PLOS ONE

Diskussion

Die meisten Chemotherapeutika sind speziell darauf ausgelegt, die DNA-Synthese, den Zellstoffwechsel und die Zellteilung zu stören. Aufgrund dieser Wirkungsweise ist zu erwarten, dass diese Medikamente verschiedene Arten von Mutationen verursachen. Die Mutagenität von Chemotherapeutika für normale Zellen ist eines der schwerwiegendsten Probleme in der Chemotherapie, da die Möglichkeit besteht, dass sie sekundäre Malignome und abnormale Fortpflanzungsergebnisse wie Down-, Klinefelter- und Turner-Syndrome hervorrufen. Daher ist es unbedingt erforderlich, die mutagene Wirkung von Chemotherapeutika auf normale Zellen zu bestimmen. Der Mikronukleustest ist ein weit verbreitetes Verfahren zur Messung nicht reparierter Genomschäden, und eine erhöhte MN-Häufigkeit sagt das Krebsrisiko beim Menschen voraus. Da MN durch Chromosomenbrüche (Klastogenität) oder zurückgebliebene Chromosomen (Aneugenität) entstehen können, kann der Nachweis von MN als Screening für die Induktion numerischer Chromosomenaberrationen verwendet werden, wenn Assays, die die Identifizierung ganzer Chromosomen innerhalb von MN ermöglichen, wie z. B. der FISH-Assay, einbezogen werden.

Die klastogene Aktivität von Epirubicin während der Mitose in vivo wurde durch den MN-Test im Knochenmark nachgewiesen. Derzeit ist der Ursprung der Epirubicin-induzierten MN noch nicht geklärt. Daher wurde in der vorliegenden Studie die Fähigkeit von Epirubicin untersucht, Aneuploidie in somatischen und Keimzellen von männlichen Mäusen zu induzieren. Um die Effizienz der Methode zu bestimmen, wurden zwei Modellmutagene, Colchicin und Mitomycin C, die bekanntermaßen aneugenische bzw. klastogene Wirkungen haben, als Positivkontrollen verwendet. Die beobachteten Ergebnisse der MNPCE und die Verteilung der Signale pro MN in der Kontrolle und den beiden positiven Mutagenen in der aktuellen Studie stimmen gut mit den veröffentlichten Daten überein. Die Ergebnisse des MN-Tests haben gezeigt, dass Epirubicin eine dosisabhängige Zunahme der MN-Bildung im Knochenmark von Mäusen in vivo (Abb. 1) und eine Zunahme der zentromerisch-negativen und zentromerisch-positiv gefärbten MN verursacht, was auf die Induktion von Klastogenität und Aneugenität hinweist (Abb. 2). Sowohl das klastogene als auch das aneugene Potenzial von Epirubicin in somatischen Zellen kann zur Entwicklung von Sekundärtumoren führen. Die Ergebnisse der Klastogenität bestätigen die Befunde früherer In-vivo-Studien, in denen nach Epirubicin-Behandlung eine Zunahme der MN-Bildung und strukturelle Chromosomenaberrationen in somatischen Zellen der Maus in einem ähnlichen Dosisbereich beobachtet wurden. Die Ergebnisse dieser Studien stimmen auch mit der zuvor berichteten Mikronukleus-Induktion durch Epirubicin in murinen Krebszellen in vitro , in den Erythrozyten bebrüteter Hühnereier und in der menschlichen lymphoblastoiden TK6-Zelllinie überein. Darüber hinaus wurde bei Krebspatienten, die eine epirubicinhaltige Chemotherapie erhielten, über die Induktion von strukturellen und numerischen Chromosomenaberrationen berichtet. Frühere Studien haben auch gezeigt, dass Epirubicin strukturelle Chromosomenaberrationen in kultivierten HeLa-Zellen , sowohl strukturelle als auch numerische Chromosomenaberrationen und Schwesterchromatidaustausche in einer Zelllinie des chinesischen Hamsters sowie Chromosomenaberrationen in Kulturen peripherer Blutlymphozyten von Frauen mit Brustkrebs, die mit einer epirubicinhaltigen Chemotherapie in vitro behandelt wurden, induziert.

Studien am Menschen haben gezeigt, dass bestimmte Chemotherapieschemata die Häufigkeit von Aneuploidie in Keimzellen erhöhen, was darauf hindeutet, dass bei solchen Patienten ein höheres Risiko für abnorme Fortpflanzungsergebnisse, insbesondere im reproduktiven Alter, bestehen kann. Daher ist es von allgemeinem Interesse, das Risiko der Aneuploidieproduktion zu verringern, Keimzellenaneugen zu erkennen und die ursächlichen Mechanismen zu verstehen. In der vorliegenden Studie wurde die Aneuploidie in Keimzellen durch den Spermien-FISH-Assay mit DNA-Sonden bestimmt, die spezifisch für die Chromosomen 8, X und Y der Maus sind und jeweils mit einer anderen Farbe markiert sind. Um die Zuverlässigkeit der Methoden zu bestimmen, wurde Colchicin, das bekanntermaßen überwiegend aneugenisch wirkt, als positive Kontrollsubstanz verwendet, und die Ergebnisse der Positiv- und Negativkontrolle lagen im gleichen Bereich wie in früheren Studien , -. Diese Daten bestätigten die Empfindlichkeit des Versuchsprotokolls beim Nachweis aneuploidogener Wirkungen der getesteten Verbindungen.

Epirubicin ist am aktivsten in den S- und G2-Phasen des Zellzyklus; es hat jedoch eine gewisse nachweisbare Aktivität in allen Phasen des Zellzyklus. Es wurde häufig berichtet, dass Chemikalien mit aneugenischen Eigenschaften den Verlauf der Zellteilung sowohl in meiotischen als auch in mitotischen Zellen verändern können. In der vorliegenden Studie wurde die Zeit der Entwicklung von meiotischen Teilungen in Spermatozyten zu epididymalen Spermien mit Hilfe des BrdU-Inkorporationstests bewertet. Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass Epirubicin die Dauer der meiotischen Teilungen in Mausspermatozyten um 48 Stunden verlängert (Abb. 3). Diese Beobachtungen bestätigen somit frühere Erkenntnisse, dass die durch Epirubicin ausgelöste Hemmung der Topoisomerase-II-Funktion in verschiedenen Phasen des Zellzyklus die Zellzyklusprogression verlangsamt und die Zellen in der G2/M-Phase arretiert. Ein solcher G2/M-Stillstand könnte auf die Induktion der G2-Checkpoint-Maschinerie zurückzuführen sein, die es ermöglicht, geschädigte DNA zu reparieren, bevor die Zellen in das nächste Zellzyklusstadium übergehen.

Die In-vivo-Informationen über die Auswirkungen von Epirubicin auf die Nicht-Disjunktion während der Meiose sind begrenzt, aber bestimmte andere Anthracycline, wie Doxorubicin und sein Derivat Idarubicin, verhindern die chromosomale Segregation und führen zu einem signifikanten Anstieg der Häufigkeit von disomischen und diploiden Spermien. Darüber hinaus zeigte eine In-vitro-Studie, dass die Behandlung von Kulturen des chinesischen Hamsters mit Epirubicin numerische Aberrationen in Form von Hypodiploidie und Hyperdiploidie hervorruft. Darüber hinaus zeigten durchflusszytometrische und histologische Analysen der Spermatogenese bei Mäusen einen Anstieg des Variationskoeffizienten im DNA-Histogramm als Maß für die Aneuploidie und eine Zunahme der diploiden Spermatiden nach der Behandlung mit Epirubicin. In Übereinstimmung mit den oben zitierten Berichten zeigte das vorliegende Experiment, dass die Exposition mit Epirubicin einen signifikanten dosisabhängigen Anstieg der Häufigkeit von disomischen und diploiden Spermien verursachte und dass die Induktion von Aneuploidie linear dosisabhängig zwischen 0 und 12 mg/kg Epirubicin war (Abb. 4). Diese In-vivo-Beobachtungen stehen auch im Einklang mit einem früheren In-vitro-Bericht über menschliche Lymphozyten, die von gesunden Personen und Krebspatienten kultiviert wurden und bei denen die Doxorubicin-Exposition eine Zunahme der Trisomien der Chromosomen 7 und 17 verursachte. Darüber hinaus berichteten Ganapathi et al., dass menschliche HL-60-Leukämiezellen, die als einzige karyotypische Veränderung die Monosomie 8 tragen, nach Doxorubicin-Exposition 7q21-Marker erwerben. Darüber hinaus zeigten zytogenetische Befunde Trisomie 8 bei Patienten, die eine systemische Chemotherapie mit Anthracyclin erhielten. Monosomie 7, 7q- und unausgewogene Translokation einschließlich Chromosom 7 wurden bei Patienten beobachtet, die eine anthrazyklinhaltige Chemotherapie erhielten. Darüber hinaus wurden strukturelle Chromosomenaberrationen der Chromosomen 1, 9 und 16 mit anthrazyklinhaltigen Chemotherapeutika in Verbindung gebracht.

Als eine der anderen Klassen von Topoisomerase-II-Inhibitoren wurde Etoposid bereits in Mäusespermatozyten untersucht. Die Ergebnisse dieser Studien deuten darauf hin, dass Etoposid als genotoxisches Mittel wirkt und nach Behandlung von pachytenen Zellen Aneuploidien in primär meiotischen Keimzellen induziert. Andererseits stellten Kallio und Lähdetie fest, dass die Empfindlichkeit gegenüber Etoposid bei Mäusen während der Diploten-Diakinese der primären Spermatozyten am größten, während der späten Pachytenphase am geringsten und während der Präleptotenphase am wenigsten ausgeprägt war; ein ganz anderes Muster als bei DNA-alkylierenden Chemikalien. Diese Autoren vermuteten, dass Etoposid die Auflösung rekombinierter Chromosomenarme verhindert, was wahrscheinlich mit einem Stillstand des Zellzyklus und der Auslösung des apoptotischen Weges verbunden ist. In ihren detaillierten zytogenetischen Studien berichteten Marchetti et al., dass das Pachyten das empfindlichste Stadium der Spermatogenese für die Induktion von strukturellen Chromosomenaberrationen und Aneuploidie ist. Da die Daten von Schmid et al. und die von Kallio und Lähdetie zeigen konnten, dass Etoposid den meiotischen Zellzyklus verlängerte, scheint es möglich, dass die von Marchetti et al. in der 24,5-Tage-Begattungsgruppe beobachteten Auswirkungen auf die ersten Spaltungsabteilungen tatsächlich in einem späteren Stadium, d. h.

In der aktuellen Studie planten wir eine Spermien-FISH-Studie, um festzustellen, ob eine subakute Behandlung mit niedrigen Dosen des Topoisomerase-II-Inhibitors Epirubicin eine Wirkung haben würde, da frühere Prophasestadien in die Epirubicin-Behandlung einbezogen würden. Einzelne Dosen von 0,25, 0,5 und 1 mg/kg Epirubicin wurden an 12 aufeinanderfolgenden Tagen injiziert, und 23 Tage nach der letzten Epirubicin-Behandlung wurden Spermienproben entnommen. Eine Gesamtdosis von 12 mg/kg Epirubicin, die während der gesamten Prophase der Meiose verabreicht wurde, erhöhte die Häufigkeit disomischer und diploider Spermien signifikant, während eine Gesamtdosis von 3 und 6 mg/kg Doxorubicin negativ war (Abb. 5). Im Gegensatz dazu führte eine Einzeldosis von 6 mg/kg Epirubicin, die während MMI/MMII auf Spermatozyten appliziert wurde, zu einem positiven Ergebnis (Abb. 4). Diese Daten deuten darauf hin, dass frühere Prophasestadien relativ wenig zur Epirubicin-induzierten Aneuploidie in männlichen Keimzellen beitragen.

In der vorliegenden Studie wurde festgestellt, dass Epirubicin eine deutliche Zunahme autodiploider Spermien (XX88 und YY88) verursachte. Nach der Behandlung mit Epirubicin waren autodiploide Spermien, die aus dem Stillstand der MMII resultierten, häufiger als diploide Spermien, die aus dem Stillstand während der MMI (XY88) resultierten. Die zweite meiotische Teilung reagierte also empfindlicher auf die Epirubicinbehandlung als die erste meiotische Teilung. Die Schlussfolgerung, dass die zweite meiotische Teilung empfindlicher auf die Epirubicin-Behandlung reagierte als die erste meiotische Teilung, wird auch durch die beobachtete Häufigkeit von disomischen Geschlechtschromosomen gestützt. Spermien mit Signalen von XX8 oder YY8 waren häufiger als Spermien mit Signalen von XY8. Diese Beobachtungen bestätigen, dass der Sperma-FISH-Assay für Disomie oder Diploidie in der Lage ist, Effekte zu erkennen, die während beider meiotischer Teilungen induziert werden, und die Empfindlichkeit beider meiotischer Teilungen zu vergleichen, wie zuvor berichtet wurde.

Im vorliegenden Sperma-FISH-Assay wurde festgestellt, dass die niedrigste positive Dosis, die disomische oder diploide Spermien verursacht, 6 mg/kg Epirubicin war. MN-Studien am Knochenmark von Mäusen zeigten jedoch, dass eine Exposition mit 3 mg/kg Epirubicin zu einem signifikanten Anstieg der MNPCE führte. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass MN im Knochenmark bei niedrigeren Dosen induziert werden als Disomien oder Diploidien in Spermien. Daher ist das Knochenmark das empfindlichere Gewebe. Die Assays messen jedoch unterschiedliche Endpunkte. Der MN-Test misst den Chromosomenverlust und -bruch, während der Spermien-FISH-Assay die Nicht-Diploidie nachweist. Daher bestätigen die vorliegenden Daten das allgemeine Paradigma der Gefahrenbewertung, wonach ein positives Ergebnis des MN-Tests im Knochenmark ein Indikator für das genotoxische Potenzial einer Verbindung in Keimzellen ist. Die Quantifizierung der Aneuploidie in Keimzellen ist jedoch für die Risikobewertung wichtig.

DNA-Topoisomerase-Inhibitoren haben eine eindeutige Tendenz, doppelsträngige DNA-Brüche zu verursachen, die in erster Linie zur Bildung von Zentromer-negativen MN führen. Auch der Nachweis, dass Epirubicin ein wirksamer Topoisomerase-II-Inhibitor ist, legt nahe, dass Epirubicin seine klastogenen Wirkungen über diesen Mechanismus entfaltet. Epirubicin-Metaboliten können die Zellen auch dazu anregen, die intrazelluläre Produktion reaktiver Sauerstoffspezies zu erhöhen, von denen die stabilen und diffusionsfähigen Formen die Kern-DNA schädigen können. Wenn die zellulären Reparaturmechanismen überlastet sind, können primäre DNA-Schäden zu strukturellen oder numerischen Chromosomenaberrationen führen und schließlich Tumore verursachen. Diese Vermutung wird durch die Tatsache gestützt, dass Personen, die nach der Behandlung einer ersten bösartigen Neubildung eine zweite bösartige Neubildung entwickelten, eine geringere Fähigkeit zur Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen aufwiesen als Personen, die keine zweite bösartige Neubildung entwickelten, gemessen an der γH2AX-Intensität . Die Induktion von zentromerpositiven MN durch Epirubicin deutet darauf hin, dass es möglicherweise einen weiteren Mechanismus gibt, durch den Epirubicin seine genotoxische Wirkung entfaltet. Diese Beobachtung unterstreicht, wie wichtig es ist, die FISH-Modifikation des MN-Tests zu verwenden, um den Ursprung der induzierten MN zu bestimmen. Der potenzielle Mechanismus, durch den Epirubicin seine aneugenische Wirkung entfaltet, ist die Hemmung der Topoisomerase II, die zu einer Fehlsortierung der Chromosomen während der Zellteilung führen kann. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die DNA-Topoisomerase II für die ordnungsgemäße Trennung der Schwesterchromatiden während der Zellteilung erforderlich ist, wobei in ihrer Abwesenheit sowohl Nicht-Disjunktionen als auch Brüche auftreten. Somit könnte Epirubicin in der Lage sein, zwei Schlüsselrollen der Topoisomerase II zu hemmen: ihre Fähigkeit, neu replizierte Chromosomen ordnungsgemäß zu segregieren, sowie ihre Funktion bei der Re-Ligatur vorübergehender doppelsträngiger DNA-Brüche.

Zusammenfassend wurde durch die Verwendung des FISH-Tests mit einer zentromerischen DNA-Sonde für Erythrozyten-MN gezeigt, dass Epirubicin nicht nur klastogen, sondern auch aneugenisch in somatischen Zellen in vivo ist. Mit Hilfe des BrdU-Inkorporationsassays wurde gezeigt, dass die durch Epirubicin verursachte meiotische Verzögerung etwa 48 Stunden beträgt. Mit der Spermien-FISH-Analyse wurde gezeigt, dass Epirubicin während der Meiose Aneuploidien induziert, die zu disomischen Spermien führen, sowie einen vollständigen meiotischen Arrest, der diploide Spermien erzeugt. Die Prävalenz autodiploider (XX88, YY88) und disomischer (XX8 oder YY8) Spermien deutet darauf hin, dass die zweite meiotische Teilung empfindlicher auf Epirubicin reagiert als die erste meiotische Teilung. Die Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass frühere Prophasestadien relativ wenig zur Epirubicin-induzierten Aneuploidie beitragen. Sowohl das klastogene als auch das aneugenische Potenzial von Epirubicin kann bei Krebspatienten und medizinischem Personal, das Epirubicin enthaltenden Arzneimitteln ausgesetzt ist, zur Entwicklung von Sekundärtumoren und abnormen Fortpflanzungsergebnissen führen. Obwohl Epirubicin eine geringere systemische und kardiale Toxizität aufweist als Doxorubicin und andere Anthrazykline mit einem gleichwertigen Spektrum an Antitumorwirkung, hat es aneuploidogene und zytotoxische Wirkungen in Nicht-Tumorzellen. Diese aneuploidisierende Wirkung des Medikaments kann für das Auftreten abnormaler Reproduktionsergebnisse und sekundärer Tumoren verantwortlich sein, die bei einigen Krebspatienten einige Zeit nach der erfolgreichen Behandlung ihrer primären Krebserkrankungen mit einer Epirubicin-haltigen Chemotherapie beobachtet werden.