Neue Erkenntnisse über Struktur und Funktion des Apoptosoms

Frühe Strukturinformationen waren entscheidend für die Entschlüsselung der Domänenorganisation des Apoptosoms. Das menschliche Apoptosom enthält sieben Apaf-1-Moleküle, die symmetrisch in einer radförmigen Struktur angeordnet sind und eine zentrale Nabe bilden, die aus NODs mit sieben verlängerten HD2-Armen besteht, die jeweils in einer V-förmigen Region enden, die von den beiden β-Propellern gebildet wird. Die α/β-Faltung der NBD und HD1 binden ADP/dATP zwischen ihnen, während die WD40-Wiederholungen die 7- und 8-blättrigen β-Propeller bilden. Entgegen früherer Vermutungen wurde festgestellt, dass laterale Wechselwirkungen zwischen der α/β-Faltung benachbarter Apaf-1-Moleküle zur Organisation des zentralen Rings genutzt werden, während die N-terminalen CARDs über diesem Ring sitzen und in Abwesenheit von pc-9 ungeordnet sind (PDB 3J2T) . Jüngste Nah-Atomstrukturen haben jedoch gezeigt, dass die Apaf-1 CARDs in Gegenwart von pc-9 CARDs eine scheibenförmige Struktur auf der Oberfläche des aktiven Apoptosoms bilden, und diese Anordnung unterscheidet sich von der in CED-4 und Dark (Abb. 1 und 2) . Die Stabilität der zentralen Nabe wird durch ein komplexes Netzwerk aus α-helicalen Wechselwirkungen, Wasserstoffbrücken und Salzbrücken zwischen benachbarten NBD- und HD1-Modulen von benachbarten Apaf-1-Molekülen aufrechterhalten. Die WHD/HD1-Kontakte auf benachbarten Protomeren scheinen den Zusammenbau des Apoptosoms zu unterstützen, wobei WHD-Domänen benachbarte NBD- und HD1-Domänen überbrücken. Wie in Dark ist die ISM-Helix in Apaf-1 (α12) mit der Helix α13 durch umfangreiche hydrophobe Wechselwirkungen gepaart, um ein Helix-Schleifen-Helix-Motiv in jeder Untereinheit zu bilden, die wiederum seitlich mit benachbarten Untereinheiten interagieren, um einen helikalen Lattenzaun zu bilden, der die zentrale Pore im Ring säumt .

In gesunden Zellen liegen die Apaf-1-Monomere in einer geschlossenen, inaktiven Konformation vor, bei der ADP in einen Spalt in der Schnittstelle von NBD-HD1 eingebettet ist (PDB 1Z6T, 3SFZ) . Diese geschlossene Konformation lässt vermuten, dass umfangreiche Konformationsänderungen am Monomer erforderlich sind, um die Apoptosombildung zu erleichtern. Im Gegensatz zur Apoptosombildung in C. elegans und Drosophila bindet das während der Apoptose-Signalisierung aus den Mitochondrien freigesetzte Cytochrom c an das monomere Apaf-1, was Konformationsänderungen auslöst, die zu einem Nukleotidaustausch (ATP oder dATP können ADP ersetzen) und einer anschließenden Oligomerisierung eines verlängerten Apaf-1 zur Bildung des Apoptosoms führen (Abb. 3). Um die auftretenden Konformationsänderungen zu verstehen, werden genaue Modelle des inaktiven und des verlängerten Zustands von Apaf-1 benötigt. Es wurden zwei Kristallstrukturen von inaktiven Apaf-1-Monomeren mit gebundenem ADP bestimmt, wobei in einer die β-Propeller und in der zweiten die N-terminalen CARD-Domänen fehlten, um die Kristallisation zu erleichtern. Die NOD in diesen beiden Kristallformen ist jedoch praktisch identisch, so dass ein Konsensmodell für das gesamte Apaf-1-Monomer mit gebundenem ADP erstellt werden konnte. Nahezu atomare Strukturen des menschlichen Apoptosoms wurden nun von mehreren Gruppen mit Hilfe der Einzelpartikel-Kryo-EM erstellt, um Einblicke in die erweiterte Konformation von Apaf-1 in Abwesenheit und Anwesenheit von pc-9 zu erhalten (PDB 3JBT, 5JUY, 5WVE; Abb. 3). Wie vorhergesagt, ist die Konformation von Apaf-1 im zentralen Hub, den HD2-Armen und der regulatorischen Region in inaktiven und aktiven Apoptosomen im Wesentlichen identisch. Diese Studien lieferten wichtige Details über spezifische Reste, die an Van-der-Waals-Kontakten zwischen den Domänen innerhalb einzelner Apaf-1-Moleküle beteiligt sind, enthüllten Reste, die für Domäneninteraktionen, die das aktive Apoptosom stabilisieren, entscheidend sind, und zeigten Interaktionen innerhalb der V-förmigen Sensordomäne der tandemförmigen 7- und 8-blättrigen β-Propeller, die die Cytochrom-c-bindende Oberfläche bildet

Im Apaf-1-Apoptosom befindet sich die dATP-Bindungsstelle an der NBD-HD1-Schnittstelle und wird zum Teil durch die Walker-A-Schleife und die Schleife zwischen HD1 und WHD gebildet. Während Apaf-1 im inaktiven Zustand ADP binden kann, wird für den Apoptosom-Aufbau in vitro bevorzugt dATP verwendet (siehe Literatur), während ATP in vivo viel häufiger vorkommt (~ 2 mM für ATP gegenüber 10 μM für dATP). Eine gewisse Stabilisierung erfolgt durch Wechselwirkungen zwischen einem Argininrest (Arg265) im NBD sowie Ser325 und Tyr359 im HD1 und dem gebundenen ATP/dATP-Molekül. Eine Drehung des NBD-HD1-Paares um die α-Helix 20 im WHD positioniert die HD1-WHD-Schleife am unteren Ende der Nukleotid-Tasche, wodurch das NBD-HD1-Paar während des Zusammenbaus umlaufende Wechselwirkungen innerhalb der zentralen Nabe bilden kann. Dadurch werden auch die Wechselwirkungen mit dem WHD unterbrochen, die normalerweise eine geschlossene Konfiguration stabilisieren.

Sensor-β-Propeller und Cytochrom-c-Bindung

Die „Speichen“ des Apoptosomenrads ragen durch die HD2-Domänen von der Nabe nach außen, und jeder Arm bildet die Basis der V-förmigen Region, die die beiden β-Propeller-Sensor-Domänen enthält. In der längsten Apaf-1-Isoform (Apaf-1XL), die in den meisten Geweben exprimiert wird, bilden die fünfzehn WD40-Wiederholungen tandemförmige 7- und 8-blättrige β-Propeller, und eine kürzlich durchgeführte Kryo-EM-Studie wies darauf hin, dass es sich hierbei um einen neuartigen Schließmechanismus handelt. Diese Topologie der β-Propeller ähnelt der des Aktin-interagierenden Proteins (Aip1p), bei dem der Linker von HD2 den d-Strang des letzten Blattes im 8-blättrigen β-Propeller bildet (angedeutet durch den kleinen blauen Bereich am Anfang des 7-blättrigen Propellers in Abb. 1a), bevor er sich überkreuzt und den 7-blättrigen β-Propeller bildet. Diese Topologie wurde durch eine Kristallstruktur von murinem Apaf-1 mit einer Auflösung von 3,0 Å verifiziert und scheint in den dunklen β-Propellern konserviert zu sein.

Im Apaf-1-Apoptosom bilden die V-förmigen β-Propeller die Cytochrom-c-Bindungstasche, und die Interaktion mit Cytochrom c scheint durch Wasserstoffbrücken und Salzbrücken stabilisiert zu werden. Sowohl reduzierte als auch oxidierte Formen von Cytochrom c können mit dem Apoptosom interagieren, um seine Aktivierung zu vermitteln. Interessanterweise scheint Cytochrom c bevorzugt mit dem 8-blättrigen β-Propeller zu interagieren, während sich mit dem 7-blättrigen β-Propeller eine begrenztere Kontaktfläche bildet. Cytochrom c wird in den neuen Karten aufgrund lokaler Bewegung mit einer Auflösung von ~ 6 Å aufgelöst und das Molekül ist um ~ 90° gedreht, im Vergleich zu einem früheren Modell, das auf molekularem Andocken an eine Karte basiert, in der die Helices nicht aufgelöst wurden. Durch gezielte Mutagenese wurden kritische Reste in Cytochrom c aufgedeckt, die für eine stabile Assoziation mit Apaf-1 β-Propellern erforderlich sind, und einige dieser Reste (G56, P76, I81) sind für die Apoptosombildung und die anschließende Caspase-Aktivierung wichtig.

Trunkierte Apaf-1-Moleküle, denen die WD-40-Wiederholungsregionen fehlen, können sich ebenfalls zu Apoptosomen zusammenfügen, die konstitutiv aktiv sind, sich aber im Laufe der Zeit wieder auflösen. Dies deutet darauf hin, dass β-Propeller den Zusammenbau etwas hemmen und gleichzeitig das Apaf-1-Apoptosom stabilisieren können. Allerdings befinden sich die β-Propeller im Apaf-1-Apoptosom in einem hohen Radius und interagieren weder mit benachbarten Untereinheiten noch mit anderen Domänen im Monomer, mit Ausnahme von HD2. Daher bleibt der Destabilisierungsmechanismus rätselhaft. Obwohl spekulativ, könnte das Fehlen von β-Propellern in verkürzten Apoptosomen die Interaktionen von HD2 mit dem zentralen Hub schwächen, was zu einer zeitabhängigen Demontage führt.

Es ist nun klar, dass die Bindung von Cytochrom c eine Aufwärtsrotation der β-Propeller-Region verursacht, die die Verbindung zwischen dem 7-blättrigen β-Propeller und dem NBD-HD1-Paar im inaktiven Apaf-1-Monomer unterbricht, während der 7-blättrige β-Propeller in Richtung des 8-blättrigen β-Propellers in einer Klemmbewegung rotiert. Diese Ereignisse destabilisieren die autoinhibierte Apaf-1-Konformation und erleichtern den Nukleotidaustausch durch Förderung von Konformationsänderungen, die die ADP-Bindungstasche freilegen, um die ATP/dATP-Bindung zu ermöglichen. Dadurch wird das Apaf-1-Monomer in einer erweiterten Konformation stabilisiert, so dass es mit benachbarten Protomeren interagieren kann. Bandverschiebungsexperimente deuten darauf hin, dass der Nukleotidaustausch und die damit verbundenen Konformationsänderungen in Apaf-1 als Reaktion auf die Bindung von Cytochrom c auftreten können, da bei Zugabe von dATP in Abwesenheit von Cytochrom c keine signifikanten Änderungen der Apaf-1-Konformation festgestellt wurden. Zusammengenommen unterstützen diese Daten ein sequenzielles Modell, bei dem die Cytochrom-c-Bindung vor dem Nukleotidaustausch erfolgt, um den Übergang von einer geschlossenen zu einer erweiterten Apaf-1-Konformation zu erleichtern. Darüber hinaus deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass WD40-Wiederholungen als Sensoren fungieren, die durch die Bindung von Cytochrom c die anfängliche Apoptosom-Assemblierung auslösen.

Mögliche Mechanismen der Procaspase-9-Aktivierung

Procaspase-9 wird durch das Apoptosom rekrutiert, um ein Holoenzym zu bilden, das seine katalytische Aktivität erhöht. In Lösung ist pc-9 ein konstitutives Monomer, wenn es nicht an Apaf-1 gebunden ist, während aktive Caspasen im Allgemeinen Dimere sind. Bemerkenswerterweise fördert eine dimere Interaktion zwischen zwei pc-9 Monomeren in einem Kristallgitter die Bildung einer aktiven Stelle an einer katalytischen Untereinheit, während die zweite Untereinheit in einer inaktiven Konfiguration verbleibt (PDB 1JXQ), und ein ähnliches Phänomen tritt in CED-3 Dimeren bei hoher Konzentration auf. Die N-terminale CARD in pc-9 interagiert mit Apaf-1 CARD(s), um die apikale Procaspase an das Apoptosom zu rekrutieren, und dies fördert die Aktivierung der katalytischen Domäne, die durch einen langen Linker von der CARD getrennt ist (Abb. 2a) . Darüber hinaus sind die p20- und p10-Untereinheiten der katalytischen Domäne ebenfalls durch einen Linker verbunden, der der Selbstspaltung unterliegt. Um zu verstehen, wie pc-9 aktiviert wird, müssen wir also die Rolle der CARDs und der pc-9 Linker im Holo-Apoptosom verstehen.

Es wurden verschiedene Modelle vorgeschlagen, die die Mechanismen der pc-9 Aktivierung durch das Apoptosom erklären. Das „Proximity-induzierte Dimerisierungsmodell“ sagt voraus, dass die Rekrutierung von pc-9-Molekülen an das Apaf-1-Apoptosom die Homodimerisierung erleichtern kann, von der angenommen wird, dass sie zur pc-9-Autoaktivierung führt. Bis vor kurzem konnte jedoch weder strukturell noch biochemisch nachgewiesen werden, dass pc-9 homodimer ist, wenn es an das Apoptosom gebunden ist (siehe unten). Das „induzierte Konformationsmodell“ schlug vor, dass das Apaf-1-Apoptosom eine Plattform ist, die pc-9 bindet, um seine aktive Konformation zu erleichtern. Jüngste Modellierungen legen nahe, dass die Aktivierung von pc-9 in erster Linie über eine allosterische Regulierung durch die Apoptosom-Plattform vermittelt wird. In all diesen Modellen besteht eine primäre Funktion des Apoptosoms darin, einen multimeren Komplex zwischen Apaf-1 und pc-9 CARDs zu bilden, um die Aktivierung von pc-9 zu erleichtern, indem die lokale Konzentration des Zymogens erhöht wird. Darüber hinaus deuten Daten über ein künstlich hergestelltes pc-9, das in Lösung ein konstitutives Dimer ist, darauf hin, dass die CARD und ihr Linker die katalytischen Domänen hemmen können. Daher kann die Bildung eines CARD-Heterodimers auf dem Apoptosom diese Hemmung aufheben; diese Idee muss jedoch noch getestet werden.

Während die Dimerisierung eine Schlüsselrolle bei der Aktivierung spielen kann, ist nicht geklärt, wie dies auf dem Apoptosom geschieht, und in der Tat haben jüngste Daten die Möglichkeit eines komplizierteren Aktivierungsmechanismus nahegelegt, der sowohl die Homodimerisierung von pc-9-Molekülen als auch die Heterodimerbildung einer einzelnen katalytischen pc-9-Domäne mit der NBD von Apaf-1 umfasst. Interessanterweise schließt eine inaktive Konformation des Apaf-1-Monomers die pc-9-Bindung über CARD-CARD-Wechselwirkungen nicht aus, wie Band-Shift-Experimente zeigen. Somit können pc-9/Apaf-1-Heterodimere als Teil der Aktivierung des sich zusammensetzenden Apoptosoms rekrutiert werden (Abb. 3). Es bleibt eine offene Frage, ob die Assemblierung von Apaf-1 in Gegenwart von pc-9 durch zusätzliche Wechselwirkungen zwischen den CARDs in der naszierenden Scheibe gesteuert wird.

Eine erste Kristallstruktur zeigte einen stabilen 1:1-Komplex zwischen den CARD-Domänen von Apaf-1 und pc-9 mit einer komplementären Schnittstelle (bekannt als Typ I), die für die Aktivierung von pc-9 unerlässlich ist. Dieser stabile 1:1-Komplex erwies sich jedoch später als unzureichend, um pc-9 zu aktivieren. Stattdessen bilden Apaf-1 und pc-9 CARDs oligomere Komplexe höherer Ordnung, die hauptsächlich durch zwei von drei möglichen Schnittstellen (bekannt als Typ I, II und III) stabilisiert werden, die auch in anderen Death Domain-Komplexen zu finden sind. Ein Vergleich der Wechselwirkungen, die an der CARD-CARD-Scheibe in den Apoptosomen CED-4, Dark und Apaf-1 beteiligt sind, zeigt, dass Typ-II- und Typ-III-Schnittstellen in gewissem Umfang erhalten bleiben, während Typ-I-CARD-Wechselwirkungen nur im menschlichen Apoptosom vorkommen. Eine neuere Kristallstruktur mit einer Auflösung von 2,1 Å zeigt einen heterotrimeren Komplex, der aus zwei Apaf-1 CARDs und einer dazwischen liegenden pc-9 CARD besteht. Es wurde gezeigt, dass Typ-II-Wechselwirkungen, an denen Reste in den pc-9 (Arg36/ Arg65) und Apaf-1 (Glu78) CARDs beteiligt sind, für die pc-9-Aktivierung entscheidend sind, zusammen mit den zuvor beschriebenen Typ-I-Wechselwirkungen. Darüber hinaus kann ein einziger Rest (Glu41 in der Apaf-1 CARD) eine verzweigte Wechselwirkung mit einer pc-9 CARD in einer minimalen Typ III Schnittstelle bilden. Zusätzliche Wechselwirkungen mit Lys58 und Lys62 auf der Apaf-1 CARD wurden ebenfalls als notwendig für die Aktivierung von pc-9 erwiesen und können dazu beitragen, Apaf-1 CARDs auf der Plattform zu positionieren. Die Bildung eines heterotrimeren CARD-Komplexes stellt somit ein Mittel dar, um mehrere katalytische Domänen von pc-9 an die Apoptosom-Plattform zu binden.

Zwei Strukturen des aktiven Apaf-1-Apoptosoms mit nahezu atomarer Auflösung haben gezeigt, dass die Gesamtarchitektur der Apaf-1- und pc-9-CARD-Scheibenanordnung eine geneigte Scheibe bildet, die oberhalb der zentralen Nabe sitzt (Abb. 2 und 3). Die Symmetriefehlanpassung zwischen Scheibe und Plattform führt dazu, dass die CARD-Scheibe von oben betrachtet azentrisch angeordnet ist (Abb. 3). Die Scheibe kann als eine Spirale aus Apaf-1- und pc-9-CARD-Paaren beschrieben werden, wobei vier Apaf-1-CARDs eine untere „Schicht“ bilden, während drei oder vier pc-9-CARDs auf der oberen Oberfläche vorhanden sind (Abb. 2b-d). Darüber hinaus bewegen sich die Apaf-1 CARDs weiter von der Oberfläche des zentralen Nabens weg, da sie sich spiralförmig nach oben bewegen und somit unterschiedliche Linker-Konformationen und unterschiedliche Wechselwirkungen mit ihren verwandten NBDs im zentralen Nabenbereich haben. Die Apaf-1- und pc-9-CARD-Paare interagieren über Typ-II-Schnittstellen und verbinden sich seitlich um die Spirale hauptsächlich über Typ-I-Wechselwirkungen. Bemerkenswert ist, dass nur vier der sieben Apaf-1 CARDs mit den pc-9 CARDs in der Scheibe interagieren. Dies liegt daran, dass die verbleibenden drei Apaf-1 CARD-Moleküle nicht ohne weiteres in das Untereinheiten-Bindungsmuster der Spirale passen und die Spirale nicht fortsetzen können, weil ihre CARD-NBD-Linker zu kurz sind. Apaf-1 CARDs von benachbarten Untereinheiten im Apoptosom befinden sich an einer Nahtstelle (zwischen den Positionen 1a und 7a), wo die Spirale aufhört, sich vertikal zu verlängern (Abb. 2c, d) . Die Bildung der Apaf-1/pc-9 CARD-Scheibe ist für die Aktivierung des Apoptosoms erforderlich, und die katalytischen pc-9-Domänen sind über einen Linker flexibel an die CARDs gebunden (Abb. 2a). In einer Struktur wurde eine Scheibe mit vier Apaf-1 CARDs und drei pc-9 CARDs sichtbar gemacht, wobei eine schwache Dichte darauf hindeutet, dass eine vierte pc-9 CARD am oberen Ende der helikalen Spirale bei geringerer Belegung binden könnte. In einer zweiten Struktur enthielt die vorherrschende Konfiguration der Scheibe 8 CARDs, wobei die Konformation der CARDs in der Spirale zwischen den beiden unabhängig voneinander gelösten Strukturen sehr ähnlich war (siehe Overlay, Abb. 2d). Variationen des pH-Werts und der Salzkonzentration könnten für die unterschiedliche Belegung der achten Position verantwortlich sein. Somit fördert die Apoptosom-Assemblierung die Rekrutierung und lokale Konzentration von pc-9 CARDs, was die Bildung eines neuartigen helikalen Oligomers mit 7 oder 8 CARDs ermöglicht.

Eine kürzlich durchgeführte Analyse (mittels MALS und SAXS) zeigte, dass die Bildung von CARD-Komplexen konzentrationsabhängig ist und gleiche Mengen von Apaf-1 und pc-9 CARDs als Paare über die stärkere Typ-I-Schnittstelle assoziieren, wobei bei hoher Konzentration in Lösung ein vorherrschender 3:3-Komplex gebildet wird. Dieser CARD-Komplex wurde kristallisiert und die Struktur mit einer Auflösung von 3,0 Å bestimmt, um eine linkshändige Spirale aus drei Apaf-1/pc-9 CARD-Paaren zu zeigen, deren Konformation der im Apoptosom beobachteten ähnelt, jedoch mit einigen Unterschieden (PDB 5WVC; Abb. 2e). Die Umgebung im Kristall unterscheidet sich jedoch deutlich von der des sich zusammensetzenden Apoptosoms, was zum Teil auf Gitterkontakte und das Fehlen einer Keimbildungsfläche mit Beschränkungen durch CARD-NBD-Linker zurückzuführen ist. Dies könnte der Grund für die beobachteten Unterschiede zwischen den helikalen CARD-Strukturen sein. Dazu gehören die Hinzufügung von ein oder zwei zusätzlichen CARDs zu der scheibenartigen Spirale im Holo-Apoptosom und die Tatsache, dass vier Apaf-1-CARDs die Basis der Scheibe bilden, anstatt drei wie in der Lösung und im Kristall gefunden. Nach optimaler Ausrichtung der 8-CARD-Scheibe mit der 6-CARD-Spirale aus der Kristallstruktur ergibt sich eine gute Übereinstimmung zwischen den CARDs an den Positionen 2p, 3a und 4p, mit einer gewissen Divergenz in der letzten Hälfte der 6-CARD-Spirale (Abb. 2f, g). Insbesondere ist die Apaf-1 CARD an Position 7a vertikal in eine Zwischenposition verschoben, während die Apaf-1 CARD an Position 1a fehlt (Abb. 2g). Somit sind Wechselwirkungen zwischen der Plattform und der CARD-Scheibe entscheidend für die Keimbildung der größeren 7- und 8-CARD-Spiralen, die auf dem Apoptosom zu finden sind.

Während des Zusammenbaus der Scheibe kann die Keimbildung der Spirale auf verschiedene Weise erfolgen, einschließlich der Bildung eines CARD-Heterotrimers, das aus zwei Apaf-1-CARDs und einer pc-9-CARD besteht, wobei sich eine Apaf-1-CARD an der Basis der Spirale (an Position 1a) befindet. Anschließend können zwei Apaf-1/pc-9 CARD-Paare hinzugefügt werden, die über ihre Typ-I-Schnittstellen interagieren, wobei die Spirale in einigen Fällen durch eine pc-9 CARD an Position 8p abgeschlossen wird. Angesichts der flexiblen Natur des Apaf-1 CARD-NBD-Linkers sind jedoch auch andere Permutationen möglich, so dass drei Apaf-1/pc-9 CARD „Typ I“-Paare nacheinander von der zentralen Nabe aus gebildet werden können, wobei in den frühen Phasen des Zusammenbaus eine Apaf-1 CARD an der Basis der Spirale (an Position 1a) hinzugefügt wird. Wichtig ist, dass der Zusammenbau der Scheibe kooperativ erfolgen kann, um den richtigen Abstand der vier Apaf-1 CARDs auf dem Apoptosom, die die Basis der Spirale bilden, aufrechtzuerhalten.

Beim aktiven Apoptosom ist beim Vergleich der veröffentlichten Strukturen (Abb. 3 und 4) ein wesentlicher Unterschied an der zentralen Nabe erkennbar. Kurz gesagt, die Dichte, die in einer neueren 3D-Karte als katalytische Domäne von pc-9 (p20/p10) identifiziert wurde, befindet sich auf der zentralen Nabe, und es wurde festgestellt, dass dieses Merkmal in etwa 50 % der Komplexe vorhanden ist. Darüber hinaus wurde eine ähnliche Dichte in einer früheren, niedriger aufgelösten Karte des Holo-Apoptosoms sichtbar gemacht, die ein vernünftiges, wenn auch vorläufiges Andocken der p20/p10-Untereinheiten ermöglichte; daher ist das beobachtete Merkmal reproduzierbar. Diese neuartige Dichte wurde jedoch nur bei niedriger Auflösung sichtbar gemacht, was eine gewisse Flexibilität bei der Befestigung der p20/p10-Untereinheiten an der zentralen Nabe widerspiegeln könnte. In einer Karte mit nahezu atomarer Auflösung, die von der Gruppe von Yigong Shi erstellt wurde, wurde eine zusätzliche sichelförmige Dichte mit einer Auflösung von etwa 7 Å auf der zentralen Nabe, angrenzend an die CARD-Scheibe, aufgelöst. Diese Dichte enthält eindeutig eine zusätzliche pc-9 CARD in der Mitte, die mit zwei Apaf-1 CARDs auf beiden Seiten interagiert, ähnlich wie es in zwei Kristallstrukturen beobachtet wurde. Diese heterotrimere Konfiguration konnte jedoch nur in ~ 10% der Partikel aufgelöst werden. Es scheint also, dass die experimentellen Bedingungen während der Probenvorbereitung und des Einfrierens des Gitters die Art und Weise beeinflussen können, wie pc-9 mit potenziellen Bindungsstellen auf der zentralen Nabe interagiert, einschließlich der Bildung einer scheibenartigen Spirale mit einer variablen Anzahl von pc-9 CARDs und der Nutzung von Bindungsstellen, die sich neben der azentrischen Scheibe befinden. Wenn die beiden neuen asymmetrischen Strukturen des Holo-Apoptosoms anhand ihrer CARD-Scheiben ausgerichtet werden, befinden sich die neuartigen Dichtespitzen auf der zentralen Nabe an ganz unterschiedlichen Stellen (Abb. 4). Während sich die katalytische Domäne von pc-9 (p20/p10) an zwei Positionen befinden kann (die wahrscheinlichste ist in Abb. 4c dargestellt), ist die dreifache CARD-Dichte gedreht und weist von der Seite betrachtet ein anderes Profil auf (nicht dargestellt) als die der katalytischen Domäne von pc-9 (Abb. 4b, d). Das Muster der Apaf-1 CARD-NBD Linker-Dichten ermöglicht eine genaue Zuordnung aller relevanten CARD-NBD Linker im Drei-CARD-Holo-Apoptosom mit sechs geordneten Apaf-1 CARDs (Abb. 4d) . Kritisch ist, dass die Linkerlänge (~ 25-30 Å) und die relativen Positionen der Linker die Bindung eines Drei-CARD-Moduls entweder an Position 1 oder 2 auf dem zentralen Hub ausschließen können. Es scheint also, dass es mehrere Stellen auf der zentralen Nabe gibt, die auf unterschiedliche Weise genutzt werden können, um eine pc-9 CARD oder eine katalytische Domäne zu binden.

Procaspase-9 bindet schätzungsweise in einem Verhältnis von 2-5 Zymogenen pro 7 Apaf-1-Moleküle an das Apoptosom, so dass die genaue Anzahl der an das Apoptosom gebundenen pc-9-Moleküle je nach den Bedingungen während des Zusammenbaus variieren kann, was die dynamische Natur dieser proteolytischen Maschine widerspiegeln könnte. Außerdem scheint es klar zu sein, dass eine sechste oder siebte pc-9 CARD nicht von ihren Apaf-1-Gegenstücken gebunden wird, im Vergleich zu den bereits dokumentierten Stellen auf dem Apoptosom, was entweder eine sterische Beschränkung oder die Notwendigkeit eines größeren Oligomers zur Stabilisierung der gebundenen pc-9 CARDs widerspiegeln könnte. Wichtig ist, dass einige katalytische Domänen von pc-9 in den aktuellen Kryo-EM-Dichtekarten nicht zu sehen sind, da sie durch lange CARD-p20-Linker flexibel gebunden sind, was die Entschlüsselung und das Verständnis der genauen Aktivierungsmechanismen erschwert und gleichzeitig den Bedarf an weiteren Einzelmolekülstudien hervorhebt.

Die Hauptfunktion des Apoptosoms ist die Aktivierung von pc-9, damit es die Apoptose durchführen kann. Während Strukturstudien einen Einblick in die Rekrutierung und die Voraussetzungen für die Aktivierung von pc-9 gegeben haben, hat eine Reihe von biochemischen Assays nun gezeigt, dass sowohl die durch die Nähe induzierte Dimerisierung als auch die allosterische Regulierung des monomeren pc-9 für die Regulierung der Apoptosomfunktion entscheidend sind und auch die Dauer der Apoptosomaktivität bestimmen können. Erstens erhöht die Rekrutierung von pc-9 durch das Apoptosom seine lokale Konzentration, um eine Homodimerisierung zu ermöglichen, die seine Affinität für den Komplex erhöht. Interessanterweise neigt ein nicht spaltbares pc-9 stärker zur Homodimerisierung und zeigt eine höhere Proteaseaktivität (Caspase-3-Spaltung) innerhalb des Apoptosoms als gespaltene Caspase-9. Infolgedessen verringert die Spaltung des p20/p10-Linkers zwischen den Untereinheiten der katalytischen Domäne die Affinität von pc-9 für das Apoptosom, und nach der Verarbeitung wird Caspase-9 freigesetzt und bindet nicht erneut an das Apoptosom. Wichtig ist, dass diese Studien gezeigt haben, dass die Homodimerisierung von pc-9 das Schlüsselereignis ist, das für die Aktivierung erforderlich ist, und dass das Apoptosom dieses Ereignis erleichtert. Dies steht im Einklang mit biochemischen Untersuchungen anderer CARD-Caspasen, wie Caspase-2 und Dronc, bei denen die anfängliche Aktivierung eher eine Dimerisierung als eine Spaltung des Zymogens erfordert. Die Stabilisierung der pc-9-Bindung an das Apoptosom erfordert nicht nur CARD-CARD-Interaktionen, sondern auch Interaktionen der kleinen pc-9-Untereinheit (p10) über ihr GCFNF404-Motiv zur Bildung von Homo- und Heterodimeren. Unklar ist derzeit, wie sich die Bildung von pc-9 Homodimeren auf die Stabilität der CARD-CARD-Scheibe auswirkt, da die Dimere der katalytischen Domäne recht flexibel zu sein scheinen, da sie durch ortsgerichtete Thrombinolyse aus dem Holo-Apoptosom freigesetzt werden können und in den ohne Symmetrie verfeinerten Kryo-EM-Karten nicht aufgelöst werden. Das GCFNF-Motiv in pc-9 interagiert auch mit einem Apaf-1 NOD, um pc-9/Apaf-1 Heterodimere zu bilden, die effizient Caspase-3 spalten. Diese Daten legen nahe, dass eine katalytische Domäne von pc-9, die direkt mit dem Apoptosom interagiert, aktiv sein könnte. Diese mutmaßlich aktive Stelle für die Spaltung von Caspase-3 könnte mit der neuartigen Dichte korrespondieren, die an der zentralen Nabe beobachtet wurde und als p20/p10-Molekül interpretiert wurde; zu diesem Punkt sind weitere Untersuchungen erforderlich. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass pc-9 innerhalb des Apoptosoms zwei verschiedene aktive Konformationen haben kann, wobei ein oder möglicherweise zwei Homodimere an die CARD-Scheibe gebunden sind und ein pc-9/Apaf-1-Heterodimer an den zentralen Hub gebunden ist. Berücksichtigt man Holo-Apoptosomen mit drei an den zentralen Hub gebundenen CARD-Modulen, so sind mindestens sechs Permutationen für die Anordnung von drei bis fünf katalytischen pc-9 Domänen möglich (Abb. 5). Die Anzahl der möglichen aktiven katalytischen pc-9-Domänen (als Homodimere und Heterodimere) hängt also von der Anzahl der pc-9-Moleküle ab, die in das Apoptosom rekrutiert werden, da sie mögliche Bindungsstellen ausfüllen, die durch Apaf-1 CARDs vermittelt werden.

Schließlich wird durch die vollständige Spaltung von pc-9 durch Caspase-3 der Linker zwischen den Untereinheiten entfernt und die volle Aktivität von Caspase-9 wiederhergestellt, was darauf hindeutet, dass Caspase-3 auch eine proteolytische Rückkopplung auf pc-9 hat, die das apoptotische Signal verstärken kann. Ein ähnlicher Mechanismus wurde auch für Caspase-2 vorgeschlagen. Diese biochemischen Studien haben ferner ein molekulares Zeitgebermodell vorgestellt, bei dem die Geschwindigkeit der Dissoziation von Caspase-9 vom Apoptosom durch eine anfängliche Spaltung des p20-p10-Linkers bestimmt wird, die seine Apoptosom-Bindungsaffinität verringert. Eine vollständige Dissoziation der gespaltenen Caspase-9 vom Holo-Apoptosom würde jedoch die Freisetzung ihrer CARD von der Scheibe oder dem Drei-CARD-Modul erfordern. Somit könnte es eine Hierarchie für die Freisetzung aktiver Caspase-9-Moleküle geben, die von der lokalen Umgebung ihrer CARDs abhängt. Das Design der CARD-Scheibe, bei der sich alle pc-9 CARDs auf der Oberseite befinden, könnte auch die Freisetzung von Caspase-9 erleichtern.