Proximity-Labeling MS (APEX-MS)

Für diesen Ansatz wird das Protein von Interesse an eine Peroxidase (Ascorbinsäure-Peroxidase; APEX) fusioniert. Bei der Behandlung mit H2O2 wandelt APEX exogen zugeführtes Biotin-Phenol in Biotin-Phenoxyl-Radikale um, was zu einer kovalenten Markierung des Proteins in einem Radius von 20nm führt. Anschließend werden die biotinylierten Proteine mit Steptavidin angereichert. Mit dieser Technologie können zum ersten Mal „Schnappschüsse“ der lokalen Proteinumgebungen zu einem bestimmten Zeitpunkt gemacht und vorübergehende Proteininteraktionen erfasst werden. Näherungsbasierte Markierungsansätze haben sich in den letzten Jahren rasch weiterentwickelt und liefern nachweislich ergänzende Ergebnisse zu herkömmlichen affinitätsbasierten Reinigungsmethoden (AP-MS), so dass sie das Potenzial haben, völlig neue Forschungswege zu eröffnen und neue Einblicke in Proteinfunktionen zu ermöglichen.

APEX wurde verwendet, um ganze Organellenproteome mit hoher zeitlicher Auflösung zu erfassen, aber es wird allgemein angenommen, dass die Breite der Markierung eine höhere räumliche Auflösung verhindert, die für die Untersuchung spezifischer Proteinnetzwerke erforderlich ist. Wir haben kürzlich eine Lösung für dieses Problem gefunden, indem wir die quantitative Proteomik mit einem System räumlicher Referenzen kombiniert haben. Mit dieser neuartigen Methode können wir sowohl bekannte Bindungspartner als auch bisher nicht identifizierte Netzwerkkomponenten auflösen, wie kürzlich in einer Proof-of-Principle-Studie gezeigt wurde, in der Proteine untersucht wurden, die von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren bei ihrer dynamischen Signalgebung und ihrem Verkehr als Reaktion auf eine Liganden-induzierte Aktivierung beteiligt sind.