besteht, und eine Schwanzschnittstelle zwischen der N-terminalen Domäne von Arr2 und dem C-terminalen Rezeptorschwanz (Abb. 2b). Ein Teil der Kernschnittstelle zwischen Arr2 und NTSR1 ist die Fingerschleife (von E66 bis L71) des Arrestins, die in den intrazellulären Hohlraum der Rezeptor-TMD eingefügt und von ICL1, ICL2, TM5 und 6 des Rezeptors umgeben ist (Abb. 3a). In dieser Konfiguration bildet die Oberseite der Fingerschleife eine direkte Schnittstelle mit der Windung zwischen TM7 und Helix 8 des Rezeptors (Abb. 3a).

Um die Schnittstelle der Komplexstruktur zu validieren, führten wir zellbasierte Disulfidvernetzungsexperimente durch. In dieser Versuchsreihe wurden ortsspezifische Cysteinreste an der Schnittstelle von Arr2 und NTSR1 eingeführt. Die beiden Proteine mit den Cysteinmutationen wurden in Zellen als separate Proteine gemeinsam exprimiert. Die Vernetzungsprodukte wurden durch Behandlung der Zellen mit einem oxidierenden Reagenz gebildet und mittels SDS-PAGE und anschließendem Western Blotting überwacht, um den Flag-Tag, der an den C-Terminus von Arr2 fusioniert war, nachzuweisen. Die gleiche Methode wurde zur Validierung der visuellen Arrestin-Rhodopsin-Komplex-Schnittstelle verwendet.7,9 Es wurden Vernetzungsreaktionen mit insgesamt 177 Rückstandspaaren durchgeführt, von denen wir starke Vernetzungssignale zwischen den Arr2-Rückständen D67 und L68 im zentralen Bereich der Fingerschleife und den NTSR1-Rückständen V367 bis N370 an der Windung zwischen TM7 und Helix 8 beobachteten (Abb. 3b, und die Positionen dieser Schnittstellenrückstände sind in Abb. 3a als Kugeln dargestellt). Im Vergleich dazu zeigte der Rest L71 am C-terminalen Ende der Fingerschleife kein oder nur ein sehr schwaches Vernetzungssignal mit diesen NTSR1-Resten (Abb. 3a, b). Mehrere Reste der Fingerschleife vernetzten sich auch mit Resten an ICL1 (Q98) und TM6 (R294 und A297), die Bestandteile des intrazellulären Hohlraums der Rezeptor-TMD sind (ergänzende Informationen, Abb. S6). Diese Quervernetzungsdaten bestätigten die Grenzfläche zwischen der Arr2-Fingerschleife und dem Rezeptor und zeigten, dass die Arrestin-Fingerschleife als Schlüsselkomponente der Kerngrenzfläche dieses Arr2-GPCR-Komplexes dient.

Die Aminosäuresequenzen der Arr2-Fingerschleife sind mit sauren Resten angereichert, ähnlich wie die des visuellen Arrestins (Abb. 3c), von dem bekannt ist, dass es an den positiv geladenen TMD-Hohlraum bindet.7 Wenn NTSR1 und Rhodopsin übereinander gelegt werden, nimmt die Fingerschleife von Arr2 denselben Raum ein wie die entsprechende Region des visuellen Arrestins, aber sie dringt nicht so tief in die TMD-Kavität ein wie das visuelle Arrestin (Abb. 3d), was darauf hindeutet, dass die Assoziation der Arr2-Fingerschleife mit der intrazellulären Kavität der NTSR1-TMD dynamischer sein könnte als die zwischen visuellem Arrestin und Rhodopsin.

Die andere Stelle der Kernschnittstelle zwischen Arr2 und NTSR1 ist die Interaktion der Crest-Regionen von Arr2 mit ICL1 und ICL2 des Rezeptors, die sich von der im visuellen Arrestin-Rhodopsin-Komplex unterscheidet. Im Gegensatz zu den ähnlichen Orientierungen der Fingerschleifen der beiden Arrestine hat die Überlagerung der beiden Rezeptoren dazu geführt, dass die Kernstrukturen der Arrestine in zwei Orientierungen vorliegen, die sich um einen Winkel von etwa 90° unterscheiden, wie in Abb. 2c gezeigt. Die unterschiedlichen Orientierungen der Kernstrukturen von Arr2 und des visuellen Arrestins in ihren GPCR-Komplexen führen zu unterschiedlichen Bindungsmodi der Crest-Regionen der Arrestine mit den intrazellulären Schleifen der Rezeptoren, insbesondere ICL1 und ICL2, in diesen beiden Arrestin-GPCR-Komplexen (Abb. 2c und 4).

Der strukturelle Vergleich von NTSR1 und Rhodopsin zeigt, dass sie eine konservierte TMD-Konformation aufweisen, wobei ihr ICL1 eine verlängerte Schleife und ICL2 eine kurze Helix in ihren jeweiligen an Arrestin gebundenen Komplexen bildet. Die ICL2-Helix von Rhodopsin ist in den Spalt eingefügt, der durch die mittlere Schleife, die untere Schleife und die Lariat-Schleife des visuellen Arrestins gebildet wird (als MBL-Spalt bezeichnet).7 Der gleiche MBL-Spalt in Arr2 wird jedoch aufgrund der unterschiedlichen Ausrichtung des Arrestins von der ICL1 von NTSR1 besetzt (Abb. 4a). Dementsprechend ist ICL2 von NTSR1 von der MBL-Spalte weggedreht, um sich an der Spitze der Lariat-Schleife zu positionieren (Abb. 4a). Disulfidvernetzungsexperimente zeigten Vernetzungssignale zwischen den Rezeptorresten L94 bis S96 auf ICL1 von NTSR1 und dem Rest G286 an der unteren Schleife von Arr2, was mit der Schnittstelle von ICL1 von NTSR1 mit dieser Kammregion von Arr2 übereinstimmt (Abb.

ICL3 des Rezeptors ist zwar in der Dichtekarte nicht sichtbar, bildet aber wahrscheinlich eine Schnittstelle mit der N-Domäne von β-Arrestin, basierend auf der Arr2-NTSR1-Komplexkonformation (Abb. 2b). Disulfidvernetzungsdaten zeigten, dass die ICL3-Reste Q275, C277, T278 und V279 von NTSR1 mit den Resten T56, T58, V81 und N83 an der oberen Oberfläche der Arr2-N-Domäne vernetzt sind (Abb. 4c und ergänzende Informationen, Abb. S6). Diese ICL3-Reste zeigten auch starke Vernetzungssignale mit dem Arr2-Rest K160 (Abb. 4d). Zusätzliche Disulfidvernetzungssignale wurden zwischen den meisten Resten von Q273 bis G280 des NTSR1 ICL3 und dem Rest P14 von Arr2 beobachtet (Abb. 4d). Diese Quervernetzungsdaten deuten darauf hin, dass ICL3 des Rezeptors nahe der N-Domäne positioniert ist und mit Resten an der N-Domänenoberfläche von Arr2 interagieren kann (Abb. 4e).

Die Arr2-NTSR1-Schwanzschnittstelle

Während die Arr2-NTSR1-Kernschnittstelle hochdynamisch ist, scheint die Schwanzschnittstelle zwischen dem C-terminalen Schwanz von NTSR1 und der N-Domäne von Arr2 derjenigen im visuellen Arrestin-Rhodopsin-Komplex9 zu ähneln (Abb. 5). Wir beobachteten die Elektronendichte auf einem Konturenniveau von 0,016 (bei dem die Dichte der Gesamtkomplexstruktur richtig dargestellt werden kann) von etwa zehn C-terminalen Schwanzresten von NTSR1, die an den ersten β-Strang von Arr2 binden (Abb. 5a). Detaillierte Informationen über diese Region des C-terminalen Schwanzes, einschließlich seiner spezifischen Reste, sind jedoch aufgrund der begrenzten Auflösung der Dichtekarte schwer zu erkennen. Analysen des NTSR1-Arr2-Fab30-Fusionsproteins durch Massenspektrometrie (Abb. 5b und ergänzende Informationen, Abb. S7) ergaben, dass sieben Serin- oder Threoninreste von S401 bis T416 am C-terminalen Schwanz von NTSR1 phosphoryliert waren, was auf eine mögliche Beteiligung dieser Region an der Bindung an die positiv geladene Oberfläche der N-Domäne von Arrestin hindeutet. Disulfidvernetzungsexperimente zeigten, dass der Arr2-Rest P14 an der C-terminalen Windung des ersten β-Strangs stark mit den Rezeptorresten H406 bis S410 vernetzt war (Abb. 5d und ergänzende Informationen, Abb. S6), was darauf hindeutet, dass die Rezeptorreste C-terminal zu H406 wahrscheinlich die Region sind, die an die Arrestin-N-Domäne bindet (Abb. 5c).

Ein Modell für die Arr3-GPCR-Interaktion

Das menschliche Genom enthält zwei Subtypen von β-Arrestin: Arr2 und Arr3, die über 53% Sequenzidentität teilen, aber sowohl einige überlappende als auch einige divergierende Funktionen haben. Da Arr3 eine ähnliche NTSR1-Bindungsaffinität wie Arr2 zeigte (Abb. 1b), wollten wir testen, ob der Bindungsmodus von Arr3 an NTSR1 mit dem von Arr2 konserviert ist. Unsere Disulfidvernetzungsexperimente zeigten, dass die Arr3-Fingerschleifenreste E67 bis L72 (entsprechend E66 bis L71 von Arr2) mit der entsprechenden Gruppe von Resten (A369 und N370) an der Drehung zwischen TM7 und Helix 8 von NTSR1 vernetzt waren (ergänzende Informationen, Abb. S8), was auf eine konservierte Fingerschleifenschnittstelle mit TM7 und H8 des Rezeptors zwischen diesen beiden β-Arrestinen hinweist.

Zusätzlich zeigten Disulfidvernetzungsdaten, dass der Arr3-Rest P15 (entspricht P14 von Arr2) mit den Resten N405 bis T407 des C-terminalen Rezeptorschwanzes vernetzt ist, was auf eine ähnliche Schwanzschnittstelle zwischen Arr3 und NTSR1 hindeutet (ergänzende Informationen, Abb. S8). Ähnliche Vernetzungsmuster zwischen den ICL3-Resten von NTSR1 und den N-Domänen-Resten von Arr3, einschließlich P15 am C-Terminus des ersten β-Stands und K161 (entspricht K160 von Arr2) an der Schleife zwischen den oberen β-Strängen wurden ebenfalls beobachtet (ergänzende Informationen, Abb. S8). Zusammengenommen deuten diese Vernetzungsdaten darauf hin, dass die Gesamtanordnung von Arr3 mit NTSR1 ähnlich ist wie die von Arr2 mit NTSR1 in dieser Core-Engaged-Konfiguration.

Ein Modell für die β-Arrestin-Rekrutierung durch 5-HTR1A und 5-HTR1B

Viele GPCRs, darunter die Serotoninrezeptoren 5-HTR1A und 5-HTR1B sowie mehrere Dopaminrezeptoren, haben entweder keinen oder einen sehr kurzen C-terminalen Schwanz, und es wird angenommen, dass sie ihr ICL3 als alternative Schnittstelle zur Rekrutierung von β-Arrestinen nutzen.28 5-HTR1A und 1B haben lange ICL3s mit mehreren Phosphorylierungsstellen für eine potenzielle Interaktion mit positiv geladenen N-Domänen von β-Arrestinen. Unsere biochemischen Bindungsversuche zeigten, dass beide Rezeptoren an Arr2 und 3 mit ähnlicher Aktivität wie NTSR1 an Arr2 gebunden haben (ergänzende Informationen, Abb. S9). Wenn jedoch die Struktur des visuellen Arrestin-Rhodopsin-Komplexes als Vorlage verwendet wurde, war es schwierig, den Bindungsmodus des phosphorylierten ICL3 von 5-HTR1A oder 1B an den positiv geladenen Spalt auf der N-Domäne der β-Arrestine zu modellieren. Das liegt daran, dass TM5 und 6 sowie ICL3 von Rhodopsin in der Struktur des visuellen Arrestin-Rhodopsin-Komplexes an der gegenüberliegenden Seite der positiv geladenen Oberfläche der N-Domäne des Arrestins positioniert sind.

Die Struktur des Arr2-NTSR1-Komplexes zeigt jedoch einen anderen Komplexaufbau, bei dem Arr2 um 90° gegenüber der Position des visuellen Arrestins im Arrestin-Rhodopsin-Komplex gedreht ist (Abb. 2c). TM5 und TM6 von NTSR1 befinden sich daher oberhalb der vorderen Oberfläche der N-Domäne von Arr2 und ermöglichen es ICL3 des Rezeptors (in der Struktur nicht sichtbar), die positiv geladene N-Domäne von Arr2 zu erreichen (Abb. 4e). Unsere Daten zur Disulfidvernetzung belegen, dass NTSR1 ICL3 mit dem positiv geladenen Spalt der N-Domäne von Arr2 und 3 interagieren kann (Abb. 4c-e, ergänzende Informationen, Abb. S6 und S8). Daher kann die Struktur des Arr2-NTSR1-Komplexes als geeignete Vorlage für die Modellierung der Schnittstelle von β-Arrestinen mit 5-HTR1A und 5-HTR1B dienen.

Unter Verwendung der Arr2-NTSR1-Struktur als Vorlage und der Kristallstruktur von Ergotamin-gebundenem 5-HTR1B als Ausgangsmodell für 5-HTR1B (PDB: 4IAR),29 erstellten wir ein Arr2-5-HTR1B-Komplex-Homologiemodell, bei dem die Kernschnittstelle zwischen Arr2 und 5-HTR1B der des Arr2-NTSR1-Komplexes ähnelt (Abb. 6a, b). Anschließend führten wir Disulfidvernetzungsexperimente durch, um den im Homologiemodell gezeigten Komplexaufbau von Arr2-5-HTR1B zu testen (Abb. 6c und ergänzende Informationen, Abb. S10).

Wir beobachteten Vernetzungssignale zwischen den Fingerschleifenresten D67, L68, V70 und L71 von Arr2 und den Resten N373, E374 und D375 an der Windung zwischen TM7 und Helix 8 von 5-HTR1B (Abb. 6c). Die Reste D67, L68, V70 und L71 der Fingerschleife vernetzten sich mit den Rezeptorresten R308 und K311 an der inneren Oberfläche von TM6 (ergänzende Informationen, Abb. S10). Diese Quervernetzungsdaten unterstützen einen konservierten Bindungsmodus der Arr2-Fingerschleife mit dem intrazellulären Hohlraum der 5-HTR1B-TM-Domäne (Abb. 6a, b). Disulfidvernetzungsdaten zeigten auch Vernetzungssignale zwischen den Arr2-Resten R285 und G286 in der unteren Schleife von Arrestin und dem ICL1-Rest K79 von 5-HTR1B (Abb. 6c und ergänzende Informationen, Abb. S10). Diese spezifische Vernetzung stimmt nur mit der Arrestin-Orientierung im Arr2-NTSR1-Modell überein, ist aber nicht mit dem visuellen Arrestin-Rhodopsin-Komplex vereinbar. Zusammengenommen unterstützen diese Vernetzungsdaten eine Kernschnittstelle zwischen der Arr2-Kammregion und der intrazellulären Seite der 5-HTR1B-TM-Domäne, die mit derjenigen im Arr2-NTSR1-Komplex konserviert ist (Abb. 6a-c).

5-HTR1B enthält mehrere Serin- und Threoninreste im zentralen Bereich seiner langen ICL3, die für die Bindung an die Oberfläche der positiv geladenen Arrestin-N-Domäne phosphoryliert werden können (Abb. 6d). Wir entwarfen Cysteinpaar-Mutationen in der potenziellen Schnittstelle zwischen ICL3 des Rezeptors und der N-Domäne von Arr2 und fanden heraus, dass die ICL3-Reste T268, S295, L298 und E300 mit Resten an der Oberfläche des oberen β-Faltblattes vernetzt waren, einschließlich T56, V81, N83, K147 und K157 von Arr2 (Abb. 6e und ergänzende Informationen, Abb. S10). Die Reste S260 und T268 auf ICL3 zeigten Vernetzungssignale mit den Resten K11 auf dem ersten β-Strang und N15 auf der Windung nach dem ersten β-Strang von Arr2 (Abb. 6e und ergänzende Informationen, Abb. S10). Der Rest S260 befindet sich in der Nähe des C-terminalen Endes von TM5, und seine Vernetzung mit K11 auf der positiv geladenen Seite der N-Domäne von Arr2 ist nur in der Arr2-NTSR1-Orientierung möglich, nicht aber in der visuellen Arrestin-Rhodopsin-Orientierung, da in der Struktur des visuellen Arrestin-Rhodopsin-Komplexes sowohl TM5 als auch 6 des Rezeptors an der Rückseite der positiv geladenen Oberfläche der Arrestin-N-Domäne positioniert sind.

Wir beobachteten auch ein nahezu identisches Arr2-Vernetzungsmuster zwischen 5HTR1A und 5-HTR1B. Vernetzungssignale wurden zwischen den Resten D67, L68, V70 und L71 der Fingerschleife von Arr2 und den Resten N404, K405 und D406 (entsprechend N373, E374 und D375 von 5-HTR1B) an der Windung zwischen TM7 und Helix 8 von 5-HTR1A beobachtet (ergänzende Informationen, Abb. S11). Die Reste D67 und L68 der Fingerschleife waren auch mit den Rezeptorresten R339 und K342 (entsprechend R308 und K311 von 5-HTR1B) an der inneren Oberfläche von TM6 vernetzt (ergänzende Informationen, Abb. S11). Außerdem beobachteten wir eine Disulfidvernetzung zwischen den Resten R285 und G286 der unteren Schleife von Arr2 und dem ICL1-Rest L67 von 5-HTR1A (entspricht K79 von 5-HTR1B) (ergänzende Informationen, Abb. S11). Diese Vernetzungsdaten unterstützen eine ähnliche Kernschnittstelle zwischen Arr2 und 5-HTR1A und 5-HTR1B, die mit der im Arr2-NTSR1-Komplex konserviert ist (Abb. 6a, c).

Die ICL3 von 5-HTR1A enthält mehr als 100 Aminosäurereste (233 bis 336) mit 12 Serin- oder Threoninresten, die zusammen mit Glutaminsäure- oder Asparaginsäureresten sechs partielle Phosphorylierungscodes bilden (Ergänzende Informationen, Abb. S12). Wir entwarfen Cysteinpaar-Mutationen, um die potenzielle Schnittstelle zwischen ICL3 dieses Rezeptors und der N-Domäne von Arr2 zu kartieren. Crosslinking-Daten zeigten, dass die ICL3-Reste V230, T240, P250, R261, K270 und D285 mit V81 und K160 in der N-Domäne von Arr2 vernetzt sind (ergänzende Informationen, Abb. S11). Der Rest P14 des ersten β-Strangs von Arr2 vernetzte sich stark mit den ICL3-Resten N300, P308, P315, P318, P321 und R323 von 5-HTR1A (Ergänzende Informationen, Abb. S11).Diese Vernetzungsdaten haben zusammen mit dem Homologiemodell des Arr2-5-HTR1B-Komplexes ein Gesamtbild der Rekrutierung von Arr2 durch 5-HTR1A und 5-HTR1B ergeben.

In dieser Arbeit berichten wir über eine Struktur von Arr2 im Komplex mit NTSR1, einem Klasse-A-GPCR, durch Kryo-EM-Einzelpartikelanalyse. Während der Bindungsmodus der Schwanzschnittstelle zwischen dem C-terminalen Schwanz des Rezeptors und der positiv geladenen Arrestin-N-Domäne mit dem des visuellen Arrestin-Rhodopsin-Komplexes konserviert ist, zeigt diese Struktur eine andere Arr2-Orientierung als die des visuellen Arrestin-Rhodopsin-Komplexes. Homologiemodellierung und Disulfidvernetzungs-Schnittstellenkartierung zeigen, dass diese Kernschnittstelle in Arr2-Komplexen mit der 5-HTR1A- und 1B-Unterfamilie konserviert ist. In diesen Komplexmodellen ermöglicht die Ausrichtung von Arr2, dass ICL3 des Rezeptors die Oberfläche der N-Domäne von Arr2 erreicht, was einem GPCR, dem ein C-terminaler Schwanz fehlt, die Möglichkeit gibt, sein ICL3 zur Interaktion mit der N-Domäne von Arr2 zu nutzen. Da Arr2 und Arr3 ubiquitär exprimierte Proteinpartner für die Signaltransduktion vieler nicht-visueller GPCRs sind, haben unsere strukturellen und biochemischen Studien der Arr2-Interaktion mit Mitgliedern der NTSR1- und 5-HTR1-Unterfamilie ein alternatives Modell für das Verständnis der Interaktion von Arr2 und Arr3 mit nicht-visuellen GPCRs geliefert.