Understanding the structural basis of HIV-1 restriction by the full length double-domain APOBEC3G

Gesamtstrukturmerkmale des fl rA3G

Eine große Hürde bei Strukturuntersuchungen von fl double-domain APOBEC-Proteinen war die schlechte Löslichkeit – Wildtypen werden oft entweder als inhomogene Oligomere oder große Aggregate in höherer Konzentration gereinigt. Um gut funktionierendes fl A3G für die Strukturbestimmung zu erhalten, haben wir A3G-Homologe aus verschiedenen Primatenarten untersucht und festgestellt, dass A3G vom Rhesusaffen (rA3G) eine bessere Löslichkeit aufweist. Zwei fl rA3G-Mutationskonstrukte (bezeichnet als FKL und E/Q) ergaben unter verschiedenen Bedingungen gut brauchbare Proteine und Kristalle (ergänzende Tabelle 1), die auf 2,47 bzw. 2,40 Å beugten (ergänzende Tabellen 1 und 2, ergänzende Abb. 1). Zusätzliche Änderungen in diesen beiden Konstrukten verbesserten die Löslichkeit und Ausbeute von rA3G, einschließlich des Ersatzes einer 8-Residue-CD1-Schleife 8 durch die 4-Residue-Schleife 8 von hA3G-CD2 (wie in den E/Q- und FLK-Konstrukten, ergänzende Tabelle 1, ergänzende Abb. 1). 1), weitere Mutationen F126Y auf CD1-Schleife 7, K180S/L184S auf CD1 h6 und 8-Residue-Deletion der CD2-Schleife 3 (wie im FKL-Konstrukt, ergänzende Tabelle 1, ergänzende Abb. 1B). Es sei darauf hingewiesen, dass K128 von rA3G, das als Barriere für die artenübergreifende Übertragung fungiert, zu einem Asparaginsäurerest (D128) mutiert ist, wie bei menschlichem A3G (hA3G)36. Die Konstrukte enthalten auch die katalytische Mutation E259 zu Q/A, um eine mögliche Toxizität bei der rekombinanten Proteinexpression zu vermeiden. Die mutierten Reste und ihre Position in der Struktur sind in der ergänzenden Abb. 1B dargestellt. In beiden Strukturen sind CD1 und CD2 zu eigenständigen Domänen gefaltet, die durch einen kurzen Linker mit 5 Resten (Reste R194 bis D198) verbunden sind (Abb. 1a, b). Trotz der allgemeinen strukturellen Ähnlichkeit (Abb. 1a, b) weisen die beiden Strukturen deutliche Unterschiede in den CD2-Konformationen und der Packungsorientierung zwischen CD1 und CD2 auf (Abb. 1c, ergänzende Abb. 2A).

Beide rA3G FKL- und E/Q-Strukturen haben die gleiche kanonische CD1-Struktur und überlagern sich gut (ergänzende Abb. 2B, rmsd von 0,445 Å). Die viel größeren Konformationsunterschiede in jeder CD2-Domäne führen zu einem rmsd von 0,862 Å. Wenn die FKL- und E/Q-Strukturen über ihre CD1-Domäne ausgerichtet werden, zeigt die CD2-Domäne der E/Q-Struktur eine Drehung von ~29° im Vergleich zur CD2-Domäne der FKL-Struktur, wodurch sich die CD2-Domäne der E/Q-Struktur um ~15 Å nach unten und ~8 Å in Richtung CD1 verschiebt, was zu einer viel engeren Packungsinteraktion mit CD1 führt (ergänzende Abbildung 2 A). Die gesamte CD1-CD2 Packungsschnittstelle hat eine vergrabene Oberfläche von ~623 Å2 für die FKL-Struktur und ~700 Å2 für die E/Q-Struktur. Die engere CD1-CD2-Packung in der E/Q-Struktur führt nur zu einer geringfügig größeren vergrabenen Oberfläche als die FKL-Struktur, wahrscheinlich aufgrund der Rückfaltung und der fehlenden Dichte der die Schnittstelle lokalisierenden Strukturelemente (h2-Schleife3) des CD2.

Zwei Arten von CD1- und CD2-Domäneninteraktionen

Während die FKL-Struktur eine kanonische Faltung der CD2-Domäne zeigt (ergänzende Abb. 2C), weist die E/Q-Struktur eine signifikante Veränderung der CD2-Konformation auf (ergänzende Abb. 2D), mit großen Veränderungen an Helix 2 (h2), Schleife 3, Schleife 4 und dem Zn-aktiven Zentrum. Das lange h2 des CD2 in der FKL-Struktur (ergänzende Abb. 2C) ist in der E/Q-Struktur (ergänzende Abb. 2D) zu einer kurzen 310-Helix (h2′) geworden, was zu einer ungeordneten 14-Reste-Strecke führt, die Teile von Schleife 3 und h2 (Reste A246 bis E259) umfasst (ergänzende Abb. 1A). Die Verschiebung zu einer kurzen 310 h2 und einer verlängerten Random-Coil-Struktur ist notwendig, um ein Zusammenstoßen in dieser engen Packungskonformation zu vermeiden (Abb. 1e). Dadurch wird jedoch auch die Konformation des Zn-aktiven Zentrums von CD2 in den Bereichen von h2 und Schleife 3 gestört, die ungeordnet werden, was zu keiner Zn-Koordination führt (ergänzende Abb. 2D). Das Fehlen der Zn-Koordination wird nur in einer anderen APOBEC-Struktur, der APOBEC3F (A3F) CD2-Struktur, beobachtet46,47. Die Zn-haltigen oder fehlenden A3F-CD2-Strukturen sind jedoch im Wesentlichen identisch und passen auch gut zu mehreren anderen APOBEC-Strukturen (ergänzende Abb. 2E), während die E/Q-CD2-Struktur mit ihren rückgefalteten h2-Schleifen 3 und 4 und der Zn-Zentrumskonformation einzigartig ist (ergänzende Abb. 2E, F).

Während es möglich ist, dass der Verlust von Zn und die Rückfaltung von CD2 in der E/Q-Struktur das Ergebnis der Mutationen in diesem Konstrukt sein könnte, haben wir untersucht, ob die E/Q-Variante eine defekte Katalyseaktivität hat. Die Reversion von E259Q im E/Q-Konstrukt zurück zum WT-katalytischen E259 (E/Q*-Konstrukt) brachte der Variante die volle Aktivität im Deaminationsassay unter Verwendung von HEK293T-Zellexpressionslysaten zurück (ergänzende Abb. 3). Darüber hinaus sind E/Q* mit den einzelnen Mutationen F126Y, K180S/L184S oder CD2Δloop3 (wie in der FKL-Struktur) alle aktiv, obwohl die Aktivität des FKL*-Konstrukts (mit E259A, das zu E259 zurückverwandelt wurde) mit den kombinierten Mutationen geringer ist als die von E/Q* und WT. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die kristallisierte E/Q-Struktur, der Zn in der CD2-Domäne fehlt, zwar einen katalytisch inaktiven A3G-Strukturzustand darstellt, dass aber die Rückverwandlung des katalytischen Rests in E259 die mit WT vergleichbare Deaminaseaktivität vollständig wiederherstellen kann. Kombinierte Mutationen in FKL wirken sich teilweise auf die katalytische Aktivität aus.

Durch den Unterschied von ~29° im relativen Rotationswinkel der Packung zwischen jeder Domäne in den FKL- und E/Q-Strukturen unterscheiden sich die detaillierten molekularen Interaktionen zwischen CD1 und CD2 zwischen den beiden Strukturen. Die Domänen CD1 und CD2 in der FKL-Struktur interagieren hauptsächlich über h3, h4 und Schleife 7 von CD1 und h1, h2, β2 und Schleife 3 von CD2 miteinander (Abb. 1a, d). In der E/Q-Struktur interagieren die beiden Domänen hauptsächlich über h3, h4 und h6 von CD1 mit h2′, β2, Loop 4 und Loop 10 von CD2 (Abb. 1b, e). Infolgedessen unterscheiden sich etwa 40 % der interagierenden Reste zwischen CD1 und CD2 in den beiden Strukturen (siehe eine vollständige Liste der interagierenden Reste in der ergänzenden Abb. 4), und selbst wenn dieselben Reste an dieser Interaktion beteiligt sind, stellen sie aufgrund des veränderten Packungswinkels zwischen den beiden Domänen oft unterschiedliche Bindungskontakte her. Die Fähigkeit, die CD1- und CD2-Domänen mit unterschiedlichen Winkeln und Wechselwirkungen zwischen den Resten zu packen, deutet auf ein gewisses Maß an Plastizität in der Domänenanordnung von fl A3G hin.

Vollständige Länge des rA3G-Dimers und Merkmale des Dimerisierungsbereichs

Das E/Q-Konstrukt wurde unter verschiedenen pH- und Salzbedingungen kristallisiert (ergänzende Tabelle 1), zeigte aber durchgängig die gleiche Struktur und Dimerisierung über CD1-CD1-Wechselwirkungen (Abb. 2a, b). 2a, b), in erster Linie durch direkte Packung mehrerer Reste auf h6 (K180, L184, A187), Schleife 1 (I26) und Schleife 7 (F126, W127) von beiden Untereinheiten (ergänzende Abb. 5A, B). Interessanterweise sind diese Wechselwirkungen identisch mit denen, die zuvor nur für die rA3G-CD1-Domäne berichtet wurden18, trotz der K128D-Mutation, die entscheidend dafür ist, dass rA3G von HIV-1 Vif-unempfindlich zu empfindlich für den Abbau wird. Es ist erwähnenswert, dass eine solche Dimerisierung von fl rA3G nur zu einem geringen Anstieg der größten Abmessung von 85 Å eines Monomers auf 95 Å eines Dimers führt (Abb. 2a, b).

Eine detaillierte Untersuchung der Rückstände, die auf beiden Seiten des dimeren Grenzflächenbereichs ausgerichtet sind, zeigt zwei hervorstechende Merkmale. Erstens sind insgesamt 18 positive/polare und hydrophobe Reste um die rA3G-Dimerverbindung in einer Weise angeordnet, die für die Interaktion mit einzelsträngigen Nukleinsäuren wie RNA geeignet ist (Inset B in Abb. 2). Diese 18 Reste sind in zwei Gruppen organisiert, wobei die erste Gruppe im Uhrzeigersinn vom oberen Monomer (in grün) R24, H181, N177, N176, K180 und weiter zum unteren Monomer (in hellblau) W127, Y125, Y124 und S28 und dann mit der gespiegelten Gruppe dieser gleichen Reste beginnt. Zweitens sind durch die Dimerisierung die R24 und die nahegelegenen positiven Reste K180 und H181 jedes Monomers räumlich eng beieinander angeordnet, wobei der Abstand zwischen den beiden R24-Resten etwa 7 Å beträgt. Durch diese räumliche Anordnung werden die lokalen elektrostatischen Potenziale (EP) von etwa +1,9 kT/e als Monomer auf +8,3 kT/e als Dimer deutlich erhöht (Abb. 2c und Inset C, Abb. 2d und Inset D). Das Vorhandensein gut ausgerichteter Reste, die für die Bindung einzelsträngiger Nukleinsäuren geeignet sind, sowie das verstärkte positive EP (PEP) um die beobachtete Dimerkreuzung deuten stark darauf hin, dass dieser Bereich RNA als Dimer binden kann, und deuten darauf hin, dass eine Unterbrechung dieser A3G-Dimerisierungsschnittstelle die RNA-Bindung beeinflussen kann, indem das verstärkte PEP (Abb. 2c) auf das niedrige PEP in monomerer Form (Abb. 2d).

Dimermutationseffekt auf RNA-Assoziation und Multimerisierung

Unsere frühere Studie zur CD1-Domäne allein deutet darauf hin, dass die Reste FWKL (F126, W127, K180, L184) an der Dimerisierungsschnittstelle sowohl an der Dimerisierung als auch an der RNA-Bindung beteiligt sein könnten, entweder durch direkte Interaktion mit RNA oder indirekt durch die Erzeugung einer RNA-Bindungsoberfläche über die Dimerisierung18. Die Inspektion der fl rA3G-Dimerstruktur zeigt, dass die Reste FWKLA (F126, W127, K180, L184, A187) zwar direkt an Dimerisierungsinteraktionen beteiligt sind (ergänzende Abb. 5A), aber nur W127 für Pi-Stacking oder Wasserstoffbrückenbindungen mit einer Nukleinsäurebase zugänglich ist, was darauf hindeutet, dass W127 die kritische Doppelrolle bei der Dimerisierung oder/und RNA-Bindung spielt, was auch von früheren Mutationsstudien nahegelegt wurde15,18,40,48.

Schleife 7 von rA3G befindet sich in der Nähe der Dimerisierungsschnittstelle und enthält eine Reihe von hydrophoben Resten (Y124, Y125 und F126), die sich mit W127 verbinden und es wahrscheinlich stabilisieren (ergänzende Abb. 5B). Um herauszufinden, ob die Dimerisierung für die RNA-Assoziation erforderlich ist und um die mögliche Doppelrolle von W127 zu berücksichtigen, haben wir eine Reihe von Dimer-Schnittstellen-Mutanten von rA3G entwickelt, bei denen Schleife 7 unverändert blieb (ergänzende Tabelle 3, ergänzende Abb. 5A, B). So wurden nur vergrabene Schnittstellenreste außerhalb von Schleife 7 mutiert, wodurch die Mutanten rM10, rM11 und rM15 entstanden (ergänzende Tabelle 3). Als Kontrolle haben wir auch eine Mutante rM9 mit Veränderungen sowohl in Schleife 7 als auch in h6 von CD1 (F126A-W127A-A187Y) einbezogen, von der erwartet wurde, dass sie zu einem ähnlichen Phänotyp führt wie die zuvor berichtete FWKL-Mutante von CD1 allein18, d. h. zu einer Störung sowohl der Dimerisierung als auch der RNA-Assoziation. Ein nahezu wildtypisches rA3G (WT) mit einer löslichkeitsfördernden Schleifenumschaltung auf CD1-Schleife 8 und die entsprechende katalytisch inaktive Mutante (Konstrukt E/Q) wurden ebenfalls einbezogen (ergänzende Tabelle 3). Die RNA-Assoziation und der Oligomerisierungsstatus dieser Mutanten wurden nach rekombinanter Expression in E. coli untersucht.

Nach der Affinitätssäulenreinigung aus den E.coli-Zelllysaten wurde die RNA-Assoziation des sumo-rA3G-Fusionsproteins mittels denaturierender Harnstoff-PAGE analysiert (Abb. 3a-c). Während die WT- und die E/Q-Mutante (Spuren 7, 8 in Abb. 3b, c) eine ähnliche RNA-Assoziation aufwiesen, waren alle Dimer-Interface-Mutanten (rM10, rM11, rM15 in den Spuren 2, 3 bzw. 5 in Abb. 3b, c) stark reduziert. 3b, c) wiesen vor oder nach der RNase-A-Behandlung eine stark reduzierte RNA-Assoziation auf (Spur 7), wobei rM10 (T183D-L184D-A187Y), rM15 (I26A-K180S-L184S-A187E) und die Kontrollmutante rM9 nach dem gleichen Reinigungsprozess (Spuren 1, 2, 5) kaum nachweisbare RNA zeigten. Die Größenausschlusschromatographie (SEC) zeigte, dass rM10 und rM15 sowie die Kontrollmutante rM9 vor und nach der RNase A-Behandlung überwiegend als Monomer eluierten (Abb. 3d, e; ergänzende Abb. 6A, B), was die Störung der Dimerisierung/Multimerisierung bestätigt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass unter den experimentellen Bedingungen die Mutation von Resten, die in der Schnittstelle vergraben sind, nicht nur die Dimerisierung unterbricht, sondern auch die RNA-Assoziation beeinflusst, selbst wenn Schleife 7 unverändert ist, wahrscheinlich aufgrund des Verlusts des verstärkten PEP als Folge der Dimer-Unterbrechung (Abb. 2c, d).

Da wir aufgrund der schlechten Löslichkeit von menschlichem A3G (hA3G) nicht die gleiche Art von biochemischen Tests zur Bewertung ähnlicher Mutanten durchführen konnten, haben wir eine rA3G-hA3G-Chimärenmutante (h6-Chimäre) erzeugt, bei der das rA3G CD1 h6 durch hA3G CD1 h6 ersetzt wurde (siehe ergänzende Tabelle 3). Diese h6-Chimäre verhielt sich während der Aufreinigung ähnlich wie rA3G WT in Bezug auf die Dimer-/Multimerisierung vor oder nach der RNase-A-Behandlung (ergänzende Abb. 7A, B) sowie die RNA-Assoziation, insbesondere nach der RNase-A-Behandlung (ergänzende Abb. 7C, D). Es ist erwähnenswert, dass, wie in den ergänzenden Abb. 7A, B gezeigt, das H6-Chimärenprotein nach der RNase A-Behandlung ebenfalls zu Dimer- (D) und Monomer- (M) Fraktionen verschoben wurde (SDS-PAGE-Gel in der ergänzenden Abb. 7D). 7D), zeigt sein SEC-Profil heterogenere Peaks als das von rA3G WT, möglicherweise weil das chimäre Protein drei Reste (Y181, I183, I187) von hA3G enthält, die hydrophober sind als die in rA3G (H181, T183, A187) und daher weniger stabil/löslich. Diese Ergebnisse legen die Möglichkeit nahe, dass CD1 h6 zwischen rA3G und hA3G austauschbar ist, was zum Vorhandensein desselben PEP-Bereichs führt, der im Wesentlichen dieselbe Reihe von Oberflächenresten auf beiden Proteinen aufweist.

PEP-Mutationseffekt auf RNA-Assoziation und Multimerisierung

Wir untersuchten dann, ob die um die Dimerkreuzung herum gebildete erhöhte PEP-Oberfläche (Abb. 2. Inset b) für die RNA-Assoziation wichtig ist. Vier positive/polare Reste um R24 herum wurden mutiert, um rM12 zu erzeugen (R24T-S28A-N176A-N177D, ergänzende Tabelle 3). Eine Mutante, die nur R24T enthält, wurde ebenfalls einbezogen. Die RNA-Assoziation von rM12 war im Vergleich zu R24T und WT reduziert (Spuren 4, 6, 7 in Abb. 3b, c), was auf eine Rolle dieser Reste innerhalb des PEP-Bereichs bei der Verstärkung der RNA-Bindung hinweist. Im Vergleich zu rM9 (F126A/W127A/A187Y) wies rM12 jedoch vor und nach der RNase-A-Behandlung immer noch eine beträchtliche Menge an RNA-Assoziation auf (Spuren 1, 4 in Abb. 3b, c), was möglicherweise auf eine teilweise Unterbrechung der RNA-Bindung an den PEP-Bereich, nicht aber an andere Bereiche von rA3G zurückzuführen ist. Unerwarteterweise zeigte die SEC-Analyse, dass rM12 bereits vor der RNase A-Behandlung einen großen monomeren Peak aufwies (Abb. 3d, e, ergänzende Abb. 6A, B), was auf eine Störung der Dimerisierung/Multimerisierung ohne direkte Mutation der Dimerisierungsschnittstelle hindeutet. Dieser negative Effekt der PEP-Mutation auf die RNA-Assoziation und die Dimerisierung/Multimerisierung wurde durch zwei weitere rA3G-Mutanten mit PEP-Mutationen, rM13 und rM14, bestätigt (ergänzende Tabelle 3, ergänzende Abb. 7). Diese beiden Mutanten zeigten unterschiedliche Niveaus der Störung der RNA-Assoziation (Ergänzende Abb. 7A) und der Dimerisierung/Multimerisierung sogar vor der RNase A-Behandlung unter den getesteten Bedingungen (SEC-Profile und Gele in Ergänzende Abb. 7C).

Interessanterweise zeigten die R24T-Einzelmutante und WT zwar ähnliche Mengen an assoziierter RNA, die in den RNA-Gelen in Abb. 3b, c nachgewiesen wurden. 3b, c, zeigte die detaillierte SDS-PAGE-Analyse ihrer SEC-Peakfraktionen vor der RNase A-Behandlung, dass die meisten R24T-Proteine in den Fraktionen um den monomeren Peak (M) herum verteilt waren (ergänzende Abb. 6A), was im Gegensatz zu WT steht, das hauptsächlich in den Fraktionen mit dem leeren Volumen (V) verteilt ist. Diese Ergebnisse deuten auf eine Veränderung der RNA-Assoziation und des Multimerisierungsverhaltens mit einer einzigen R24T-Mutation im PEP-Bereich hin, was mit früheren Studien zu R24A-Mutationen übereinstimmt14,30,38,40. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass unter diesen Versuchsbedingungen die Reste im verstärkten PEP-Bereich der Dimerverbindung (R24/S28/N176/N177) eine wichtige Rolle bei der Vermittlung der RNA-Assoziation spielen, und dass die RNA-Assoziation durch diese Reste umgekehrt für die Stabilisierung der Dimerisierung und die anschließende Multimerisierung höherer Ordnung erforderlich ist.

Auswirkung von PEP/Dimer-Mutationen auf die in vitro RNA/DNA-Bindung

Die fl rA3G-Strukturen zeigen zusätzliche Bereiche mit positiv geladenen Resten außerhalb des verstärkten PEP-Bereichs, wie in Abb. 2c dargestellt. Während diese positiv geladenen Reste außerhalb des PEP-Bereichs bei der Bildung stabiler A3G-RNA-Komplexe, wie sie in E. coli-Zelllysaten beobachtet wurden, möglicherweise keine große Rolle spielen, könnten sie dennoch zur Bindung der definierten ssRNA- und ssDNA-Substrate beitragen. Um dies zu prüfen, wurde jede gereinigte Proteinprobe einer umfangreichen RNase-Behandlung unterzogen, um so viel gebundene RNA wie möglich zu entfernen, und die Bindungsaffinität gegenüber 50 nt ssRNA- oder ssDNA-Oligomeren wurde mit einem Gel-Shift-Assay getestet. Alle Mutanten zeigten eine Bindung an 50 nt ssRNA oder ssDNA, und die geschätzten Dissoziationskonstanten (Kd, ergänzende Tabelle 3) zeigten, dass die meisten Mutanten im Vergleich zu WT und E/Q eine geringere Bindung aufwiesen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass in diesem rekonstituierten System, in dem hohe Konzentrationen von Proteinen und Nukleinsäuren vorhanden waren, diese verschiedenen rA3G-Mutanten an der Dimer-Grenzfläche und im PEP-Bereich immer noch in der Lage sind, über andere Reste außerhalb des PEP-Bereichs an der Dimer-Kreuzung an RNA und ssDNA zu binden.

Insgesamt ist die Verringerung der Bindung dieser Mutanten bei der ssDNA-Bindung stärker ausgeprägt als bei der RNA-Bindung. Interessanterweise zeigte der Deaminase-Assay mit den gereinigten Proteinen dieser rA3G-Mutanten (rM9-rM12 und rM15), dass diese Dimer-Interface-Mutanten und RNA-bindenden Mutanten alle eine reduzierte Deaminase-Aktivität im Vergleich zu WT aufwiesen (ergänzende Abbildung 8). Die geringere ssDNA-Bindung dieser Mutanten könnte zumindest teilweise für die unterschiedlich starke Verringerung der Deaminaseaktivität verantwortlich sein. Der Grad der verminderten ssDNA-Bindung scheint jedoch nicht streng mit dem Grad der Störung der Deaminaseaktivität zu korrelieren. Zum Beispiel zeigte rM12 die niedrigste ssDNA-Bindung (ergänzende Tabelle 3), ist aber nicht diejenige mit der geringsten Deaminaseaktivität (ergänzende Abb. 8).

Auswirkungen von PEP/Dimer-Grenzflächenmutationen auf die HIV-Restriktion

Die W127A-Mutation auf humanem A3G (hA3G) ist dafür bekannt, dass sie die Virionen-Verpackung und damit die HIV-Restriktion stört, wahrscheinlich durch die Aufhebung der durch diesen Rest vermittelten RNA-Bindung. In Studien, in denen die Verpackung von hA3G-W127-Mutanten durch eine Vpr-Peptidfusion induziert wurde, wurden jedoch Mängel bei der HIV-Restriktion festgestellt15. Um weitere Einblicke in den Mechanismus der HIV-1-Restriktion durch hA3G zu gewinnen, haben wir zusätzliche hA3G-Mutanten entwickelt, die sich an der rA3G-Struktur und den Mutationsdaten orientieren. Die Absicht dieser hA3G-Mutationen (ergänzende Tabelle 4) war es, die intramolekularen CD1-CD2-Wechselwirkungen (M2, M3, M4) zu stören (ergänzende Abb. 9A, B), die RNA-Bindung um die Dimerkreuzung durch Mutation einer zunehmenden Anzahl polarer/geladener Reste (M12, M13, M14) zu stören oder die Protein-Protein-Dimer-Wechselwirkungen durch Mutation einer zunehmenden Anzahl vergrabener Reste (M6, M10, M11) zu stören (ergänzende Abb. 9C). 9C).

Wie erwartet, hatte WT hA3G keine HIV-1 Restriktionsaktivität in Anwesenheit von Vif, beschränkte aber vollständig HIV-1 in Abwesenheit von Vif, und das Vif-resistente M1 (D128K) Konstrukt beschränkte vollständig die HIV-Infektion mit oder ohne Vif (Abb. 4a-c). Die W127A-haltige Mutante M9 (mit den Mutationen F126A/W127A/I187Y, ergänzende Abb. 9C), von der bekannt ist, dass sie sowohl die RNA-Bindung als auch die Dimerisierung stört, hatte dagegen unabhängig von der Anwesenheit von Vif keine Restriktionsaktivität (Abb. 4a-c). Dies steht im Einklang mit früherer Literatur, die besagt, dass W127 aufgrund seiner RNA-Bindungsfähigkeit, die für die hA3G-Virion-Verpackung und die deaminationsunabhängige Restriktion der reversen Transkription notwendig ist, wichtig für die HIV-Restriktionsaktivität ist14,15. Obwohl die Empfindlichkeit des Proteins gegenüber dem Vif-Abbau reduziert zu sein scheint (ergänzende Abb. 10A), wurde im Vergleich zu WT hA3G in Gegenwart oder Abwesenheit von Vif etwa 5- bis 10-mal weniger M9-Mutantenprotein in das Virion verpackt (Abb. 4a, b). Diese Ergebnisse der WT- und Kontrollmutanten M1 und M9 von hA3G zeigten in unserer Studie volle oder fehlende Aktivität.

Für die Mutanten, die die intramolekularen CD1-CD2-Wechselwirkungen beeinträchtigen sollten, wurden mehrere Reste in der Nähe oder innerhalb der Interdomänen-Schnittstelle auf der CD2-Seite für M2 und M3 und auf der CD1-Seite für M4 mutiert (ergänzende Abb. 9A, B). M2 und M3 hatten beide eine deutlich geringere HIV-1-Restriktionsaktivität in Abwesenheit von Vif (Abb. 4c). M2, das Mutationen an den CD2-Schleifen 1 und 3 um die Schnittstelle mit CD1 trug, zeigte einen vollständigen Verlust der katalytischen Aktivität (Abb. 4e), wahrscheinlich weil einige dieser mutierten Reste, wie H216, für die ssDNA-Substratinteraktion wichtig sind49. M3, das Mutationen an der CD2-Schnittstelle mit CD1 trägt, beginnend mit den Linker-Resten R194/H195 (ergänzende Abb. 9A, B), hatte nur ~10 % WT-Desaminase-Aktivität (Abb. 4e), was möglicherweise auf den Verlust der korrekten CD2-Interaktion mit CD1 zurückzuführen ist und die koordinierte ssDNA-Substratbindung für eine effiziente katalytische Aktivität beeinträchtigt. M4, das mehrere Mutationen um die Interdomänenschnittstelle auf CD1 trägt, zeigte ähnliche Eigenschaften wie WT, was darauf hindeutet, dass diese Mutationen keine offensichtlichen Auswirkungen auf die Restriktionsfähigkeit haben. Interessanterweise hatte diese Mutation volle katalytische Aktivität (Abb. 4e), was auf eine gewisse Plastizität zwischen den CD1-CD2-Grenzflächeninteraktionen für die Funktionen hindeutet.

M12 und M13 wurden entwickelt, um nur die RNA-Bindung an den PEP-Bereich an der Dimerkreuzung zu stören, und M14 enthält die meisten Mutationen von M12 und M13 plus vier zusätzliche R/K-Reste (K52/K63/R69/K76), um die verbleibende einzige positiv geladene Oberfläche auf A3G-CD1 zu eliminieren (ergänzende Abb. 9C). Überraschenderweise zeigten diese Mutanten alle eine HIV-1-Restriktionsaktivität von etwa 70 % in Abwesenheit von Vif (Abb. 4c). Obwohl es schwierig war, die Vif-Empfindlichkeit zu quantifizieren, da M12, M13 und M14 im Vif-Sensitivitäts-Assay nur geringfügig exprimiert wurden (ergänzende Abb. 10A), zeigten alle drei Mutanten, ähnlich wie WT, keine HIV-Restriktionsaktivität in Gegenwart von Vif (Abb. 4c), was darauf hindeutet, dass sie immer noch ausreichend empfindlich gegenüber dem Vif-vermittelten Abbau sind. Der Grund für die nur 70 %ige HIV-1-Restriktionsaktivität von M12-14 lag nicht an ihren niedrigeren Proteinkonzentrationen im Steady-State, die in HEK293T-Zelllysaten nachgewiesen wurden (Abb. 4a, b), da die Transfektion von weniger WT-Expressionsplasmid, um ähnliche zelluläre Expressionsniveaus wie M12-M14 zu erreichen, immer noch zu einer ~4-fach höheren HIV-1-Restriktion als bei WT führte (ergänzende Abb. 10B). Dies steht im Einklang mit der deaminationsunabhängigen Restriktionsaktivität, da diese drei Mutanten eine gestörte Deaminationsaktivität aufwiesen (Abb. 4d, e). Insbesondere M14 wies einen vollständigen Verlust der Deaminaseaktivität auf (Abb. 4e). Dazu passt auch die Hintergrund-Mutationsrate von M14, die auf den Ergebnissen der proviralen DNA-Sequenzierung beruht (ergänzende Tabelle 5). Dennoch zeigte es ~70 % HIV-1-Restriktionsaktivität. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass die in M12-14 mutierten Reste, die die RNA-Bindung im PEP und in nahegelegenen Bereichen auf CD1 stören, nur einen teilweisen Defekt bei der Restriktion von HIV aufweisen, was darauf hindeutet, dass sie ein gewisses Maß an Virionenkapselung und HIV-1-Restriktion beibehalten, was im Gegensatz zu der Rolle der RNA-Bindung steht, die durch Mutationen mit W127 in der M9-Mutante vermittelt wird, die für die Virionenkapselung und HIV-Restriktion entscheidend ist (Abb. 4a-c). 4a-c).

Die Mutanten, die nur die Protein-Protein-Dimer-Interaktionen mit zunehmender Anzahl von Mutationen stören sollen, reichen von M6 bis M11 (ergänzende Tabelle 4, ergänzende Abb. 9C). M6 und M7 zeigten nur einen teilweisen Verlust der Restriktionsaktivität in Abwesenheit von Vif, obwohl M7 aufgrund der zusätzlichen drei Mutationen auf CD2 95% seiner katalytischen Aktivität verlor (Abb. 4e). Daher sind die Mutationen in M6 und M7 für die HIV-Restriktion nicht entscheidend. M10 zeigte in Abwesenheit von Vif einen stärkeren Phänotyp bei der HIV-1-Restriktion, obwohl es eine gewisse katalytische Aktivität beibehielt (Abb. 4e), was darauf hindeutet, dass die Mutationen auf M10 für die Virionenverpackung und die HIV-Restriktion wichtig sind. M11 weist eine ähnliche Deaminaseaktivität wie M10 auf, hat jedoch einen weniger ausgeprägten Phänotyp in Bezug auf Restriktionsaktivität und Integration (Abb. 4c, d). Möglicherweise hat M11 mehr RNA-Bindungsfähigkeit behalten als M10 (aus rM10-11 der rA3G-Mutantenanalyse, Abb. 3a-e), was zu einem weniger schweren Phänotyp führt. Zusammengenommen zeigten diese Ergebnisse, dass die Mutation von Resten innerhalb der vergrabenen Protein-Protein-Dimer-Schnittstelle allein die HIV-Restriktionsaktivität auf reduziertem Niveau aufrechterhielt (Abb. 4c), und die Störung der Deaminase-Aktivität dieser Mutanten (Abb. 4e) könnte teilweise für die Verringerung der HIV-Restriktionsaktivität verantwortlich sein. Dies wiederum steht im Gegensatz zu der M9-Mutante, die keine HIV-Restriktionsaktivität zeigte (Abb. 4a-c).