Spezifische Antikörper benötigen eine spezifische Validierung

Eines der am häufigsten verwendeten Instrumente in der biomedizinischen Forschung ist der monoklonale Antikörper. Diese Proteine haben das Potenzial, jedes beliebige Ziel ausfindig zu machen und daran zu binden, und können für die Zellbildgebung, die Zellsortierung, Immunoassays und viele andere Anwendungen eingesetzt werden.

Aber diese Arbeitspferde des Labors funktionieren nicht immer richtig. Je nach Art seines Ziels kann ein Antikörper bei bestimmten Tests inkonsistent sein – er bindet zum Beispiel an das falsche Ziel und führt zu falsch positiven Ergebnissen. Angesichts der weiten Verbreitung von Forschungsantikörpern ist dies ein potenzielles Milliardenproblem.

Ein wichtiges Ziel ist die Entwicklung von Strategien zur Validierung von Antikörpern, damit Forscher darauf vertrauen können, dass ein Antikörper für ihre speziellen Bedürfnisse geeignet ist – und dass ihre Ergebnisse reproduzierbar sind.

Thermo Fisher Scientific hat eine zweiteilige Plattform zur Validierung von Antikörpern entwickelt, mit der nicht nur die Spezifität seiner InvitrogenTM-Antikörper (d. h. dass sie an das richtige Ziel binden), sondern auch ihre Eignung für verschiedene Anwendungen getestet werden kann. Der gleiche Test ist jedoch nicht für alle Antikörper geeignet: Thermo Fisher verwendet für jedes Proteintarget einen geeigneten Test, der von dessen biologischer Funktion abhängt. Bestimmte Antikörper lassen sich am besten mit CRISPR-Cas9 testen, um das Gen, das für das Zielprotein kodiert, auszuschalten und zu prüfen, ob der Antikörper nicht mehr an irgendetwas bindet. Andere Antikörper können mittels Immunpräzipitation und anschließender Massenspektrometrie getestet werden, um zu prüfen, ob sie an die richtigen Zielproteine gebunden sind.

Thermo Fisher entwickelt und verfeinert Tests zur Antikörpervalidierung auf der Grundlage der biologischen Funktion des Zielantigens. Hier sind zwei Fallstudien spezifischer Proteine und ihrer Spezifitätstests.

Knock-outs für Krebs

Der epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) ist ein gut untersuchtes Protein: Dysregulationen im EGFR-Signalweg werden mit verschiedenen Krebsarten in Verbindung gebracht. Um zu testen, ob Antikörper spezifisch für den EGFR oder eines seiner nachgeschalteten Ziele sind, können Forscher kritische Proteine im EGFR-Signalweg ausschalten und sehen, wie sich das Antikörper-Bindungssignal verändert.

In den letzten Jahren ist das CRISPR-Cas9-System als die zuverlässigste und leistungsfähigste Methode zum Ausschalten eines Gens bekannt geworden. Dies macht es ideal für die Prüfung der Antikörperspezifität innerhalb einer Signalkaskade. Die Thermo Fisher-Forscher nahmen eine menschliche Standard-Karzinomlinie (A-431) und verwendeten einen Western Blot, um eine Basislinie für das Bindungssignal zu erhalten. Dann verwendeten sie CRISPR-Cas9, um das Zielgen zu eliminieren und EGFR-Knockouts zu erzeugen. Ein Western Blot des aus diesen Knockout-Zellen extrahierten Proteins zeigte, dass es kein Signal mehr für ein Zielprotein gab (Abbildung 1).

Weitere Tests bestätigten das Ergebnis. Die dem EGFR nachgeschaltete Signalkaskade umfasst Proteine wie RAS, RAF, MEK und ERK. Die Aktivierung des EGFR durch den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) führt zu einer Phosphorylierung dieser nachgeschalteten Proteine, die mit anderen Antikörpern, die diese phosphorylierten Zustände erkennen, nachgewiesen werden können. Die Zugabe von EGF zu den EGFR-Knockout-Zellen sollte jedoch keine nachgeschaltete Phosphorylierung zur Folge haben. Die Zugabe derselben Antikörper, die phosphorylierte Ziele erkennen, führte zu keinen Signalen. Daher sind die Thermo Fisher-Forscher zuversichtlich, dass der Anti-EGFR-Antikörper zielspezifisch ist.

Eine Reihe von Modifikationen

Im Zellkern ist die DNA fest verpackt – um Histonproteine gewickelt, um Chromatin zu bilden. Die Untersuchung von Histonen ist schwierig, da sie durch eine Reihe von chemischen Veränderungen, den so genannten posttranslationalen Modifikationen (PTM), beeinflusst werden können. Beispielsweise können Histonreste eine oder mehrere Methyl-, Acetyl- oder Phosphorylgruppen erhalten, die sich jeweils auf die Zellfunktion auswirken.

Bestimmte Techniken wie Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP), Western Blotting, Immunfluoreszenz und Immunhistochemie verwenden Antikörper gegen spezifische Histon-PTMs, um den Zustand des Histons und seine Bindung zu verstehen. Mehrere Histon-Modifikationen haben jedoch ähnliche DNA-Bindungsmuster; ein Antikörper, der nicht rigoros gegen alle Histon-PTMs getestet wurde, könnte an den falschen Typ binden und ein falsch-positives Ergebnis liefern.

Thermo Fisher testete seine Histon-PTM-spezifischen Antikörper mit einer Reihe von Peptiden, die eine Vielzahl von PTMs tragen. Wenn ein Antikörper wirklich spezifisch für ein PTM ist, bindet er nur an die Stellen, die dieses PTM tragen. Die Forscher von Thermo Fisher maßen die Signale anhand eines Spezifitätsfaktors: die durchschnittliche Intensität aller Spots, die ein bestimmtes PTM enthalten, geteilt durch die durchschnittliche Intensität aller Spots ohne dieses PTM (Abbildung 2). Die Antikörper zeigten einen 4- bis 190-fach höheren Spezifitätsfaktor für ihren Ziel-PTM-Zustand als für Nicht-Ziel-Zustände, was darauf schließen lässt, dass sie hoch selektiv sind.

Thermo Fisher verfügt über sieben weitere Spezifitätstests, die über genetisches Knock-out und Peptidarrays hinausgehen. Dazu gehören die Verwendung von RNAi, um die Genexpression zu unterdrücken, die Verwendung eines differenziell gezüchteten Antikörpers, um das Targeting unabhängig zu überprüfen, und die Verwendung einer natürlich vorkommenden variablen Expression, um die Spezifität zu bestätigen. Nur durch solch sorgfältige und strenge Tests können Forscher sicher sein, dass ihre Arbeitspferde im Labor für ihren Zweck geeignet sind – und dass ihre Arbeit auch der genauesten Prüfung standhält.

Finden Sie hier Anwendungshinweise zu diesen Invitrogen-Antikörpern und mehr über den zweiteiligen Testansatz von Thermo Fisher Scientific.