Miniatur-Bioreaktoren: aktuelle Praktiken und zukünftige Möglichkeiten

Einführung

Das Aufkommen der Molekularbiologie und der Genmanipulationstechnologie im letzten Vierteljahrhundert hatte dramatische Auswirkungen auf die pharmazeutische/gesundheitliche Industrie, wobei eine große Anzahl der zahlreichen Anwendungen dieser Technologie auf der Fähigkeit beruht, rekombinante Zelllinien zum therapeutischen Nutzen für den Menschen zu erzeugen. Neben der Entwicklung dieser gentechnisch veränderten Organismen besteht nach wie vor die Notwendigkeit, die Produktivität des Wildtyps zu verbessern, das Screening neu entdeckter Mikroben zu beschleunigen und die damit verbundenen Aufgaben wie die Verbesserung des Wachstumsmediums und die Prozessoptimierung weiter voranzutreiben. Traditionell erfordert die Entwicklung von Zellkultivierungsverfahren das Screening einer großen Anzahl von Zelllinien in Schüttelkolbenkulturen und darauf aufbauend die weitere Prüfung erfolgreicher Kandidaten in Tisch-Bioreaktoren vor der Durchführung von Studien im Pilotmaßstab. Die Notwendigkeit, eine große Anzahl von Entwicklungskultivierungen durchzuführen, hat dazu geführt, dass Bioreaktorsysteme im kleinen Maßstab, die eine miniaturisierte HT-Lösung für die Prozessentwicklung bieten, vorangetrieben und immer häufiger eingesetzt werden.

Die wichtigsten Zelltypen, die zur Herstellung therapeutischer Produkte verwendet werden, sind Bakterien- und Säugetierzellen, die jeweils einzigartige Vorteile und Einschränkungen aufweisen, die die Art des für die Prozessentwicklung verwendeten Bioreaktors beeinflussen. Bakterienzellen sind im Allgemeinen robust und nicht anfällig für Scherschäden, was bedeutet, dass stark scherende Radiallaufradsysteme (z. B. Rushton-Turbinen) und hohe Rührgeschwindigkeiten eingesetzt werden können. Dies verleiht solchen Bioreaktoren eine hohe Fähigkeit zum Massentransfer, so dass mikrobielle Zellkulturen mit hoher Zelldichte und schnellem Stoffwechsel unterstützt werden können und die Produktmenge, die solche Bioprozesse liefern können, erhöht wird. Obwohl Säugetierzellen keine schützende Zellwand haben und daher in der Regel scherempfindlicher sind und eine sanftere Handhabung erfordern als ihre bakteriellen Gegenstücke, können die meisten kommerziell genutzten Zelllinien in Rührkessel-Bioreaktoren gezüchtet werden, wenn auch mit konstruktiven Änderungen. So können z. B. anstelle von Rushton-Turbinen Axialimpeller mit geringen Scherkräften verwendet werden, um die Zellen und Nährstoffe in einer schikanenfreien Umgebung schonend umzuwälzen, und den Zellkulturmedien können Scherschutzmittel wie Serum oder Pluronic F-68 zugesetzt werden.

Neben der Entwicklung von therapeutischen Medikamenten können MBRs auch für die Entwicklung von Wachstumsmedien, die Verbesserung von Stämmen durch metabolisches Engineering oder gezielte Evolution und die so genannte Bioprospektion von Naturstoffen eingesetzt werden – alles Prozesse, die mit einem hohen Aufwand an Bioreaktoren verbunden sind, der durch den Einsatz von HT-Miniaturgeräten verringert werden kann. Insbesondere können MBRs den Arbeitsaufwand und die Materialkosten für die große Anzahl von Zellkulturen, die bei der Entwicklung von Bioprozessen erforderlich sind, reduzieren und so den Grad der Parallelität und den erreichbaren Durchsatz erhöhen, und sind daher von wachsendem Interesse. Es ist wichtig, dass solche Geräte, wenn sie für die Prozessentwicklung verwendet werden, Bioreaktoren im Labor- und Pilotmaßstab genau nachahmen, so dass die Wachstumskinetik und die Produktexpression – die im Miniaturmaßstab optimiert wurden – quantitativ hochskaliert werden können.

Während MBRs zweifellos besser für den HT-Betrieb geeignet sind als herkömmliche Bioreaktoren im Labormaßstab, sind sie derzeit typischerweise weniger gut instrumentiert und haben aufgrund der kleinen Volumina (von ca. 0,1 ml bis ca. 100 ml) auch nur begrenzte Möglichkeiten für Offline-Probenahmen; dies bedeutet, dass es derzeit einen Kompromiss zwischen dem Informationsgehalt in Bezug auf Datenqualität und -quantität, die durch Online- und Offline-Messungen aus dem Bioreaktor gewonnen werden, und dem experimentellen Durchsatz gibt, wie in Abbildung 1 dargestellt. Da noch kein Gerät alle Herausforderungen der Miniaturisierung, d. h. der genauen Nachahmung von Prozessbedingungen im großen Maßstab und der Beibehaltung der vollen Funktionalität herkömmlicher Bioreaktoren, gelöst hat, ist es die Absicht der Autoren, die aktuellen Entwicklungen zu überprüfen und dann aufzuzeigen, wo die Technologie in Zukunft wahrscheinlich Fortschritte machen wird, damit die aktuellen HT-Vorteile erweitert und die Informationslücke, die derzeit zwischen Miniatur- und Labor-Bioreaktorplattformen besteht, verringert werden kann. In dieser Übersicht wurden die verschiedenen beschriebenen MBR auf der Grundlage ihrer Rührmethode (d. h. Schütteln, Rühren oder Gasdurchspülung) unter Bezugnahme auf den Typ des herkömmlichen Bioreaktors, den sie entweder nachahmen oder von dem sie abgeleitet sind, gruppiert; die wichtigsten Spezifikationen und Merkmale von Prototypen und kommerziellen Miniatur-Zellkultivierungsgeräten, die für den Parallelbetrieb geeignet sind, sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

Geschüttelte Miniatur-Bioreaktorsysteme

Geschüttelte Systeme werden seit den ersten Versuchen in den 1940er Jahren, antibiotikaproduzierende Mikrobenkulturen zu züchten, in der Bioprozesstechnik eingesetzt. Sie werden in der Industrie und im akademischen Bereich nach wie vor in großem Umfang für die Entdeckung von Arzneimitteln, die Optimierung von Medien, Stämmen und Produkten sowie für die Prozessentwicklung eingesetzt. Es gibt sie in vielen verschiedenen Ausführungen und Volumina, die von Schüttelkolben mit Hunderten von Millilitern bis hin zu Mikrotiterplatten (MTPs) mit wenigen Mikrolitern Volumen reichen.

Schüttelkolben

Seit fünfzig Jahren nutzen Wissenschaftler die Zellkultivierung in Schüttelkolben als Mittel zur Prozessentwicklung im kleinen Maßstab, wobei die Volumina von ca. 10 ml bis 500 ml reichen. Schüttelkolben gibt es in verschiedenen Ausführungen, sie können aus Glas oder Kunststoff hergestellt werden und einige haben Schikanen, um die Belüftung und Durchmischung zu unterstützen. Sie können entweder durch orbitales oder lineares Schütteln geschüttelt werden und in einem temperaturgeregelten Schrank untergebracht werden. Zu den Faktoren, die sich auf die Kultivierung von Schüttelkolben auswirken, gehören die Größe des Gefäßes, das Füllvolumen, das Baumaterial, die Geometrie der Schikanen, die Schüttelfrequenz und die Art des Stopfens, mit dem das Gefäß verschlossen wird. Büchs erklärt, dass Schüttelkolben schätzungsweise für über 90 % aller Kulturexperimente in Industrie und Wissenschaft verwendet werden, um eine breite Palette von Mikroorganismen wie Bakterien, Pilze und Hefen sowie Säugetierzellen zu züchten. Es ist leicht zu erkennen, warum sie so weit verbreitet sind: Sie sind eine kostengünstige und wirksame Methode zur reproduzierbaren Durchführung vieler Arten industriell relevanter Zellkulturen für die Prozessentwicklung. Außerdem sind sie einfach zu bedienen und weitgehend unempfindlich gegenüber mechanischen Komplikationen. Während der langen Zeit ihres Einsatzes gab es kaum nennenswerte Änderungen an der Technologie, keine Online-Überwachung der Kulturen und manuelle Zugaben und Probenahmen. Erst in jüngster Zeit wurden instrumentierte Schüttelkolben eingeführt, mit denen der pH-Wert und die DOT-Werte online gemessen und möglicherweise kontrolliert werden können. pH-Wert und gelöster Sauerstoff können mit einem Rutheniumoxid-Farbstoff gemessen werden, der in Gegenwart von Wasserstoffionen bzw. Sauerstoff quantifizierbar fluoresziert, wenn er mit einer LED-Lampe angeregt wird. Dieser Farbstoff kann entweder in ein Pflaster eingearbeitet und in einen Kolben geklebt werden oder auf die Spitze einer faseroptischen Sonde aufgetragen und in die betreffende Kultur eingetaucht werden. Zu den weiteren Parametern, die jetzt online gemessen werden können, gehören die Sauerstofftransferrate (OTR) und die Kohlendioxid-Evolutionsrate (CER), aus denen der Respirationsquotient (RQ) abgeleitet werden kann. Die Online-Überwachung solcher Parameter würde die Durchführung ausgefeilterer Zellkultivierungsstrategien ermöglichen, wie z. B. die Substratzufuhr auf der Grundlage von pH-Änderungen in der Kulturbrühe aufgrund des Zellstoffwechsels. Darüber hinaus haben Akgün et al. vor kurzem ein neuartiges Schüttelkolbensystem entwickelt, das kontinuierlich betrieben werden kann und damit den Spielraum für die parallele Entwicklung von Bioprozessen unter Verwendung von Schüttelsystemen vergrößert.

Eine wesentliche Einschränkung von Schüttelkolben ist jedoch ihre Abhängigkeit von der Oberflächenbelüftung, die im Vergleich zu Rührkesselreaktoren (STRs) zu einem geringeren Sauerstofftransfer führt. Wittmann et al. berichteten über volumetrische Gesamtmassentransferkoeffizienten (kLa) von bis zu 150 h-1 in Schüttelkolben. In einem neuartigen, kastenförmigen Schüttelkolbensystem, das von Kato und Tanaka entwickelt wurde, wurden kLa-Werte von 151 h-1 (600 ml, 200 U/min) bis 277 h-1 (100 ml, 200 U/min) gemessen, die ausreichend hoch sind, um die meisten Batch-Zellkulturen durchzuführen, ohne das mikrobielle Wachstum zu hemmen. Die Forscher bauten in die oberen Ecken ihres Prototyps gasdurchlässige Membranen ein, die während des Schüttelns einen effektiveren Gasfluss in das Gefäß ermöglichten, wodurch das Problem herkömmlicher Schüttelkolben, mehr Luft auf sterile Weise in das System einzuführen, überwunden wurde. Für Kultivierungen mit hohem Sauerstoffbedarf kann die Einführung von Schikanen die OTR bei niedrigeren Schüttelfrequenzen erhöhen; hohe Geschwindigkeiten können jedoch zu übermäßigem Verspritzen führen, was eine Verstopfung des gasdurchlässigen Stopfens (oft aus Watte) am oberen Ende des Kolbens durch Flüssigkeitssättigung zur Folge haben kann. Es hat sich gezeigt, dass eine solche Verstopfung die Fähigkeit des Systems zum Sauerstofftransport stark einschränkt, was zu Problemen führen kann, wenn eine schnell reagierende Aerobe gezüchtet wird. Sauerstoffmangel könnte die Wachstumsrate verlangsamen, die Produktionsraten verändern und/oder unerwünschte toxische Nebenprodukte erzeugen, wie z.B. die Acetatbildung bei Escherichia coli.

Mikrotiterplatten

MTPs (auch Mikrotiterplatten genannt) wurden erstmals 1951 als Plattform für diagnostische Tests eingeführt und sind in den Biowissenschaften noch immer weit verbreitet. Sie eignen sich für diagnostische Tests wie Enzymimmunoassays, die den Vorteil haben, dass viele identische Reaktionen parallel und in sehr kleinem Maßstab durchgeführt werden können. Dieser Vorteil hat dazu geführt, dass MTPs in der Screening-Phase der Prozessentwicklung zur Bewertung von Zelllinien als geschüttelte Miniatur-Bioreaktoren eingesetzt werden. Die Platten sind in der Regel aus Kunststoff, es gibt aber auch Versionen aus Glas und Metall. Das Mischen kann mit Hilfe von Pipettenansaugung oder magnetisch erregten Rührstäben erfolgen; das orbitale Schütteln der gesamten Platte auf einem beheizten Block, der die Temperatur der Kultur kontrollieren kann, ist jedoch die bei weitem häufigste Methode. Die Anzahl der Vertiefungen in MTPs beträgt in der Regel 6, 12, 24, 96 und 384, wobei für das Ultra-Hochdurchsatz-Screening (UHTS) inzwischen bis zu 1536 und 3456 Vertiefungen verfügbar sind. Die Vertiefungen können entweder rechteckig oder zylindrisch sein, wobei quadratische Geometrien die Durchmischung und den Sauerstofftransfer fördern, indem sie die Wirkung von Leitblechen imitieren. Platten mit quadratischem Boden wirken in ähnlicher Weise, indem sie die Verwirbelung der Flüssigkeit im Inneren der Vertiefung begrenzen und so die Turbulenz des Systems erhöhen. Aufgrund der Vergrößerung der Oberfläche, die durch eine größere Flüssigkeitsableitung an den Seiten jeder Mikrovertiefung verursacht wird, und der erhöhten Antriebskraft für Sauerstoff, die durch eine bessere Durchmischung verursacht wird, ist die OTR proportional zur Schüttelamplitude und -frequenz, weshalb eine Erhöhung dieser Parameter von Vorteil sein kann. Darüber hinaus haben Hermann et al. festgestellt, dass die OTR umgekehrt proportional zum Füllvolumen ist, insbesondere bei höheren Schüttelfrequenzen. Es gibt jedoch einen Punkt, über den hinaus jede Erhöhung der Schüttelbewegung zum Verschütten von Prozessflüssigkeit führt (es sei denn, das Bohrloch ist verschlossen – was seine eigenen Probleme mit dem reduzierten Sauerstofftransfer in das Bohrloch mit sich bringt). Wie bei Schüttelkolben ist die relativ geringe Sauerstofftransferkapazität von MTPs (kLa-Werte von bis zu 200 h-1 in 96-Well-Platten) auf die Tatsache zurückzuführen, dass es sich um geschüttelte Systeme handelt, die für den Stofftransfer auf Oberflächenbelüftung angewiesen sind. Im Gegensatz dazu berichteten Kensey et al. unter Verwendung der Sulfit-Oxidationsmethode über kLa-Werte von bis zu 1600 h-1 in einer MTP mit 48 Vertiefungen und Standardgeometrie mit 3 mm Orbitalauswurf bei 1400 U/min und einem Füllvolumen von 300 μl, was mit herkömmlichen STRs vergleichbar ist. Durch die Verwendung einer berechneten Proportionalitätskonstante konnte dieses Team die mit einer chemischen Methode ermittelte Sauerstofftransferkapazität auf biologische Medien übertragen.

Es gibt auch Methoden zur Bestimmung von kLa im kleinen Maßstab, die Daten liefern, die direkt mit unter Prozessbedingungen erhaltenen Werten vergleichbar sind. So schätzten Duetz et al. und Doig et al. kLa durch Massenbilanzierung unter sauerstofflimitierten Bedingungen aus dem linearen Wachstum von Pseudomonas putida in einer MTP bzw. Bacillus subtilis in einem Prototyp-Miniaturblasensäulenreaktor (MBCR). Darüber hinaus ist die dynamische Ausgasungsmethode für die Bestimmung der kLa-Werte oft der Sulfit-Oxidationsmethode vorzuziehen, da sie in der Regel in Wasser durchgeführt wird. Folglich ist dieses System koaleszierend und, obwohl es nicht mit biologischen Medien identisch ist, repräsentativer für die Bedingungen der Zellkultivierung als die absolut nicht koaleszierenden Bedingungen der Natriumsulfitmethode. Diese Technik ist jedoch in MTPs schwierig anzuwenden, da das Schütteln oft vor der DOT-Messung gestoppt werden muss, um genaue Messwerte zu erhalten, wodurch die Umgebung für den Stoffaustausch in einem kritischen Moment verändert wird. Aufgrund der Probleme, die mit der Anwendung etablierter Methoden zur Bestimmung von kLa in MTPs verbunden sind, haben wir kürzlich eine neue Methode entwickelt, die auf der Bio-Oxidation von Catechol durch das Enzym Catechol-2,3-Dioxygenase basiert. Diese Methode ergab ähnliche kLa-Werte im Vergleich zur dynamischen Ausgasungsmethode, und da sie schnell ist und keine Annahmen über die Kinetik erfordert, glauben wir, dass sich diese Methode gut für die kLa-Bestimmung in MTPs und anderen Kleingeräten eignet.

MTPs leiden bis zu einem gewissen Grad auch unter genau der Eigenschaft, die sie als Hochdurchsatzgerät attraktiv macht – kleine Volumina -, da durch Verdunstung ein erheblicher Teil der Flüssigkeit im Bohrloch entfernt werden kann. Atmungsaktive Membranen können auf die Platten gelegt werden, um diese Verdunstung einzuschränken, aber dann ist die Fähigkeit zum Sauerstofftransfer eingeschränkt. Zimmermann et al. berichteten über eine Membran, die einen mäßigen Grad an Wasserrückhalt und Sauerstofftransfer erreichte; allerdings wurden die kLa-Werte um den Faktor fünf reduziert, was das Problem des geringen Sauerstofftransfers in geschüttelten Systemen noch verschärft. Obwohl die Verdunstung in allen MBRs ein potenzielles Problem darstellt, scheinen MTPs dafür anfälliger zu sein, da sie in der Regel die kleinsten Prozessvolumina verwenden. MTPs mit 3456 Vertiefungen bieten den höchsten Durchsatz aller verfügbaren Miniatur-Zellkultivierungsgeräte und haben gezeigt, dass sie das Wachstum von CHO-Zellen (Chinese Hamster Ovary) quantitativ aufrechterhalten können, obwohl ein solch winziges Prozessvolumen (1 – 2,2 μl) bedeutet, dass dieses Gerät wahrscheinlich nicht in der Lage wäre, die Mechanismen nachzuahmen, mit denen größere Schüttelgefäße arbeiten; zum Beispiel würden sich Oberflächenspannungseffekte über die gesamte Vertiefung erstrecken, was die Mischfähigkeit stark einschränken würde. Darüber hinaus wäre keine Entnahme des Mediums für Offline-Probenahmen möglich.

Obwohl MTPs in der Entdeckungsforschung ausgiebig verwendet werden, haben sie ähnlich wie Schüttelkolben unter einem Mangel an Instrumenten gelitten, wodurch die Bandbreite der Daten, die gesammelt werden können, eingeschränkt wurde. In jüngster Zeit wurden jedoch Techniken zur Messung von pH und DOT in solchen Systemen entwickelt. Lye und Kollegen haben beispielsweise die Auswirkungen der pH-Kontrolle auf die Biomasseerträge und die Wachstumskinetik eines filamentösen Bakteriums in einem MTP untersucht. Trotz einiger inhärenter Beschränkungen von MTPs bei der Durchführung von Zellkultivierungen wurden Fortschritte bei der Charakterisierung des Mischens, des Massentransfers und der Instrumentierung dieser Gefäße erzielt, was bedeutet, dass die einzigartigen Vorteile dieser Geräte in Bezug auf das Automatisierungspotenzial und die intrinsische HT-Fähigkeit zu ihrem zunehmenden Einsatz als MBR im Frühstadium führen.

Spinnröhrchen

Die Entwicklung von Säugetierzellkulturen im Frühstadium wurde traditionell in T-Kolben und Bioreaktoren im Kleinmaßstab (oft Spinnkolben, typischerweise mit 500 ml Volumen) durchgeführt. Obwohl es sich ursprünglich um weitgehend undefinierte Geräte handelte, wurden Arbeiten zur Charakterisierung des technischen Umfelds in Spinnerflaschen durchgeführt, was ihre Verwendung als Scale-down-Gefäße erleichtert hat. Dennoch sind sie aufgrund ihres relativ großen Volumens als HT-Technologie nicht praktikabel, so dass ein echter Bedarf an Miniatur-Bioreaktoren besteht, die in Verbindung mit Säugetierzellen für parallele Zellkulturen verwendet werden können. In jüngster Zeit wurden Spin-Tubes entwickelt und als Werkzeug für die Prozessentwicklung im kleinen Maßstab für die Kultivierung von Säugetierzellen eingesetzt. Die erstmals von De Jesus et al. beschriebenen Spin-Tubes scheinen mehrere Vorteile gegenüber Spinnerflaschen zu bieten, z. B. ein geringeres Prozessvolumen. Sie wurden inzwischen von ExcellGene SA (Wallis, Schweiz) unter dem Namen TubeSpin Satellites kommerzialisiert. Diese Kulturgefäße bestehen aus modifizierten 50-ml-Zentrifugationsröhrchen, die auf einem rotierenden Orbitalschüttler in einem Inkubator montiert sind. Die Kulturvolumina betragen 5 ml bis 35 ml pro Reaktor und die Offline-Analyse wird unter Verwendung ganzer Röhrchen auf Opferbasis durchgeführt. Dieses System verfügt nicht über die notwendige Instrumentierung, um vollständig charakterisierte Säugetierzellkulturen zu kultivieren; es ist jedoch ein nützliches Instrument zur Medienoptimierung und Produktivitätssteigerung und verleiht der Zellkulturentwicklung einen hohen Durchsatzaspekt, wobei die Entwickler dieses Systems von der Möglichkeit berichten, 1000 verschiedene Kulturen pro Woche zu verarbeiten. Das relativ große Volumen und die niedrigen Verdampfungsraten dieses Geräts sind von Vorteil, wenn es um langsam wachsende Säugetierzellen geht, bei denen die Kulturen viele Tage dauern können. Es sollte jedoch darauf hingewiesen werden, dass in diesem System keine technische Charakterisierung der Durchmischung und des Stofftransfers durchgeführt wurde und Spin Tubes daher weitgehend für Screening-Anwendungen verwendet werden.

Miniatur-Rührbioreaktorsysteme

Miniatur-Rührbioreaktoren (MSBRs) auf der Grundlage herkömmlicher STRs wurden als Alternative zu geschüttelten MBR-Systemen für die Prozessentwicklung und Zellcharakterisierung im Frühstadium entwickelt. Diese Geräte sind in der Regel eng an Bioreaktoren im Labormaßstab angelehnt und bieten daher ein größeres Überwachungs- und Kontrollpotenzial als andere Miniatur-Bioreaktoren. Sie haben in der Regel ein Arbeitsvolumen, das zwischen MTPs und Schüttelkolben liegt, und die verwendeten Materialien sind sehr unterschiedlich: Plexiglas, Pyrex, Polymethylmethacrylat (PMMA) und Edelstahl. Abbildung 2 zeigt unseren MSBR-Prototyp mit 18 ml Arbeitsvolumen, der aus Edelstahl und Pyrex besteht und mit optischen Sonden zur Online-Messung von pH und DOT ausgestattet ist. Dieses Gefäß wurde im Hinblick auf seine Mischeffizienz und seine Fähigkeit zur Sauerstoffübertragung charakterisiert. Es hat sich gezeigt, dass es in der Lage ist, herkömmliche STRs in Zellkulturen mit unterschiedlicher Rheologie, Scherempfindlichkeit und Sauerstoffbedarf zu imitieren (d. h. das filamentöse Bakterium Saccharopolyspora erythraea, das Erythromycin produziert, und rekombinante E. coli, die Plasmid-DNA bzw. Antikörperfragmente produzieren). Das Gerät konnte aufgrund seiner relativ hohen kLa-Werte (480 h-1 bei 7000 U/min unter Verwendung der dynamischen Ausgasungsmethode) und kurzen Mischzeiten (4,8 s bei 7000 U/min – mehr als doppelt so schnell wie ein 7-Liter-Behälter bei gleicher spezifischer Leistungsaufnahme) erfolgreich eine Reihe von Organismen züchten. Hohe Sauerstofftransferraten unterstützten das Wachstum von schnell atmenden Organismen (E. coli), während eine effektive Durchmischung dem Gefäß ermöglichte, homogene Bedingungen bei zähflüssigen Fermentationsbrühen aufrechtzuerhalten, die häufig bei der Züchtung fadenförmiger Organismen auftreten. Auch die Rührgeschwindigkeit konnte sehr genau gesteuert werden, was dazu beitrug, dass die scherempfindlichen Myzelorganismen nicht durch übermäßigen Energieeinsatz geschädigt wurden. Darüber hinaus wurde die gasförmige Leistungsaufnahme des Gefäßes gemessen, was die Berechnung der Leistungszahl des Rührwerks über einen weiten Bereich von Betriebsbedingungen ermöglichte und somit eine zuverlässige Skalierung der Zellkultivierung auf der Grundlage einer gleichen spezifischen Leistungsaufnahme erlaubte. Obwohl es sich bei diesem MSBR um einen Prototyp handelt, wäre es möglich, ein solches Gerät zu vervielfachen, um einen höheren Durchsatz zu erzielen.

Durch Rühren und aktive Belüftung des Gefäßes wurden in der Literatur für andere MSBRs Stoffübertragungsraten berichtet, die denen eines herkömmlichen STR im Labormaßstab nahe kommen. Lamping et al. berichteten beispielsweise über kLa-Werte von 360 h-1 bei 1 VVM und 3000 U/min unter Verwendung der dynamischen Ausgasungsmethode in einem MSBR-Prototyp, der dem in Abbildung 2 gezeigten ähnlich ist. Darüber hinaus modellierte dasselbe Team erfolgreich den Sauerstofftransfer in einem Prototyp-Miniaturbioreaktor mit Hilfe einer CFD-Analyse (Computational Fluid Dynamics), die auf den relevanten technischen Parametern des Geschwindigkeitsfeldes, der Blasengröße, des Gasrückhalts und der Energiedissipationsraten innerhalb des MBR basierte.

Puskeiler et al. berichteten kürzlich über kLa-Werte von über 700 h-1 (12 ml Volumen) und sogar 1600 h-1 (8 ml Volumen) für einen MSBR, der mit 2300 U/min gerührt wird. In diesem System wird ein neuartiges gasinduzierendes Rührwerk verwendet, das zu einer sehr hohen Sauerstoffübertragungsfähigkeit führt. In dieser Studie wurde die dynamische Ausgasungsmethode zur Messung von kLa angewandt, wobei jedoch nicht-koaleszierende Bedingungen verwendet wurden, was einen direkten Vergleich mit Werten aus Zellkulturmedien oder koaleszierenden Flüssigkeiten erschwert. In demselben Artikel wurde die Fähigkeit des Systems beschrieben, Zellkulturen im Fed-Batch-Verfahren aufrechtzuerhalten, was das Potenzial von Miniatur-Bioreaktortechnologien zur Unterstützung solcher industriell wichtigen Strategien verdeutlicht. Darüber hinaus wurde die Möglichkeit einer Online-Überwachung und -Kontrolle aufgezeigt. Das in diesem Bericht beschriebene Gerät, das in Zusammenarbeit mit der H+P Labortechnik AG (Oberschleißheim, Deutschland) entwickelt wurde, ist eine integrierte Einheit („Bioreaktorblock“), die bis zu 48 Zellkulturen gleichzeitig unterstützen kann. Ein integriertes Flüssigkeitshandhabungssystem ermöglichte es, den pH-Wert in der Linie mit einer Frequenz von einer Stunde zu messen, indem Proben von 20 μl in handelsübliche MTPs mit aufgeklebten pH-Patches gegeben wurden. Acht Minuten später wurde der pH-Wert mit demselben Flüssigkeits-Probenahmesystem mit 4 M NaOH eingestellt. Während die Verwendung von automatisiertem Flüssigkeitshandling zur Kontrolle des pH-Werts eine saubere Lösung ist, räumten die Autoren ein, dass dies bei empfindlichen Organismen, die eine schnellere pH-Einstellung benötigen, unpraktisch sein kann. In dem Bericht heißt es jedoch, dass gemeinsam mit Industriepartnern ein verbessertes Überwachungssystem entwickelt wird, das eine häufigere Überwachung ermöglicht, wodurch sich die Zahl der gleichzeitig durchgeführten Fermentationen, die effektiv überwacht werden können, erhöhen könnte. DOT wurde in dem System mit einem Prototyp-Sensorblock mit optischen Sonden gemessen, wobei allerdings nur 8 Reaktoren der 48 Kulturgefäße gleichzeitig überwacht wurden. Ein solches Gerät kann auch in Standard-Roboterausrüstung integriert werden, um Aufgaben der Flüssigkeitshandhabung wie Inokulation, Fütterung und Probenahme durchzuführen.

Unter Verwendung eines anderen Ansatzes hat die Fluorometrix Corporation (Stow, Massachusetts, USA) ein MSBR-Konstrukt mit mehreren Gefäßen namens Cellstation® entwickelt. Dieser MBR nutzt die optische Technologie, um eine in situ-Online-Überwachung von bis zu 12 parallelen Kultivierungen für pH , DOT und optische Dichte (OD) zu ermöglichen, und die Agitation wird durch zwei Paddelräder gewährleistet. Jedes Gefäß hat ein Arbeitsvolumen von bis zu 35 ml und ist an einem Karussell befestigt, das sich dreht, so dass alle Gefäße nacheinander beprobt und überwacht werden können. Das optische Sensorsystem wurde validiert, indem die Konsistenz der pH- und DO-Sensoren über einen Zeitraum von 70 Stunden in einem Säugetierzellkulturprozess nachgewiesen wurde. Darüber hinaus hat Raos Forschungsgruppe an der University of Maryland, die eng mit dem Unternehmen verbunden ist, kürzlich Einzelheiten zu zwei Prototypen von MSBR-Systemen mit 24 Vertiefungen veröffentlicht, die den Durchsatz dieser Technologie weiter verbessern.

Parallel zu diesen MSBR-Entwicklungen hat die Dasgip AG (Jülich, Deutschland) die Stirrer-Pro Flask vorgestellt, die zu ihrer Fedbatch-Pro® Zellkultivierungsserie gehört, die bis zu 16 Kulturgefäße (Arbeitsvolumen 200-275 ml) umfasst und eine durch Rühren angetriebene Sauerstofftransferkapazität sowie eine Fed-Batch-Fähigkeit bietet. pH und DOT können mit sterilisierbaren Standardsonden überwacht und für jedes Gefäß unabhängig voneinander durch automatische Säure-/Base-Flüssigkeitszugabe bzw. Luftstrom-/Rührungsvariation gesteuert werden. Die Substratzugabe kann entweder mit DOT- oder pH-Auslösepunkten verknüpft werden, was eine vollautomatische Fed-Batch-Fähigkeit ermöglicht. Die Kombination aus mechanischer Bewegung (zwischen 10 und 1000 U/min) und Gasdurchströmung deutet darauf hin, dass dieses System in der Lage ist, schnell wachsende Bakterienkulturen bis zu einer hohen Zelldichte zu unterstützen und daher für die Entwicklung solcher Bioprozesse nützlich wäre. Allerdings ist das verwendete Arbeitsvolumen im Vergleich zu den meisten anderen besprochenen Systemen relativ groß, und der Aufbau wird durch eine große Anzahl von Schläuchen und Drähten für Zugaben und Messungen erschwert. Eine Variante dieses Systems mit bis zu 16 Schüttelkolben, die mit pH-Sonden ausgestattet sind, wurde ebenfalls entwickelt, die eine intermittierende Fütterung und eine parallele pH-Kontrolle ermöglicht.

Als kleinere Alternative zu parallel arbeitenden STRs im Labormaßstab, wie dem von der Infors AG (Bottmingen, Schweiz) entwickelten Sixfors®-System, haben Forscher des University College London in Zusammenarbeit mit dem Bioreaktor-Unternehmen BioXplore des HEL-Konzerns (Barnet, Großbritannien) ein MBR-System mit 4 bis 16 Kammern entwickelt und charakterisiert, das eine vollständig integrierte und automatisierte Kontrolle von DOT und pH aufweist. Obwohl jedes Gefäß ein maximales Arbeitsvolumen von 100 ml hat und damit am oberen Ende der MSBR-Technologie liegt, ist die Entwicklung einer eigenständigen Software zur Überwachung solcher Bioreaktoren ein Schritt in die Richtung, MBRs mit dem gleichen Maß an Kontrolle und Automatisierung auszustatten, wie es bei konventionellen Bioreaktoren der Fall ist.

Miniatur-Blasensäulenreaktoren

Blasensäulen nutzen Gaseinblasung anstelle von Rühren als Mittel zur Förderung der Durchmischung und des Sauerstoff-Massentransfers für die Zellkultur. Als Alternative zu gerührten oder geschüttelten Geräten haben wir einen Miniaturblasensäulenreaktor (MBCR) entwickelt, der auf einer MTP mit porösen Membranen (Fritten) basiert, die als gesamte Basis für jedes einzelne Well fungieren. Die Luft durchdringt die Fritte und strömt durch jede Vertiefung nach oben, wobei sie Sauerstoff für jede wachsende Kultur liefert. Unter der Voraussetzung, dass jede Fritte nach einer hohen Spezifikation hergestellt ist und einen identischen Porositätsgrad aufweist, ist die Durchflussrate zu jeder Säule gleich und kann berechnet werden. Dadurch wird verhindert, dass die Ergebnisse durch unterschiedliche Luftdurchflussraten künstlich beeinflusst werden.

Doig et al. beschreiben die Konstruktion und Charakterisierung eines Prototyps eines MBCR mit 12 Vertiefungen, der in der Lage ist, die aerobe Kultivierung von Bacillus subtilis-Kulturen zu unterstützen, wobei jede Säule ein Arbeitsvolumen von 2 ml hat. kLa-Werte wurden bis zu 220 h-1 unter Verwendung der dynamischen Ausgasungsmethode bei einer Oberflächengasgeschwindigkeit von 0,02 ms-1 angegeben. Einer der Vorteile dieses Gerätetyps besteht darin, dass die Belüftung im Gegensatz zu einer MTP durch direktes Einblasen erfolgt. Dies hat den Effekt, dass die Fähigkeit des Systems zum Sauerstoff-Massentransfer im Vergleich zu einer MTP erhöht wird, da die Durchspülung die für den Gas-Flüssigkeits-Massentransfer verfügbare Oberfläche im Vergleich zur reinen Oberflächenbelüftung vergrößert. Obwohl einige kLa-Daten für MTPs, die in dieser Übersicht aufgeführt sind, wesentlich höher sind als die gemessenen MBCR-Werte, muss darauf hingewiesen werden, dass viele der MTP-Werte unter eher künstlichen Bedingungen abgeleitet wurden, die darauf ausgelegt sind, den Sauerstofftransfer zu maximieren, wohingegen die oben gezeigten kLa-Werte für das MBCR unter Zellkulturbedingungen reproduzierbar wären.

Neben der großen Oberfläche, die für den Sauerstofftransfer zur Verfügung steht, bedeutet das Fehlen von Agitation in MBCRs, dass der Energieeintrag und damit der Sauerstofftransfer einfacher zu modellieren ist als in STRs, da es weniger Parameter zu berücksichtigen gibt, wobei die Oberflächengasgeschwindigkeit und die Blasengrößenverteilung Schlüsselparameter beim Scale-up/Scale-down von Blasensäulen sind. Außerdem ist das Gerät stationär und wird nicht geschüttelt, was eine einfachere Instrumentierung ermöglicht, da die Bewegung der meisten MTP-Systeme gestoppt werden muss, bevor eine Messung in einem Plattenlesegerät erfolgen kann. Die mechanische Einfachheit in Verbindung mit dem potenziell hohen Sauerstofftransfer und der einfachen Probenahme macht MBCRs für die parallele Zellkultivierung geeignet. Dies könnte unter anderem zum Zweck der Verbesserung von Medien oder Stämmen und der Prozessentwicklung in einem frühen Stadium geschehen. MBCRs könnten auch zur Nachahmung und Vorhersage der Leistung von Großreaktoren verwendet werden. In diesem Zusammenhang haben wir vor kurzem eine gute Korrelation der Sauerstofftransferrate mit dem volumetrischen Energieverbrauch (P/V) für Blasensäulen im Miniatur- (2 ml) und Labormaßstab (100 ml) unter Verwendung von Gasdiffusoren mit derselben Porengröße nachgewiesen, die die Vorhersage von kLa als Funktion von P/V ermöglicht. In der gleichen Arbeit zeigten wir auch eine vergleichbare Zellkultivierungsleistung mit der MBCR im Vergleich zu einer STR im Labormaßstab, die auf gleichen kLa-Werten basiert. Diese Ergebnisse weisen auf das Potenzial des MBCR als Scale-down-Gerät hin. Dieser MBCR-Prototyp war nicht instrumentiert, obwohl wir das Gerät in späteren Arbeiten mit optischen Fluoreszenzpflastern ausgestattet und zur Messung der DOT während der Zellkultivierung verwendet haben. Die Temperatur konnte geregelt werden, indem das Gerät mit einem Wasserbad verbunden wurde und temperaturgeregeltes Wasser durch den geschlossenen Raum zwischen den Säulen zirkulierte (siehe Abbildung 3). Ähnliche MBCRs wurden bereits von anderen entwickelt; diese Gefäße haben jedoch ein Volumen von ca. 200 ml und sind daher um zwei Größenordnungen größer als das von Doig et al. beschriebene Gerät, was den erreichbaren Parallelbetrieb einschränkt.

Andere Miniaturgeräte

Unter Verwendung des Konzepts einer integrierten Sensorplatte hat MicroReactor Technologies (Mountain View, Kalifornien, USA) ein hybrides Zellkultivierungssystem entwickelt, das auf einer geschüttelten MTP mit 24 Vertiefungen und einer Konfiguration beruht, die eine gleichmäßige Wärmeübertragung über die Platte ermöglicht. Das empfohlene Arbeitsvolumen jeder Vertiefung liegt zwischen 3 und 5 ml, und Luft wird in die flüssige Phase eingeleitet, indem sie durch die im Boden jeder Vertiefung befindlichen Sinters eingeblasen wird, was die Fähigkeit zum Sauerstofftransfer im Vergleich zu ähnlich konzipierten geschüttelten Systemen erhöht. Dieses kürzlich auf den Markt gebrachte Kultivierungsgerät (in Europa lizenziert von Applikon Biotechnology AB, Niederlande) ist mit faseroptischen Sonden ausgestattet, um DOT und pH in allen Vertiefungen gleichzeitig online zu überwachen. Das Gerät ermöglicht außerdem eine unabhängige Kontrolle von Temperatur, DOT, pH-Wert (über Gasdurchsatz) und Luftdurchsatz für alle 24 Vertiefungen. Das Gerät überwindet eines der grundlegenden Probleme bei MTP-basierten HT-Geräten – nämlich die Anbringung von Instrumenten in allen Vertiefungen der Platte -, indem es alle Sensor-Patches am Boden jeder Vertiefung anbringt und dann die gesamte Platte auf eine schüttelnde Inkubatorplattform stellt, die über integrierte Instrumentenschaltungen verfügt, wodurch jede Vertiefung unabhängig überwacht werden kann. Die Hauptanwendung dürfte in den frühen Phasen der Prozessentwicklung liegen (z. B. bei der Auswahl der Stämme und der Optimierung des Mediums). Es gibt noch keine öffentlich zugänglichen Daten zur technischen Charakterisierung der Durchmischung und des Sauerstofftransfers und zum Vergleich der Kultivierungsleistung mit Daten aus Bioreaktoren im Labormaßstab.

In jüngster Zeit wurden Entwicklungen durchgeführt, die darauf abzielen, den Maßstab von MBRs auf Prozessvolumina im Submilliliterbereich zu reduzieren. Obwohl diese Miniatursysteme den größten Spielraum für HT-Anwendungen bieten, gibt es eine praktische Grenze dafür, wie klein Kulturvolumina werden können. Bei Geräten, die ein zu kleines Prozessvolumen verwenden, ist es möglicherweise nicht möglich, Kulturen mit ausreichender Überwachung und Probenahme durchzuführen. Obwohl OD, DOT und pH online überwacht werden können, ist dies bei anderen kritischen Parametern wie Substratkonzentration und Produktausbeute häufig nicht der Fall; dieses Problem kann jedoch bei bestimmten Prozessen umgangen werden, indem Marker wie grün fluoreszierendes Protein in das Produkt eingearbeitet werden. Die Verdunstung kann bei solch extrem kleinen Kulturvolumina zu einem erheblichen Problem werden, wenn mit langen Bakterien- und Säugetierzellkultivierungsprozessen gearbeitet wird; außerdem wäre es angesichts des extrem kleinen Prozessvolumens eine technische Herausforderung, den pH-Wert durch Flüssigkeitszugabe genau zu steuern. Nichtsdestotrotz stellt der Betriebsmaßstab einen radikalen Fortschritt in der Konstruktion von MBRs dar und erhöht ihr Einsatzpotenzial für die parallele HT-Zellkultivierung erheblich.

In dieser Hinsicht hat Jensens Forschungsgruppe am MIT einen Submilliliter-MBR-Prototyp entwickelt, der zu einem Multiplexsystem modifiziert und erweitert wurde, das in der Lage ist, acht instrumentierte Mikrozellkulturen mit Arbeitsvolumina von 150 μl durchzuführen. Unter Verwendung von Standard-Mikrofabrikationsmethoden werden die Kultivierungsvertiefungen aus PMMA und Poly(dimethylsiloxan) (PDMS) auf einem Aluminiumsockel immobilisiert, der alle Sensorelemente enthält, und der Sauerstofftransfer wird durch Diffusion durch eine gasdurchlässige Membran und Magnetrührer ermöglicht, die in der Lage sind, die Agitation für jeden Reaktor individuell zu steuern. DOT, pH und OD können online mit optischen Sonden überwacht werden. Die Gruppe berichtete, dass das Gerät E. coli-Batch-Kulturen aufrechterhalten kann, jedoch fiel der DOT nach 2-3 Stunden auf 0 %, was möglicherweise auf eine Sauerstoffbegrenzung zurückzuführen ist. Dies ist wahrscheinlich, wenn man bedenkt, dass der in diesem MBR gemessene maximale kLa-Wert nur 75 h-1 betrug. Dennoch zeigten die Autoren, dass das Wachstumsverhalten mit dem einer Reihe größerer Zellkultivierungsgeräte vergleichbar war. Dieselbe Forschungsgruppe führte auch eine detaillierte DNA-Mikroarray-Genexpressionsanalyse von E. coli durch, die in einem 50 μl-MBR gezüchtet wurden. Diese Arbeit stellt einen echten Fortschritt in der MBR-Entwicklung dar, da sie nicht nur den Nachweis des Prinzips erbringt, sondern auch eine hochgradig parallele Analyse der Genexpression ermöglicht und für ein besseres Verständnis der Zellphysiologie während der Kultivierung unter Verwendung eines Ansatzes auf Systemebene genutzt werden könnte. Maharbiz et al. berichteten über die Entwicklung eines Array-basierten Geräts, das Mikrotiterplatten-Reaktoren mit Silizium-Mikrofabrikationstechnologie kombiniert und die Kultivierung von E. coli in acht 250-μl-Vertiefungen gleichzeitig ermöglicht. Ähnlich wie beim MIT-Reaktor (siehe oben) befanden sich die Vertiefungen auf einer Grundplatte, die Sensoren für pH- und OD-Messungen enthielt (DOT wurde nicht gemessen, aber die Autoren geben an, dass dies machbar wäre). In jeder Kultur wurde elektrochemisch Sauerstoff erzeugt, und für die Bewegung sorgte ein Edelstahlkügelchen, das die Kultur mischte, den Sauerstoff verteilte und den Oberflächenschaum aufbrach. Dieses Forschungsteam hat jedoch keine Vergleichsdaten im Labormaßstab vorgelegt, anhand derer sich feststellen ließe, ob ein Scale-up mit einem solchen Gerät möglich wäre.

Ein weiteres kommerzielles System für den HT-Betrieb wurde von der Bioprocessors Corp. (Woburn, MA, USA) entwickelt. Dieses Zellkultivierungsgerät (SimCell® genannt) kann bis zu 1500 Kulturen betreiben und unabhängig steuern und ermöglicht so die Anwendung von Methoden der vollfaktoriellen Versuchsplanung zur Prozessoptimierung. Dieses „Reaktor-auf-Chip“-Gerät basiert auf einem mikrofluidischen Design mit einer gasdurchlässigen Membran, die den Sauerstofftransfer ermöglicht, und die Durchmischung erfolgt durch Rotation der Mikro-Bioreaktor-Array-Chips in umweltkontrollierten Inkubatoren mit befeuchteter Luft, um die Verdunstung zu minimieren. Dieses System kann hochgradig automatisiert werden und ist mit einem Roboter für den Transfer von Platten aus einem Inkubator zu einer Sensorstation für die Messung von pH-Wert, DOT-Wert und Zelldichte sowie einer Fluidikstation integriert, in der Medien für den Fed-Batch-Betrieb und Säure/Base für die pH-Kontrolle zugegeben werden können. Die Volumina in jedem Reaktor reichen von ca. 300 μl bis ca. 700 μl, je nach Anwendung (mikrobielle oder Säugetierzellen), und jeder Reaktor kann im Batch-, Fed-Batch- oder Perfusionsmodus betrieben werden. Das Gerät eignet sich nachweislich für die Kultivierung von E. coli und Hefe, wobei die Wachstumskinetik mit der von herkömmlichen STRs vergleichbar ist. Das Unternehmen hat auch das Wachstum von CHO-Zellen ohne Sauerstofflimitierung bei hoher Zelldichte beschrieben und mit Hilfe von CFD-Simulationen (Computational Fluid Dynamics) gezeigt, wie die physikalische Umgebung in großen Schaufelbioreaktoren nachgebildet wurde. kLa im System wurde mit CFD modelliert und auf 60 bis 500 h-1 geschätzt, Werte, die mit denen in Schüttelkolben und suboptimalen STRs vergleichbar sind.

MBRs als Scale-Down-Werkzeug

Es ist anzumerken, dass nicht alle Miniatur-Zellkultivierungssysteme für das Scale-Up/Scale-Down bestehender Bioprozesse konzipiert sind; in dieser Übersicht wurde erwähnt, dass solche Geräte für viele Anwendungen wie die Beurteilung von Rekombinanten/Wildtyp-Organismen im Frühstadium, die Verbesserung von Stämmen und die Entwicklung von Wachstumsmedien eingesetzt werden können. Die Miniatursysteme, die in den späteren Stadien der Prozessentwicklung, z. B. zur Optimierung der Betriebs- und Kulturbedingungen, eingesetzt werden, sollten jedoch skalierbar sein. Aus diesem Grund ist es von entscheidender Bedeutung, dass bewährte „Faustregeln“, die in der Industrie häufig für die Skalierung von Tischprozessen auf Produktionsgefäße verwendet werden, daraufhin untersucht werden, ob sie auch für die Skalierung von MBRs verwendet werden können. Zu diesen bewährten Methoden gehören die Skalierung auf der Grundlage der Begasungsleistung pro Volumeneinheit, der Geschwindigkeit der Rührwerksspitze, der konstanten DOT, der Sauerstoff-Massentransferkapazität (kLa) oder der Mischzeit. Es gibt jedoch keine „Einheitsgröße für alle“, und daher sollte betont werden, dass keine einzige Grundlage für die Äquivalenz universell auf alle MBRs angewendet werden kann. Keines der in diesem Bericht beschriebenen Systeme konnte alle oben beschriebenen, etablierten Scale-up-/Scale-down-Methoden anwenden. Zum Beispiel ist ein konstanter DOT-Wert in geschüttelten Systemen im Vergleich zu konventionellen STRs schwer zu erreichen, da das Fehlen von mechanischer Bewegung (und Sparring – im Falle von MTP-basierten Systemen) bedeutet, dass die Kontrolle des DOT-Wertes über einem kritischen Wert in diesen Geräten technisch sehr schwierig ist. Diese Besonderheit ist an sich kein Problem, solange die kultivierten Zellen ausreichend langsam wachsen (entweder auf natürliche Weise oder durch die Verwendung eines schwachen Wachstumsmediums und/oder den Betrieb bei einer Temperatur, die für eine maximale Wachstumsrate nicht förderlich ist), aber sie schränkt die Verwendung solcher Systeme zur Durchführung vieler Prozesse mit hoher Zelldichte ein, bei denen schnell wachsende Mikroorganismen mit hohem Sauerstoffbedarf beteiligt sind.

Ein Hinweis darauf, welches Scale-Down-Kriterium für einen bestimmten Bioprozess verwendet werden sollte (und damit ein Hinweis darauf, welche Miniaturisierungsplattform für diesen Prozess vorzuziehen ist), lässt sich durch Untersuchung der Zelleigenschaften und Prozessbedingungen des betreffenden Bioprozesses gewinnen. Für einen schnell wachsenden Organismus wie E. coli oder Bacillus subtilis ist in der Regel der Sauerstofftransfer der limitierende Faktor, während Scherstress wahrscheinlich kein großes Problem darstellt; daher könnte die Verkleinerung einer solchen Zellkultivierung auf der Grundlage eines gleichen spezifischen Energieinputs oder auf der Grundlage eines gleichen kLa konzipiert werden. Eine Voraussetzung für die Wahl gleicher kLa ist jedoch, dass die Leistungszufuhr zum Miniatur-Bioreaktor genau abgeschätzt werden kann. Die an der UCL in einem 10-ml-MBR durchgeführten Arbeiten bestätigen frühere Arbeiten von Bujalski et al., die zeigten, dass die Anzahl der Laufradleistungen mit dem Gefäßdurchmesser abnimmt. Daher ist es wichtig, für die Abschätzung des Leistungseintrags in MBRs nicht die Leistungszahlen von Rührwerken im herkömmlichen Maßstab zu verwenden, da dies zu einer Sauerstofflimitierung von schnell reagierenden Mikroben führen könnte, indem die auf das System übertragene Leistung überschätzt wird.

Eine besondere Herausforderung ist das Wachstum von fadenförmigen Organismen aufgrund ihrer komplexen Morphologie. Fermentationsbrühen, die solche Organismen enthalten, haben eine relativ hohe Viskosität und erfordern einen zusätzlichen Energieeintrag, um eine angemessene Durchmischung und einen angemessenen Stoffaustausch zu gewährleisten. Darüber hinaus sind fadenförmige Organismen viel größer als einzellige Bakterien und können anfälliger für Scherschäden sein. So berichteten Heydarian et al., dass die durchschnittliche Hyphenlänge des Erythromycin produzierenden Bakteriums Saccharopolyspora erythraea die Kolmogorov-Mikroskala der Turbulenz in einem Standard-7-Liter-Bioreaktor über einen großen Bereich von Betriebsbedingungen überschritt. Im Fall von S. erythraea hat sich gezeigt, dass die Bildung von Erythromycin-Produkten beeinträchtigt werden kann, wenn die Myzelien zu stark geschert werden, was zu einer zu kurzen Hyphenlänge führt. Aus diesem Grund kann es ratsam sein, bei der Verwendung von fadenförmigen Organismen die Spitzengeschwindigkeit als Grundlage für das Scale-down zu wählen. Die Mechanismen, die die Pelletbildung in filamentösen Kulturen steuern, sind zwar nicht genau bekannt, aber Vecht et al. berichteten über eine Korrelation zwischen abnehmender OTR und einer Verringerung der mittleren Pelletgröße bei Streptomyces tendae . Sie kamen zu dem Schluss, dass die Pelletbildung in diesem Organismus hauptsächlich auf hydrophobe Wechselwirkungen zurückzuführen ist, die durch DOT kontrolliert werden. In Anbetracht der nachteiligen Auswirkungen, die die Pelletbildung auf die Produktion von Sekundärmetaboliten in vielen fadenförmigen Organismen haben kann – aufgrund der Hemmung der Sauerstoffaufnahme im Zentrum des Pellets, die mit dem Pelletdurchmesser zunimmt – ist es klar, dass MBRs bei der Verkleinerung von Kultivierungsprozessen von Fadenzellen den Gehalt an gelöstem Sauerstoff aufrechterhalten müssen, der in dem großtechnischen Prozess, auf dem die Verkleinerung basiert, vorhanden ist, um die Produktausbeute zu erhalten. Ein gleichwertiger kLa-Wert ist für die Verkleinerung schwer zu verwenden, da er normalerweise in Modellsystemen berechnet wird, die wenig Ähnlichkeit mit tatsächlichen Fermentationsbrühen haben. Darüber hinaus wird kLa durch Veränderungen der Koaleszenz und der Rheologie der Kulturbrühe im Laufe eines Kultivierungsprozesses beeinflusst – Veränderungen, die sehr schwer zu messen und zu berücksichtigen sind. Bei der Auswahl einer Basis für die Verkleinerung eines Bioreaktors kommt es darauf an, die Zellen keinen Belastungen auszusetzen, die über die im großen Maßstab auftretenden Belastungen hinausgehen.

Von den in dieser Übersicht besprochenen Miniaturgeräten versuchen einige, Bioreaktoren im großen Maßstab in ihrer Geometrie nachzubilden. Beispielsweise sind die meisten MSBRs und MBCRs geometrische Faksimiles von Bioreaktoren im großen Maßstab. Die Beibehaltung der geometrischen Ähnlichkeit hat Vorteile für einen effektiven Maßstabsvergleich, da sie es ermöglicht, dass einige Schlüsselannahmen gültig bleiben; z. B. hilft die Beibehaltung eines gleichen Seitenverhältnisses bei der Vorhersage des hydrostatischen Drucks und damit der Sauerstofflöslichkeit in verschiedenen Betriebsgrößen. Dies hat den Vorteil, dass die Mechanismen für den Sauerstofftransfer und die Durchmischung sowie für die Berechnung des Energieeintrags auf denselben Grundsätzen beruhen können, die im großen Maßstab ermittelt wurden. Die Strömungsdynamik wird ähnlich sein, obwohl zu beachten ist, dass einige dimensionslose Zahlen, die die Strömungsdynamik beschreiben, wie z. B. die Reynolds-Zahl in Rührkesseln, bei solch kleinen Maßstäben weniger Einfluss zu haben scheinen. Grundsätzlich stellt sich die Frage, wie effektiv MBRs sein können, wenn sie eine so geringe Größe erreichen, dass ihre Strömungseigenschaften und Mechanismen für Stoffaustausch und Durchmischung anders sind als in den großen Bioreaktoren, die sie nachahmen sollen. MTPs sind in dieser Hinsicht besonders anfällig, da ihr Mangel an mechanischer Bewegung bedeutet, dass Oberflächenspannungseffekte wichtiger sind als in MSBRs, wo Laufräder diesen Effekt verringern und zur Aufrechterhaltung einer effektiven Flüssigkeitsdurchmischung beitragen können. Darüber hinaus besteht bei extremen Bedingungen mit MTPs (in Bezug auf Schüttelfrequenz und Füllvolumen) die Gefahr, dass die gesamte Prozessflüssigkeit einen dünnen Film entlang der inneren Oberfläche des Brunnens bildet, wodurch die Durchmischung stark eingeschränkt und die nachteiligen Auswirkungen der Oberflächenspannung noch verstärkt werden. Unterschiedliche Strömungsregime in MBRs, die durch unterschiedliche Rührmethoden verursacht werden, können sich auf die Fähigkeit solcher Systeme auswirken, Zellkultivierungen reproduzierbar durchzuführen; wenn die Bedingungen im kleinen und im großen Maßstab in Bezug auf die Durchmischung und den Gas-Flüssigkeits-Massentransfer unterschiedlich sind, könnte dies zu Problemen führen, z. B. zur Auswahl von Klonen, die nicht für die Produktion geeignet sind, oder zu Unterschieden in der Produktqualität, insbesondere bei rekombinanten Proteinen. Andererseits deuten die Arbeiten von Micheletti et al. darauf hin, dass eine Umstellung von geschüttelten auf gerührte Systeme möglich ist, wenn die Kriterien für das Scale-up sorgfältig ausgewählt werden. Unter Verwendung einer kürzlich eingeführten Korrelation für kLa-Vorhersagen in MTPs konnten sie erfolgreich die Kultivierung von E. coli, die ein Transketolase-Enzym überexprimieren, von einem Mikrotiterplatten-System (1 ml Volumen) auf einen 1,4-Liter-STR auf der Grundlage einer konstanten kLa. Dieselbe Gruppe liefert auch erste Daten über ein zufriedenstellendes Scale-up eines Säugetierzellkulturprozesses unter Verwendung einer konstanten mittleren Energiedissipationsrate.

Automatisierung von MBRs

Die Automatisierung von MBRs ist der Schlüssel zur Erweiterung der HT-Fähigkeit. Mehrere der kürzlich entwickelten Miniatursysteme verwenden eine modifizierte MTP als Ausgangspunkt (z. B. der Applikon MicroReactor®). Diese Systeme scheinen derzeit sehr vielversprechend zu sein, da sie sich leicht in bestehende Roboter-Automatisierungsplattformen integrieren lassen. Die MTPs, auf denen solche Systeme basieren, haben eine standardisierte Grundfläche, sind mechanisch einfach und eignen sich aufgrund ihrer Standardisierung ideal für den Einbau in automatisierte Roboterplattformen, die solche Technologien wirklich in den HT-Bereich bringen und ihnen die Fähigkeit verleihen, Hunderte von Zellkultivierungen parallel durchzuführen, wobei die Grundfläche nicht viel größer ist als die eines herkömmlichen Bioreaktors im Pilotmaßstab. Die Alternative ist die Entwicklung eines Miniatur-Bioreaktorsystems, das selbst automatisiert werden kann. Die Technologien, die die Gruppe von Weuster-Botz in Zusammenarbeit mit H + P Labortechnik und Bioprocessors Corp. entwickelt hat, sind Beispiele für diesen Ansatz. Solche Geräte bieten ein gewisses Maß an HT-Fähigkeit sowie im Falle des SimCell®-Systems der Bioprocessors Corp. eine ausgefeilte eingebaute Robotik.

Robotische Geräte, die in Verbindung mit MBRs eingesetzt werden, verfügen in der Regel über Mehrfach-Pipettierköpfe, die auf Armen montiert sind, die sich in drei Dimensionen über den gesamten Arbeitsbereich bewegen können. Die Pipettierköpfe können auch unterschiedliche MBR-Geometrien bewältigen, und separate Roboterarme können Zusatzgeräte überall im Arbeitsbereich aufnehmen und platzieren. Diese Pick-and-Place-Fähigkeit bedeutet, dass ein einziger Roboter einen MBR beimpfen, den pH-Wert kontrollieren, Proben entnehmen und Zusätze anbringen kann, was eine wirklich integrierte Lösung darstellt. Darüber hinaus können Roboter Zellkultivierungsplattformen mit Analyseinstrumenten (z. B. HPLC-Systemen) verbinden und komplexe Assays wie ELISA für Antikörperprodukte unter Verwendung von Echtzeitproben durchführen – Assays, die die Fähigkeit des Roboters nutzen, Tausende von Liquid-Handling-Vorgängen in kurzer Zeit durchzuführen. Durch die Unterbringung des Roboters in einer speziell angefertigten Biosicherheitskabine können aseptische Bedingungen für die Zellkultivierung aufrechterhalten werden.