PEG-Fällung: Ein leistungsfähiges Werkzeug für die Reinigung monoklonaler Antikörper

Es hat sich gezeigt, dass die Methode der Pelletabscheidung einen erheblichen Einfluss auf die Reinheit des wieder aufgelösten Produkts hat. Der Fällungsschritt ist leicht skalierbar und passt zu einem vollständig einsatzfähigen nachgeschalteten Prozess.

Percivia LLC

Es wird nach Alternativen zur Festbettchromatographie gesucht, um den Zeit- und Kostenaufwand für die Verarbeitung hochtitriger Produktströme zu verringern. Obwohl sich viele Bemühungen auf Membranadsorber konzentrieren, die Säulen gleicher oder ähnlicher chemischer Zusammensetzung direkt ersetzen, beginnen einige ältere Technologien in der rekombinanten Proteinherstellung an Boden zu gewinnen. Eine attraktive Alternative zur Chromatographie ist die Fällung, die in der Plasmaproteinindustrie seit vielen Jahren eingesetzt wird.1 Eine einfache Methode der Fällung besteht darin, die Prozessflüssigkeit auf den isoelektrischen Punkt des auszufällenden Proteins zu titrieren.2 Lyotrope Salze wie Ammoniumsulfat werden ebenfalls seit langem in Fällungsprozessen verwendet.3 Kurzkettige Fettsäuren wie Caprylsäure sind für ihre Fähigkeit bekannt, DNA und Wirtszellproteine (HCPs) zu fällen.4 Polyionische Spezies sind ebenfalls nützliche Fällungsmittel, um ein gewünschtes Produkt abzufangen oder kontaminierende Proteine zu entfernen.5,6

Polyethylenglykol (PEG) wurde zur Fällung von Produkten und Verunreinigungen verwendet.7,8 Es kann auch mit isoelektrischer Fällung kombiniert werden, um die Effizienz der Trennung zu verbessern.9,10 Nach der Fällung kann eine Fest-Flüssig-Trennung durch Zentrifugation oder Filtration durchgeführt werden.11 Obwohl die Zentrifugation eine bewährte Methode zur Erzielung dieser Trennung ist, könnte das Waschen des Produktpellets zur Entfernung von Verunreinigungen problematisch sein, und es ist nicht für ein Einwegverfahren geeignet. Die Filtration – normale oder tangentiale Strömung – erfordert mehr Entwicklungsarbeit, aber das Waschen des Pellets ist einfacher und lässt sich ohne weiteres an ein Einwegverfahren anpassen.

In der vorliegenden Arbeit wurde ein Produktfällungsschritt unter Verwendung von PEG entwickelt, um einen monoklonalen Antikörper (MAb) aus geklärten PER.C6-Zellkulturmedien zu gewinnen. Geeignete Fällungsbedingungen wurden durch den Einsatz von vollfaktoriellen Versuchsplänen ermittelt. Zwei Filtrationsschritte wurden für das Auffangen und Waschen des ausgefällten Produkts bewertet, und die überlegene Methode wurde 10-fach vergrößert. Der gesamte Fällungsprozess führte zu einer Ausbeute von ca. 90 % und einer HCP-Reduktion von 1 LRV ohne signifikante Erhöhung des Aggregatniveaus des wiedergelösten MAb. Schließlich wurden die Auswirkungen des Fällungsschritts auf den anschließenden Kationenaustauschschritt (CEX) untersucht.

Materialien und Methoden Reagenzien

USP-Salze, Tween 20, Salzsäure, Essigsäure und Natriumhydroxid wurden von JT Baker (Phillipsburg, NJ) bezogen. PEG war Reagenzienqualität und wurde von JT Baker oder EMD Chemicals (Gibbstown, NJ) bezogen. Alle Puffer wurden mit MilliQ-Wasser (Millipore, Billerica, MA) hergestellt und vor der Verwendung durch 0,22-µm-Filtration gefiltert.

Feedstock

Ein humaner MAb (IgG1, pI = 8,3, 150 kDa) wurde bei Percivia, LLC unter Verwendung einer PER.C6-Zelllinie hergestellt. PER.C6-Zellen sind humane embryonale Netzhautzellen, die durch das Adenovirus-E1-Gen immortalisiert wurden, wie im US-Patent 5,994,128 beschrieben.12 Die Zellen wurden in einem Standard-Fed-Batch-Verfahren oder dem XD-Verfahren kultiviert, die beide chemisch definierte Medien verwenden.13,14 Die Fed-Batch-Medien wurden durch Sedimentation und Tiefenfiltration geklärt, während die XD-Medien durch die ECS-Methode (Enhanced Cell Settling) und anschließende Tiefenfiltration geklärt wurden.15 Bei der ECS-Methode wurde Silica-PEI-Harz verwendet, um das Absetzen der Zellen zu verbessern und auch DNA und HCP zu reduzieren.

Optimierung der Fällungsbedingungen

Die Bedingungen für die Ausfällung von MAb – PEG-Molekulargewicht, PEG-Konzentration und pH-Wert – wurden durch vollfaktorielle Versuchspläne mit der Software Minitab (State College, PA) optimiert. Der pH-Wert des geklärten XD-Mediums wurde mit 2-M Tris in einem konischen 15-mL-Röhrchen auf den gewünschten Wert eingestellt. Das PEG wurde als 40%ige (w/w) Stammlösung bis zur gewünschten Endkonzentration zugegeben. Das Röhrchen wurde dann bei 1.000 g zentrifugiert und der Überstand dekantiert. Schließlich wurde das Pellet in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) wieder aufgelöst.

Pellet-Aufnahme durch Tiefenfiltration oder Mikrofiltration

Die Tiefenfiltration wurde mit verschiedenen Filtermedien durchgeführt. Millistak+HC D0HC, C0HC und X0HC wurden von Millipore Corp. (Billerica, MA), und ZetaPlus 60SP02A wurde von Cuno (Meriden, CT) erworben. Die Fällung erfolgte unter Verwendung einer 40%igen (w/w) Stammlösung von PEG-3350, und das gefällte Medium wurde mit einem Zufuhrfluss von 50 L/m2 /h beladen, bis das gesamte Material geladen war oder der Transmembrandruck (TMP) 15 psid betrug. Die Filter wurden dann mit 20-30 l/m2 20 mM Tris pH 8,5 + 14,4 % (w/w) PEG-3350 gewaschen. Nach dem Waschen wurden 80 l/m2 Resolubilisierungspuffer mit 100 l/m2 /h durch die Filter geleitet, und das Permeat wurde mit 600 l/m2 /h durch die Vorrichtung rezirkuliert, bis der A280-Wert des Permeatpools stabil war, was auf eine vollständige MAb-Auflösung hindeutet. Abschließend wurde das zurückgehaltene Produkt mit einer 20 l/m2-Pufferspülung und einem Abblasen des Filtermoduls mit Luft zurückgewonnen. In einigen Tests wurde das Filtermedium anschließend mit 85 mM Acetat pH 5,3 und anschließend mit 1 M NaCl gewaschen. Druck- und Durchflussdaten wurden mit einem speziell entwickelten System von ARC Technology Services (Nashua, NH) erfasst.

Die Mikrofiltration wurde mit einer 0,22-µm-Hohlfasermembran von GE Healthcare Life Sciences (Piscataway, NJ) durchgeführt. Das PEG-3350 wurde als 40%ige (w/w) Stammlösung für das Experiment im kleinen Maßstab und in Pulverform für die Scale-up-Arbeiten zugegeben. Der Zufluss betrug 710 l/m2 /h, Retentat und Permeat waren unbeschränkt. Das Präzipitat wurde zunächst 10- bis 14-fach konzentriert und dann mit drei Diafiltrationsvolumina von 20 mM Tris pH 8,5 plus 14,4 % (w/w) PEG-3350 gewaschen. Schließlich wurde das Präzipitat in 85 mM Natriumacetat pH 5,3 oder 20 mM Tris plus 50 mM NaCl pH 7,5 wieder aufgelöst. Druck-, Durchfluss- und Leitfähigkeitsdaten wurden mit einem Slice 200 Benchtop-System (Sartorius, Göttingen, Deutschland) für Tests im kleinen Maßstab und einem SciPro-System (SciLog, Middleton, WI) für den Scale-up-Versuch erfasst.

Kationenaustauschchromatographie

Toyopearl GigaCap S-650 wurde von Tosoh Bioscience (Montgomeryville, PA) im Toyoscreen 5-mL-Format beschafft. Dieses Harz hat sich bereits früher als Hochkapazitäts-Capture-Schritt für MAbs erwiesen.16 Die Säule wurde mit 74-mM-Natriumacetat pH 5,3 äquilibriert und mit 90-95 mg-MAb/mL Harz beladen, wobei entweder geklärte Medien oder geklärtes und PEG-behandeltes Material verwendet wurden, die jeweils auf denselben pH-Wert und dieselbe Leitfähigkeit wie der Äquilibrierungspuffer eingestellt waren. Die Säule wurde dann mit Äquilibrierungspuffer gewaschen und der Antikörper mit 50 mM Natriumacetat pH 5,3 plus 90 mM NaCl eluiert.

Analytische Techniken

Die MAb-Konzentration in medienhaltigen Proben wurde durch analytische Protein A HPLC (Applied Biosystems, Foster City, CA) bestimmt. Die Aggregatkonzentrationen wurden durch Größenausschlusschromatographie (SEC) mit einer TSKgel G3000SWXL-Säule von Tosoh Bioscience (Montgomeryville, PA) gemessen, wobei die Peaks durch UV-Absorption bei 280 nm nachgewiesen wurden. Der HCP-Gehalt wurde mit einem PER.C6-spezifischen ELISA von Cygnus Technologies (Southport, NC) quantifiziert. Die SDS-PAGE wurde mit NuPAGE 4-12% Bis-Tris-Gelen durchgeführt und die Färbung erfolgte mit SimplyBlue SafeStain, beides von Invitrogen (Carlsbad, CA).

Ergebnisse und Diskussion Fällungsbedingungen

Für beide Molekulargewichte von PEG, 3.350 und 6.000 Da, war die PEG-Konzentration der dominierende Faktor für die Wiedergewinnung und Reinheit des wiedergelösten MAb. Die Fällung mit PEG-3350 führte zu der höchsten Wiederfindung (Abbildung 1). Die höhere Wiederfindung ging jedoch auf Kosten einer höheren HCP-Belastung des wiedergelösten MAb. Im Falle von aggregiertem MAb unterschieden sich die Werte nicht wesentlich vom Ausgangsmaterial, aber es ist zu beachten, dass das in dieser Arbeit verwendete MAb nicht zur Bildung von Aggregaten neigt. Die Verbesserung der HCP-Reduktion durch die Verwendung von PEG-6000 wurde durch die Verringerung der Produktausbeute ausgeglichen. Als endgültige Bedingung wurden 14% (w/v) PEG-3350 (entspricht 14,4% w/w) und pH 8,5 gewählt.

Abbildung 1

Einfangen des Pellets durch Tiefenfiltration

Im ersten Experiment wurde ECS-geklärtes XD-Medium ausgefällt und das Pellet durch Tiefenfiltration mit X0HC-Medium eingefangen. Es wurde kein wesentlicher Anstieg des Transmembrandrucks (TMP) während der Beladung mit 361 g-MAb/m2 beobachtet (Daten nicht gezeigt). Nach dem Waschen erfolgte die Resolubilisierung des immobilisierten Pellets mit 85 mM Acetat pH 5,3. Selbst nach 2-stündiger Rezirkulation hatte sich der Antikörper noch nicht vollständig aufgelöst, so dass dem Resolubilisierungspuffer 0,1 % v/v Tween 20 zugesetzt wurde. Nach weiteren 30 Minuten Resolubilisierung war der MAb vollständig aufgelöst.

Tabelle 1. Ausbeute und Entfernung von Verunreinigungen bei der PEG-Fällung durch Tiefenfiltration mit X0HC zur Gewinnung des Produkts

Die Massenbilanzdaten sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Die HCP-Reduktion war geringer als im vorangegangenen Versuch (Abbildung 1), bei dem nur 5.000 ppm HCP im Endpool enthalten waren, im Vergleich zu 8.300 ppm in diesem Versuch. Von einigen Tiefenfiltern ist jedoch bekannt, dass sie hydrophobe und anionenaustauschende (AEX) Adsorptionseigenschaften aufweisen.17 Das gefällte Medium wurde bei einem relativ hohen pH-Wert (8,5) und einer niedrigen Leitfähigkeit (<10 mS/cm) beladen, was die Bindung von sauren Proteinen an eine AEX-Matrix bewirkt haben könnte. Außerdem hat sich gezeigt, dass die Proteinbindungskapazität von Ionenaustauschermatrizen in Gegenwart von PEG zunimmt.18,19 Daher ist es wahrscheinlich, dass einige der nach der Fällung in Lösung verbliebenen HCPs an das Tiefenfiltermedium gebunden und während der Resolubilisierung in das Produkt eluiert wurden. Diese Hypothese wird auch durch den Unterschied im HCP-Gehalt des Fällungsüberstandes und des Tiefenfilter-Durchflusses (9.900 versus 240 mg) gestützt, was auf eine HCP-Entfernung aus der Lösung durch den Tiefenfilter hindeutet. Nach der Immobilisierung des Antikörpers auf dem Tiefenfilter wurde er bei einem deutlich niedrigeren pH-Wert (5,3) wieder aufgelöst, was zu einer Elution des gebundenen HCP führte und die Reinheit des Endprodukts verringerte. Dieses Phänomen könnte durch die Verwendung von weniger adsorptiven Tiefenfiltermedien wie Millistak+HC D0HC/C0HC und ZetaPlus SP-Filtern wie 60SP02A oder durch die Wiederauflösung des Produkts in einem salzarmen Puffer mit höherem pH-Wert wie 20-mM Tris pH 7,5 abgeschwächt werden.

Abbildung 2

Diese Strategien wurden getestet, indem gefällte Fed-Batch-Medien auf D0HC-, C0HC-, X0HC- und 60SP02A-Filter geladen wurden. Alle Filter wurden auf die gleiche Weise mit dem PEG/Tris-Puffer gewaschen, aber die Resolubilisierung erfolgte mit 20 mM Tris pH 7,5 plus Tween 20 für die Millipore-Filter und 85 mM Acetat pH 5,3 plus Tween 20 für die Cuno-Filter. Die Millipore-Filter wurden auch mit einem Puffer mit niedrigem pH-Wert (85 mM Acetat pH 5,3) und hohem Salzgehalt (1 M NaCl) gestrippt, nachdem das Produkt wiedergewonnen worden war, um festzustellen, ob gebundene HCPs eluiert werden konnten. Abbildung 2 zeigt, dass alle getesteten Filter stark verschmutzt waren. Da das Fed-Batch-Medium nicht mit der ECS-Methode geklärt wurde, die nachweislich den DNA-Gehalt in XD-Ernten erheblich reduziert, ist möglicherweise mehr DNA vorhanden, die in hohen PEG-Konzentrationen ausfällt.20 Der höhere DNA-Gehalt im Niederschlag könnte die Filterkapazitäten verringert haben, was jedoch nicht untersucht wurde. Tabelle 2 zeigt, dass jedes der Experimente zu einer besseren HCP-Reduktion führte (84-88 % gegenüber 46 %), und obwohl die HCP-Ausgangsbelastung höher war (49.000 ppm gegenüber 13.000 ppm), wiesen die wieder aufgelösten MAb-Pools im Allgemeinen niedrigere HCP-Gehalte auf (6.000-7.800 ppm gegenüber 8.300 ppm). Die Verwendung von Filtern mit geringer Adsorption und die Wiederauflösung in einem Puffer mit höherem pH-Wert scheinen das Problem der aus den Tiefenfiltermedien eluierten HCPs zu lösen. Die SDS-PAGE der Streifenfraktionen ergab, dass sowohl HCPs als auch das Produkt an die Filter gebunden waren – einschließlich der weniger adsorptiven D0HC- und C0HC-Filter – und bestätigte, dass X0HC-Medien stärker adsorptiv waren als D0HC- und C0HC-Medien (Abbildung 3).

Tabelle 2. Ausbeute und Entfernung von Verunreinigungen bei der PEG-Fällung durch Tiefenfiltration mit verschiedenen Filtermedien zur Rückgewinnung des Produkts

Pellet Capture durch Mikrofiltration

Obwohl die HCP-Belastung des wieder aufgelösten MAb durch die Verwendung eines Puffers mit höherem pH-Wert und weniger adsorptiver Tiefenfiltermedien verringert wurde, waren die Kapazitäten der Tiefenfilter bei Medien mit Zufuhr gering (<400 g-MAb/m2 ). Die Mikrofiltration (Tangentialflussfiltration, MF TFF) wurde mit dem Ziel getestet, die Kapazität zu verbessern, mit dem zusätzlichen Vorteil, dass aufgrund der geringen Bindungscharakteristik der Hohlfaser jeder Puffer zur Resolubilisierung verwendet werden kann. Die hydraulische Leistung der MF-TFF-Konzentration und des Waschens von Niederschlag im Feed-Batch-Verfahren ist in Abbildung 4 dargestellt. Der Permeatfluss betrug etwa 100 L/m2 /h und der TMP lag während des gesamten Betriebs zwischen 1,0 und 2,5 psid. Die Massenbeladung von 475 g-MAb/m2 war besser als die in allen Tiefenfiltrationsverfahren erreichte. Die Produktrückgewinnung und die HCP-Reduktion lagen beide bei etwa 90 % und damit etwas besser als bei der Tiefenfiltration (Tabelle 3).

Abbildung 3

Die Resolubilisierung war viel einfacher und schneller als bei der Tiefenfiltration; anstatt Puffer durch das Gerät zu rezirkulieren, wurde der Puffer durch das Innere der Lumen in den Retentatbehälter gepumpt, wobei das Permeat geschlossen war, und etwa 60 Minuten lang gemischt. Dies war ausreichend, um den Antikörper wieder aufzulösen, und es wurden keine Hilfsstoffe benötigt. Aufgrund der Schwierigkeiten bei der Resolubilisierung durch Tiefenfiltration wurde das Produkt bei oder nahe der Konzentration im Zufuhrmedium wieder aufgelöst. Der endgültige Pool aus dem MF-TFF-Verfahren war fast zweifach konzentrierter als das Ausgangsmaterial.

Abbildung 4

Da das Retentat und das Permeat zum Atmosphärendruck hin offen waren, war nur eine minimale Instrumentierung erforderlich: eine Querstrompumpe, ein Drucksensor und eine Transferpumpe für die Diafiltration. Die Kombination aus hoher Kapazität, hoher Rückgewinnung und HCP-Reinigung sowie der einfachen Bedienung machen die MF-TFF zu einer bevorzugten Option für die Pelletabscheidung im Vergleich zur Tiefenfiltration. Der Schritt der Fällung und MF-TFF wurde um das Zehnfache auf ein 0,12 m2 großes Hohlfasergerät vergrößert, und die Leistung war mit dem kleinen Maßstab vergleichbar (Tabelle 4).

Tabelle 3. Ausbeute und Entfernung von Verunreinigungen bei der PEG-Fällung mit Mikrofiltration zur Rückgewinnung des Produkts im Labormaßstab

Kationenaustauschchromatographie

Die Kationenaustauschchromatographie (CEX) mit hoher Kapazität wurde mit Feeds bewertet, die mit oder ohne PEG-Fällung vorbehandelt wurden. Der Fällungsschritt hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Schrittausbeute oder die prozentuale Reduktion der HCPs, aber das Eluat, das aus dem gefällten Beladungsmaterial resultierte, hatte siebenmal weniger HCP (Tabelle 5).

Tabelle 4. Ausbeute und Entfernung von Verunreinigungen bei der PEG-Fällung mit Mikrofiltration zur Rückgewinnung des Produkts im Pilotmaßstab

Schlussfolgerungen

Die Fällung wird in der Plasmaproteinindustrie seit langem zur Reinigung von Proteinen in großem Maßstab eingesetzt. Die Technik wurde hier für die anfängliche MAb-Reinigung aus geklärten Fed-Batch- und XD-Medien in skalierbarer Weise angepasst. Es wurden zwei Einweg-Filtrationsschritte entwickelt, um das ausgefällte Produkt aufzufangen und zu waschen, so dass eine Zentrifugation nicht mehr erforderlich ist. Es wurde gezeigt, dass der Fällungsvorgang die Ausbeute des CEX-Abscheidungsschritts nicht negativ beeinflusst und den HCP-Gehalt des Eluats um das Siebenfache reduziert.

Tabelle 5. Ausbeute und HCP-Entfernung für GigaCap S-650, das mit gefällten (+PEG) und nicht gefällten (âPEG) Antikörpern beladen ist

Die Fähigkeit, die Verunreinigungsbelastung so weit stromaufwärts im Reinigungsprozess zu reduzieren, ist der Schlüssel zur Verkürzung des nachgeschalteten Prozesses oder zum Ersatz der traditionellen Chromatographie durch andere Einwegtechnologien. Eine geringere Verunreinigungslast kann die Beladungskapazität von Durchflussmembranadsorbern und möglicherweise Virusfiltern verbessern, die im Allgemeinen sehr teure Bestandteile eines Prozesses sind.

Ein zusätzlicher Vorteil ist die Möglichkeit, den Antikörper in einem Puffer wieder aufzulösen, der den nachfolgenden Betrieb der Einheit erleichtert. So erfordern Zellkulturmedien in der Regel eine umfangreiche Titration und Verdünnung oder einen UF-DF-Schritt, um sie für die Fängerchromatographie mit einem Kationenaustauscher vorzubereiten. Hier kann der ausgefällte Antikörper in hoher Konzentration in Äquilibrierungspuffer gelöst werden, was die Verarbeitungszeit verkürzt. Dies kann für Produkte wichtig sein, die eine lange Exposition gegenüber niedrigen pH-/Leitfähigkeitsbedingungen nicht vertragen. Im Fall dieses speziellen Antikörpers erfordert das geklärte Medium eine mehr als zweifache Verdünnung, um auf eine CEX-Säule geladen zu werden, wohingegen das wieder aufgelöste MAb direkt mit der fast zweifachen Konzentration des unangepassten Mediums geladen werden könnte. Dies ist eine mindestens vierfache Verringerung des Ladevolumens, was bei modernen CEX-Harzen mit hoher Kapazität zu einer erheblichen Zeitersparnis führen kann.

Danksagungen

Die Autoren danken den Percivia Protein- und Analysewissenschaften für die Unterstützung bei dieser Arbeit und der Percivia Upstream Process Development Group für die Bereitstellung der Zellkulturmedien.

Hinweis zum Warenzeichen

PER.C6 ist ein eingetragenes Warenzeichen von Crucell Holland BV Corporation; XD ist ein eingetragenes Warenzeichen von DSM NV; und ECS ist ein eingetragenes Warenzeichen von DSM NV. Alle anderen Markennamen sind Marken der jeweiligen Eigentümer.

MICHAEL KUCZEWSKI ist Wissenschaftler I, EMILY SCHIRMER, PhD, ist Wissenschaftlerin II, BLANCA LAIN, PhD, ist leitende Wissenschaftlerin, und GREGORY ZARBIS-PAPASTOITSIS, PhD, ist leitender Direktor, alle in der nachgeschalteten Prozessentwicklung, Percivia LLC, Cambridge, MA, 617. 301.8821, [email protected]@percivia.com

1. Cohn EJ, Strong LE, Hughes WL, Mulford DJ, Ashworth JN, Melin M, et al. Preparation and properties of serum and plasma proteins. IV. A system for the separation into fractions of the protein and lipoprotein components of biological tissues and fluids. J Amer Chem Soc. 1946;68(3):459-75.

2. Van der Wielen L, Hofland G, Ottens M, Gulobovic M, Witkam G-J. Herstellung von Strukturen auf Proteinbasis unter Verwendung einer flüchtigen Säure. In: 224th National Meeting of the American Chemical Society. Boston, MA; 2002.

3. Habeeb A, Francis R. Preparation of human immunoglobulin by ammonium sulfate precipitation. Vox Sanguinis. 1976;31:423-34.

4. Wang J, Diehl T, Aguiar D, Dai X-P, Arunakumari A. Precipitation of process-derived impurities in non-Protein A purification schemes for antibodies. BioPharm Int. 2009 Oct suppl, Downstream Processing 2010: Embracing Innovation;4-10.

5. McDonald P, Victa C, Carter-Franklin JN, Fahrner R. Selective antibody precipitation using polyelectrolytes: Ein neuer Ansatz für die Reinigung monoklonaler Antikörper. Biotechnol Bioeng. 2009;102(4):1141-51.

6. Moya W, Jaber J, Moya W, inventors; Millipore Corp., assignee. Purification of Proteins. United States patent US WO/2008/079280. 2006.

7. Polson A, Erfinder; South African Inventions Development Corporation, Rechtsnachfolger. Fraktionierung von Gemischen proteinhaltiger Substanzen unter Verwendung von Polyethylenglykol. United States patent US 3415804. 1968.

8. Giese G. Polyethylenglykol-Fällung von monoklonalen Antikörpern und die Auswirkungen auf die Säulenchromatographie. In: BioProcess Int. Raleigh, NC; 2009.

9. Thrash S, Otto J, Deits T. Effect of divalent ions on protein precipitation with polyethylene glycol: mechanism of action and applications. Proteinexpression und -aufreinigung. 1991;2(1):83-9.

10. Ramanan S, Stenson R, Ramanan S, Erfinder; Amgen, Rechtsnachfolger. Verfahren zur Isolierung von Antikörpern durch Ausfällung. United States patent US 2008/0214795 A1. 2008 2/13/08.

11. Venkiteshwaran A, Heider P, Teysseyre L, Belfort G. Selective precipitation-assisted recovery of immunoglobulins from bovine serum using controlled-fouling crossflow membrane microfiltration. Biotechnol Bioeng. 2008;101(5):957-66.

12. Fallaux FJ, Hoeben RC, Eb AJvd, Bout A, Valerio D, Fallaux FJ, Hoeben RC, inventors; IntroGene B.V, assignee. Verpackungssysteme für humane rekombinante Adenoviren zur Verwendung in der Gentherapie. Patent der Vereinigten Staaten US 5994128. 1997.

13. Golden K, Bragg C, Chon J. The XD process: development of a high titer process for PER.C6 cells. In: 21st Meeting of the European Society of Animal Cell Technology. Dublin, Ireland; 2009.

14. Chon J. Advances in platform fed-catch and XD production processes using the PER.C6 human cell line. Wilbio Waterside Conference; 2009 Apr 20-22; South San Francisco, CA.

15. Schirmer EB, Kuczewski M, Golden K, Lain B, Bragg C, Chon J, et al. Primary clarification of extreme-density cell culture harvests by enhanced cell settling. Bioprocess Int. 2010;8(1):32-9.

16. Lain B, Cacciuttolo MA, Zarbis-Papastoitsis G. Development of a High-Capacity MAb Capture Step Based on Cation-Exchange Chromatography. Bioprocess Int. 2009;7(5):26-34.

17. Yigzaw Y, Piper R, Tran M, Shukla AA. Ausnutzung der adsorptiven Eigenschaften von Tiefenfiltern zur Entfernung von Wirtszellproteinen bei der Reinigung monoklonaler Antikörper. Biotechnol Prog. 2006;22:288-96.

18. Milby KH, Ho SV, Henis JMS. Ion-exchange chromatography of proteins: the effect of neutral polymers in the mobile phase. J Chromatogr. 1989;482:133-44.

19. Gagnon P, Godfrey B, Ladd D. Method for obtaining unique selectivities in ion-exchange chromatography by addition of organic polymers to the mobile phase. J Chromatogr A. 1996;743:51-5.

20. Paithankar KR, Prasad KS. Precipitation of DNA by polyethylene glycol and ethanol. Nucleic Acids Research.1991;19(6):1346.