Vergleichende Studie der Wirkung von Baicalin und seinen natürlichen Analoga auf Neuronen mit Sauerstoff- und Glukose-Entzug unter Beteiligung der angeborenen Immunreaktion von TLR2/TNF𝛼
- Abstract
- 1. Einleitung
- 2. Materialien und Methoden
- 2.1. Chemikalien und Materialien
- 2.2. Zellkultur
- 2.3. Zytotoxizitätstests in vitro
- 2.4. Zellen für Sauerstoff-Glukose-Entzug
- 2.5. Vorbereitung der Proben
- 2.6. Western Blot
- 2.7. Nachweis der Gesamt-Antioxidationsfähigkeit
- 2.8. Datenanalyse
- 3. Ergebnisse
- 3.1. Zellwachstumsprofil
- 3.2. MTT-Tests zur Zytotoxizität
- 3.3. Wirkung auf die Expressionen von TLR2, TNFα und Caspase3
- 3.4. Test der Gesamt-Antioxidations-Kompetenz (T-AOC)
- 4. Diskussionen
- Beitrag der Autoren
- Danksagung
Abstract
In dieser Arbeit werden Baicalin und seine drei Analoga untersucht, Baicalin, Wogonosid und Wogonin, auf die Schutzwirkung von Neuronen vor Sauerstoff-Glukose-Entzug (OGD) und die Expression des Toll-like-Rezeptors 2 (TLR2) bei OGD-Schäden. Die Ergebnisse zeigten, dass Baicalin und seine drei Analoga Neuronen vor OGD-Schäden schützen und das Proteinniveau von TLR2 herunterregulieren. Die D-Glucopyranosiduronsäure an Stelle 7 in der Struktur spielte eine zentrale Rolle bei der Zytotoxizität dieser Flavonoid-Analoga. Die Methoxylgruppe an Kohlenstoff 8 der Struktur stand im Zusammenhang mit der TLR2-Proteinexpression sowie der Entzündungshemmung. Darüber hinaus haben wir Caspase3 und die Antioxidationsfähigkeit nachgewiesen, um die Wirkung der vier Analoga auf die Zellapoptose und die gesamte Antioxidationskompetenz im OGD-Modell zu untersuchen.
1. Einleitung
Scutellariae radix, eine chinesische Medizin, hat verschiedene pharmakologische Wirkungen wie antibakterielle, antivirale, entzündungshemmende, antioxidative und antistroke Wirkungen in der Klinik. Sein Wirkstoff ist eine Art von Flavonen, bestehend aus Baicalin, Baicalein, Wogonin und Wogonisid kurz (Abbildung 1). Es wird berichtet, dass Scutellariae radix die Neuronen vor Verletzungen durch Ischämie und Reperfusion schützt. Baicalin, der Hauptbestandteil der Flavone, wurde mit der Neuroprotektion der Schäden durch Ischämie und Reperfusion und die Wirkung auf das zentrale Nervensystem bestätigt. Kürzlich wurde Baicalein mit einer vielversprechenden Wirkung auf die Neuroaktivität an mehreren Stellen untersucht. Allerdings wurde in keinem Bericht die Wirkung von Baicalin und TLR2-Expression auf Neuronen beschrieben. In einigen wenigen Untersuchungen wurde berichtet, dass Wogonin und Wogonosid auf die Neuronen einwirken. Baicalin und Baicalein wurden als Antioxidantien untersucht; in einigen Modellen war Baicalein sogar stärker als Baicalin in der Reduzierung verschiedener freier Redialien. Im Vergleich dazu milderten Baicalein und Baicalin die durch Wasserstoffperoxid induzierte Zellschädigung deutlich ab, während Wogonin und Wogonosid schwächer wirkten. Es wird vermutet, dass es andere Mechanismen von Wogonin und Wogonosid zur Neuroprotektion geben muss.
Chemische Strukturen von Baicalin und seinen natürlichen Analoga, Baicalein, Wogonosid und Wogonin.
Nachdem die entzündungshemmende Wirkung von Baicalin und Baicalein bestätigt wurde, wurden die Forschungen über die angeborene Immunreaktion bei der zerebralen Ischämie-Reperfusion untersucht und der Grund dafür dargelegt, warum die entzündungshemmende Wirkung von Baicalin und Baicalein einer der wichtigsten Tests für den Schutz des Gehirns vor Ischämie-Reperfusionsschäden war. Mehrere Rezeptoren wurden als Schlüsselziele für ischämische Reperfusionsschäden in den Glia identifiziert, wie z. B. die Toll-like-Rezeptoren (TLRs) und die NODs (Nukleotid-bindende Oligomerisierungsdomäne). Unser früheres Experiment zeigte, dass Baicalin die Expression von NOD2 und TNFα in Neuronen mit Ischämie- und Reperfusionsschäden in vivo und in vitro abschwächt. Es wurde berichtet, dass Wogonosid die Lipopolysaccharid-induzierte Angiogenese über die Signaltransduktion des Toll-like-Rezeptors 4 (TLR4) hemmt. TLR2 wurde jedoch nicht durch Baicalin und seine natürlichen Analoga untersucht.
Auf der Grundlage der zuvor erwähnten Informationen untersuchten wir das Regulierungsverhalten von Baicalin und seinen Analoga durch eine Art von Nervenzelle PC12, um die möglichen Ziele von Baicalin und seinen Analoga in angeborenen Immunreaktionen während des Sauerstoff- und Glukoseentzugs (OGD) und die Beziehungen zwischen der chemischen Struktur und der Wirkung von Baicalin und seinen natürlichen Analoga zu erforschen. Da TLR2 einer der ersten Rezeptoren in der angeborenen Immunität ist und die entzündliche Aktivierung sowie TNFα durch Baicalin in Lungenzellen gehemmt werden kann, wurde die Proteinexpression von TLR2 und TNFα getestet, um die Rolle von Baicalin und seinen Analoga in diesem Nervenverletzungsmodell herauszufinden. In der Zwischenzeit ist Caspase3 ein bekannter Index für Apoptose, und in mehreren Studien wurde berichtet, dass einige Flavone die Apoptose von Entzündungszellen auslösen können, weshalb wir die Expression des Caspase3-Proteins nachwiesen. Darüber hinaus wurde in dieser Arbeit auch die Wirkung der vier Analoga auf die gesamte Antioxidationsfähigkeit von Zellen im OGD-Modell festgestellt, wodurch die Gesamtkompetenz dieser Flavone weiter verglichen wurde.
2. Materialien und Methoden
2.1. Chemikalien und Materialien
Baicalin (Reinheit 98%) wurde von Dr. Lujun Zhang, Laboratory of Pharmaceutical Sciences, Tsinghua University, zur Verfügung gestellt. Wogonosid (Reinheit 98%) wurde von Dr. Xiuwei Yang, School of Pharmaceutical Science, Peking University, vorgestellt. Baicalein und Wogonin, alle mit einer Reinheit von 98% (Chargennummer 111595-200604 und 111514-200403), wurden vom China National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products erworben. Während des gesamten Experiments wurde deionisiertes Wasser verwendet. Andere organische Lösungsmittel und Reagenzien waren von analytischer Reagenzienqualität. PBS-Puffer mit pH 7,4 wurde in unserem Labor hergestellt. PC12-Zellen wurden von der Zellbank des Institute of Fundamental Medicine, Chinese Academy of Medical Science (Peking, China) zur Verfügung gestellt. Fötales Rinderserum (FBS) und RPMI 1640-Medium wurden von GIBCO bezogen. Anti-TLR2/TNFα/Caspase3/β-Actin-Antikörper wurden von der Firma Santa Cruz (USA) erworben. Der sekundäre Antikörper wurde von der Firma Zhongshan (Beijing, China) erworben. Das Kit zum Nachweis der gesamten Antioxidationsfähigkeit (T-AOC) wurde vom Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, China) erworben.
2.2. Zellkultur
PC12-Zellen wurden auf etwa 1 × 106 Zellen/ml eingestellt und mit 2 ml in jede Vertiefung von 6-Well-Platten (Costar) in RPMI 1640, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 5 % Pferdeserum und Penicillin/Streptomycin (jeweils 100 U/ml), beimpft. Die Zellen wurden in einem befeuchteten Inkubator (5% CO2) (Sanyo, Japan) bei 37°C kultiviert und für mindestens 48 Stunden angeheftet.
2.3. Zytotoxizitätstests in vitro
Die sichere Dosierung von Baicalin und seinen drei Analoga für die Zellen wurde mit dem MTT (Methylthiazol-Tetrazolium)-Test in vitro untersucht. Nach 24 Stunden Inkubation der Zellen in 96-Well-Platten wurden Baicalin und seine Analoga in einer Dosierung von 10 mg/mL bis 0,001 mg/mL zugegeben. 24 Stunden nach Zugabe der Verbindungen wurde das Kulturmedium in den 96-Well-Platten mit MTT (5 mg/mL, 200 μL pro Vertiefung) bei 37°C 4 Stunden lang inkubiert. Dann wurde das Medium vorsichtig abgesaugt und 200 μL Dimethylsulfoxid (DMSO) pro Vertiefung zugegeben, um die blauen Formazanprodukte aufzulösen. Die Absorptionswerte bei 490 nm wurden mit einem Mikroplattenlesegerät (Modell 550，Bio-Rad，USA) gemessen. Die Ergebnisse der Absorption in den Testvertiefungen wurden als lebende Zellen ausgedrückt. Die 50%ige Zytotoxizitätskonzentration (CC50) wurde berechnet:
2.4. Zellen für Sauerstoff-Glukose-Entzug
Für den Sauerstoff-Glukose-Entzug (OGD) ersetzten wir das Wachstumsmedium durch glukosefreies Kulturmedium (2 ml pro Vertiefung) und stellten die Platten für 120 Minuten in einen Inkubator (YCP-30Q, Changsha, China) mit 95% N2/5% CO2 bei 37°C. Anschließend wurden die Zellen wieder in das normale Nährmedium gegeben und unter normalen Bedingungen bei 37 °C (Sanyo, Japan) für die spezifische Zeit für die späteren Experimente bebrütet. Kontrollzellkulturen ohne Sauerstoff- und Glukoseentzug wurden unter normalen Bedingungen im Medium mit Glukose bebrütet.
Um die schützende Wirkung der Verbindungen vor OGD-Schäden zu ermitteln, wurde der Zelllebens-Test wie zuvor beschrieben durchgeführt. Nach 24 Stunden Inkubation der Zellen in 96-Well-Platten wurden Baicalin und seine Analoga in einer Dosierung von 10 mg/mL bis 0,001 mg/mL zugegeben. 24 Stunden nach Zugabe der Verbindungen wurde das Kulturmedium in den 96-Well-Platten 4 Stunden lang bei 37 °C mit MTT (5 mg/mL, 200 μL pro Vertiefung) inkubiert. Das Medium wurde vorsichtig abgesaugt und 200 μL DMSO pro Vertiefung hinzugefügt, um die blauen Formazanprodukte aufzulösen. Die Absorptionswerte bei 490 nm wurden mit einem Mikroplattenlesegerät gemessen. Die Ergebnisse der Absorption in den Testvertiefungen wurden als lebende Zellen ausgedrückt. Die 50%ige effektive Konzentration (EC50) wurde berechnet. In Kombination mit der Zytotoxizität (CC50) der Verbindungen wurden die Sicherheitsindizes (SI) durch EC50/CC50 berechnet.
Für die TLR2/TNFα- und Caspase3-Studie wurde die minimale Sicherheitskonzentration von Baicalin und seinen Analoga auf 10 μg/mL festgelegt. Diese Verbindungen (10 μg/mL) wurden zugegeben, als das Kulturmedium durch eine Glukoselösung ausgetauscht und die Zellen unter normalen Bedingungen kultiviert wurden. Die Zellen wurden zu einem bestimmten Reperfusionszeitpunkt (0,5, 1, 3, 6 Stunden) nach Zugabe von Baicalin und seinen Analoga für Proteinexperimente entnommen. Bei der Kontrolle wurde das Medium als Vehikel verwendet, und die Zellen wurden zum Reperfusionszeitpunkt von 6 Stunden entnommen.
2.5. Vorbereitung der Proben
Zwei Gruppen ohne Medikamente wurden als Kontrolle verwendet. Eine Gruppe der Zellen wurde während des gesamten Versuchsverlaufs ohne Sauerstoff-Glukose-Entzug in das Medium mit normalem Wachstumsmedium ausgesät. Die zweite Gruppe wurde in das Medium mit Sauerstoff-Glukose-Entzug als Modellkontrolle ausgesät. Zu jedem Zeitpunkt wurde die Zellprobe auf die gleiche Weise vorbereitet wie zuvor beschrieben. Das Medium wurde aus jeder Vertiefung entnommen, und die Zellen wurden dreimal mit kaltem PBS (pH 7,4) gewaschen und mit 100 μL RIPA verwendet, um das Gesamtprotein für Western Blotting zu gewinnen.
2.6. Western Blot
Western Blot Assay für die Proteinexpression von β-Actin, TLR2, TNFα und Caspase3 wurde mit minimaler Modifikation wie folgt referenziert: geladenen Proben in das Gel (10%), wurde bis zum Marker (gekauft von Fermentas Republik Litauen) und ging an das Ende des Gels laufen. Der Transfer sollte 60 Minuten lang bei 12 Volt und 280 mA halbtrocken sein. Dann wurde die Membran mit 10 % Milch in PBST (1 × PBS + 0,1 % Tween20) 60 Minuten lang unter langsamem Schütteln bei Raumtemperatur blockiert. Die Membran wurde in 1 mL PBST mit einem Antikörper in einer Verdünnung von 1:1000 gegeben, 60 Minuten bei Raumtemperatur auf dem Schüttler inkubiert und nach der Inkubation mit dem primären Antikörper dreimal mit PBST gewaschen. Danach wurde die Membran 60 Minuten lang in PBST mit dem sekundären Antikörper in der Konzentration 1 : 3000 inkubiert. Die Membran wurde zuletzt dreimal mit PBST gewaschen.
2.7. Nachweis der Gesamt-Antioxidationsfähigkeit
Das Prinzip dieses Versuchs bestand darin, die Farbänderung nach der Reduktion von Fe3+ zu Fe2+ durch die reduzierenden Komponenten in den Proben nachzuweisen. Zu den reduzierenden Komponenten können Enzyme und nicht-enzymatische Moleküle wie das fettlösliche Antioxidans Vitamin E und die wasserlöslichen Antioxidantien Vitamin C, Bilirubin und Harnsäure gehören. Anschließend wurde die optische Dichte bei 520 nm mit einem Mikroplattenlesegerät gemessen. Die Zellprobe wurde wie oben beschrieben vorbereitet und zum spezifischen Reperfusionszeitpunkt (6 Stunden) nach Zugabe von Baicalin und seinen Analoga entnommen. Das Medium wurde aus jeder Vertiefung entnommen, und die Zellen wurden dreimal mit kaltem PBS (pH 7,4) gewaschen. Die Zellen in der Platte wurden durch wiederholtes Einfrieren und Auftauen mit PBS (1 mL/Vertiefung) aufgelöst. Der Überstand wurde für den T-AOC-Test nach Zentrifugieren bei 12 000 U/min gesammelt.
2.8. Datenanalyse
Alle Werte wurden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Die Daten wurden durch ANOVA statistisch analysiert. Die Newman-Keuls-Vergleiche wurden verwendet, um die Quelle signifikanter Unterschiede zu bestimmen, wo dies angebracht war. P-Werte unter 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Die Software CALC 2.0 (The China Association of Pharmacology) wurde für die Berechnung von CC50 und EC50 verwendet.
3. Ergebnisse
3.1. Zellwachstumsprofil
Die Zellen wurden 48 Stunden lang in den Platten mit dem Medium mit 10% FBS ausgesät. Sie wurden nicht für die Experimente verwendet, bis sie gut wuchsen und fest aneinander in den flachen Multiwell-Platten anlagen.
3.2. MTT-Tests zur Zytotoxizität
Um die Zytotoxizität zu untersuchen und die sicheren Dosierungen von Baicalin und seinen Analoga zu bestimmen, wurde ein MTT-Test an PC12-Zellen in vitro durchgeführt. Basierend auf den Experimenten waren 10 μg/ml Baicalin und Wogonosid die höchste Sicherheitskonzentration für normale PC12-Zellen und 1 μg/ml Baicalein und Wogonin die höchste Sicherheitskonzentration für normale PC12-Zellen (Abbildung 2).
(a)
(b)
(a)
(b)
Zytotoxizität von Baicalin, Wogonosid, Baicalein und Wogonin in normalen PC12-Zellen (MTT-Assay). Nach 24 Stunden Inkubation der Zellen in 96-Well-Platten wurden die Chemikalien in einer Dosierung von 10 mg/mL bis 0,001 mg/mL zugegeben. *𝑃<0,05 gegenüber der normalen Kontrolle. Die Daten wurden als Mittelwert ± S.D. von sieben unabhängigen Experimenten dargestellt.
In PC12-Zellen, die mit Sauerstoff-Glukose-Entzug behandelt wurden, überlebten nur weniger als 40% der Zellen im Vergleich zur normalen Kontrolle (𝑃<0,05). Im Vergleich zur Modellkontrolle betrug die minimale wirksame Konzentration (MEC) von Baicalin und Wogonin 10 μg/ml, während die MEC von Wogonosid und Baicalein mit 1 μg/ml gleich hoch war. Die maximale wirksame Konzentration (MAXEC) von Baicalin und Wogonin war mit 1 mg/ml gleich, was bedeutet, dass sie gleich sicher sind. Die MAXEC von Wogonosid lag bei 1 mg/ml, die MAXEC von Baicalein jedoch nur bei 10 μg/ml. Es wurde vermutet, dass Baicalein stärker zytotoxisch ist als Wogonosid. Bei all diesen Verbindungen war die Konzentrationsabhängigkeit nicht deutlich zu erkennen (Abbildung 3).
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
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Schutzwirkung von Baicalin, Wogonosid, Baicalein und Wogonin in PC12-Zellen mit Sauerstoff-Glukose-Entzug (OGD) (MTT-Assay). Nach 24 Stunden Inkubation der Zellen in 96-Well-Platten und 2 Stunden Sauerstoff-Glukose-Entzug wurden die Verbindungen in einer Dosierung von 1 mg/mL bis 0,001 mg/mL zugegeben. #𝑃<0,05 gegenüber der normalen Kontrolle. *𝑃<0,05 gegenüber dem Modell. Die Daten wurden als Mittelwert ± S.D. aus sieben unabhängigen Experimenten dargestellt.
Die CC50 von Baicalin (188,4 μg/mL oder 0,422 mmol/L) zeigte große Unterschiede zu den anderen drei Verbindungen. Baicalein zeigte mit einer CC50 von 8,9 μg/mL (entspricht 0,0329 mmol/L) eine höhere Zelltoxizität. Wogonin und Wogonosid zeigten eine ähnliche Toxizität mit CC50 10,6 μg/mL (entspricht 0,0373 mmol/L) bzw. 13,7 μg/mL (entspricht 0,0298 mmol/L). Baicalein war jedoch wirksamer beim Schutz der Zellen vor OGD-Schäden. Die minimale wirksame Dosis von Baicalein betrug 1 μg/mL (entspricht 0,0037 mmol/L). Die EC50 von Baicalin betrug 1,2 μg/mL (entspricht 0,0027 mmol/L), und die EC50 von Wogonin und Wogonosid betrug 4.3 μg/mL (entspricht 0,0151 mmol/L) und 7,4 μg/mL (entspricht 0,0161 mmol/L). Beim Vergleich zwischen der Toxizität und der Wirkung lagen die Sicherheitsindizes der vier Verbindungen bei 156 (Baicalin), 8,89 (Baicalein), 2,47 (Wogonin) bzw. 1,85 (Wogonosid) (Tabelle 1).
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| CC50 bedeutet die 50%ige zytotoxische Konzentration. EC50 bedeutet die 50%ige effektive Konzentration. SI (der Sicherheitsindex) wurde durch CC50/EC50 berechnet. |
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3.3. Wirkung auf die Expressionen von TLR2, TNFα und Caspase3
Bei Verletzung durch OGD wurden die Proteine von TLR2 und TNFα in den Zellen deutlich exprimiert, was bedeutet, dass OGD die angeborene Immunreaktion stimuliert und eine Entzündung verursacht. Das Caspase3-Protein wurde im OGD-Modell in gewissem Maße hochreguliert, aber es gab keinen signifikanten statistischen Wert (Abbildung 4). Baicalin dämpfte die Proteinexpression von TLR2 und TNFα 3 Stunden nach der Verabreichung. Wenn Baicalin 0,5 Stunden lang wirkte, zeigte die Expression von TLR2 statistische Signifikanz, unabhängig davon, ob sie mit dem Normalwert oder dem Modell verglichen wurde (𝑃<0,05), und die TLR2-Expression von 1 Stunde stieg an (im Vergleich zum Normalwert, 𝑃<0,05); die Expression von 3 oder 6 Stunden zeigte jedoch keinen deutlichen Unterschied im Vergleich zum Normalwert (im Vergleich zum Modell, 𝑃<0,05). Die Expression von TNFα nach 0,5 h war immer noch höher als die der Kontrolle (𝑃<0,05), und die Expressionen nach 1 h, 3 h und 6 h wurden deutlich herunterreguliert, was einen signifikanten Unterschied zum Modellniveau zeigte (𝑃<0,05). Baicalin hatte offensichtlich keinen Einfluss auf die Expression des Proteins Caspase3, wie in Abbildung 4(a) dargestellt.
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(d)
(b)
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Wirkung der vier Analoga auf die Proteinexpressionen von TLR2, TNFα und Caspase3 in PC12-Zellen unter Sauerstoff-Glukose-Entzug (OGD). Der Proteingehalt wurde mittels Western Blot gemessen. Modell bedeutet Behandlung mit Sauerstoff-Glukose-Entzug. 0,5, 1, 3 und 6 h bedeuten die Zeit des Reperfusionsprozesses nach OGD. (a) steht für den Baicalin-Effekt; (b) steht für den Wogonosid-Effekt; (c) steht für den Baicalein-Effekt; (d) steht für den Wogonin-Effekt. Baicalin, Wogonosid und Wogonin wurden in einer Konzentration von 10 μg/mL verwendet, das Baicalein in einer Konzentration von 1 μg/mL. *𝑃<0,05 gegenüber der normalen Kontrolle. #𝑃<0,05 gegenüber der Modellgruppe. Daten wurden als Mittelwert ± SD von drei unabhängigen Experimenten dargestellt.
Nach der Zugabe von Wogonosid (10 μg/mL) wurden TLR2 und TNFα offenbar herunterreguliert. Die Expression von TLR2 war viel niedriger als die des Modells, sogar als das normale Niveau (𝑃<0,05). Dementsprechend wurde die Expression von TNFα durch Wogonosid offenbar ab 0,5 Stunden nach seiner Verabreichung bis zum Zeitpunkt von 6 Stunden gehemmt (𝑃<0,05). Wogonosid zeigte auch keine offensichtliche Wirkung auf die Expression von Caspase3 (Abbildung 4(b)).
Nach der Verabreichung von Baicalein wurde TLR2 0,5 h und 1 h nach der Zugabe von Baicalein immer noch signifikant hochreguliert (𝑃<0,05), und es ging nach 3 h und 6 h auf den Normalwert zurück. Wie TLR2 wurde auch TNFα nach 3 und 6 Stunden normal exprimiert (Abbildung 4(c)).
In der Wogonin-Gruppe gingen die beiden Faktoren offensichtlich zurück. TLR2 sank nach 0,5 Stunden nach der Zugabe von Wogonin auf den Normalwert (im Vergleich zum Modell, 𝑃<0,05) und blieb während des Versuchsverlaufs auf einem niedrigeren Niveau. Zu den Zeitpunkten 0,5 h und 1 h wurde TNFα stärker exprimiert als normal (𝑃<0,05), aber weniger als im Modell (𝑃<0,05), und zu den Zeitpunkten 3 h und 6 h näherte es sich wie die TLR2-Expression dem normalen Niveau an (Abbildung 4(d)).
Gleich den Baicalin- und Wogonosid-Gruppen zeigte die Expression von Caspase3 keine signifikante Veränderung in den Baicalein- und Wogonin-Gruppen (Abbildungen 4(c) und 4(d)).
3.4. Test der Gesamt-Antioxidations-Kompetenz (T-AOC)
Unter Verwendung des T-AOC-Kits fanden wir heraus, dass die Antioxidations-Kompetenz der normalen Zellen etwa 2,5 U/mg betrug, und eine der Zellen, die mit Sauerstoff-Glukose-Entzug behandelt wurde, lag weit unter 0,5 U/mg. In der Baicalin-Gruppe lag der Nachweiswert bei 1,8 U/ml, was einen signifikanten Unterschied sowohl im Vergleich zu den normalen Zellen als auch im Vergleich zum OGD-Modell darstellt. In den Wogonosid-, Baicalein- und Wogonin-Gruppen betrugen die Werte 1,6, 0,8 bzw. 0,6 U/mg, die alle einen signifikanten Unterschied im Vergleich zu den Normalwerten oder dem Modell aufwiesen (Abbildung 5).
Wirkung von Baicalin und seinen drei Analoga auf die Gesamt-Antioxidationskompetenz der PC12-Zellen, die mit Sauerstoff-Glucose-Entzug behandelt wurden. Modell bedeutet Behandlung mit Sauerstoff-Glukose-Entzug. Baicalin, Wogonosid und Wogonin wurden in einer Konzentration von 10 μg/mL verwendet, das Baicalein wurde in einer Konzentration von 1 μg/mL verwendet. **𝑃<0,01 gegenüber der normalen Kontrolle. ##𝑃<0,01 gegenüber der Modellgruppe. $$𝑃<0,01 im Vergleich zur Baicalin- und Wogonosid-Gruppe. Die Daten wurden als Mittelwert ± S.D. von acht unabhängigen Experimenten dargestellt.
4. Diskussionen
Baicalin ist eine glykosylierte Verbindung, die von Baicalein abgeleitet ist, und es hat eine funktionelle Gruppe von D-Glucopyranosiduronsäure auf Seite 7 von Baicalein (Abbildung 1), so dass es mehr biologische Funktion aufweisen wird. Die Grundstruktur von Baicalin besteht aus Benzopyran mit drei Hydroxylgruppen an den Stellen 5, 6 und 7 und einer Phenylgruppe auf der anderen Seite des Benzopyrans (Stelle 2). Baicalin hat außerdem eine Enolstruktur am Benzopyranring, um die Konjugation aufrechtzuerhalten. Die beiden Unterschiede zwischen Baicalin und Wogonin liegen in der Methoxylgruppe an Kohlenstoff 8 von Wogonin und der Hydroxylgruppe an Kohlenstoff 6 von Baicalin. Die Bildung von drei Hydroxylgruppen im Baicalin könnte die hydrophileren Eigenschaften erklären. Außerdem ist Wogonosid eine glykosylierte Form von Wogonin mit D-Glucopyranosiduronsäure an Kohlenstoff 7. Alle vier Verbindungen haben ein ähnliches Kohlenstoffskelett mit einer Benzopyranstruktur und auch eine Hydroxylgruppe an Kohlenstoff 5; Baicalein und Baicalin haben Hydroxylgruppen an Kohlenstoff 6, während Wogonin und Wogonosid keine haben; Baicalein und Wogonin haben Hydroxylgruppen an Kohlenstoff 7, während Wogonosid und Baicalin beide an der Hydroxylgruppe an Stelle 7 glykosyliert sind; schließlich haben Wogonin und Wogonosid Methoxylgruppen an Kohlenstoff 8, aber Baicalein und Baicalin haben die funktionellen Gruppen nicht .
Nach dem Ergebnis der Zytotoxizität und der Neuroprotektion war die D-Glucopyranosiduronsäure an der Stelle 7 wichtig für die Verringerung der Zytotoxizität, wobei Baicalin weniger zytotoxisch war als Baicalein und Wogonosid weniger zytotoxisch als Wogonin. Die Methoxylgruppe an Kohlenstoff 8 und die Hydroxylgruppe an Kohlenstoff 6 waren der Hauptfaktor, der die neuroprotektive Wirkung beeinflusste, wodurch die EC50 von Baicalin und Baicalein nach ihrer Verabreichung geringer war als die von Wogonosid und Wogonin (Abbildung 1 und Tabelle 1).
In dieser Studie haben wir festgestellt, dass TLR2 während der Schädigung durch Sauerstoff- und Glukoseentzug (OGD) in PC12-Zellen stark exprimiert wurde, was darauf hindeutet, dass der Rezeptor in den geschädigten Neuronen aktiviert wurde (Abbildung 4). TLR2 wurde als wichtiger Vermittler von Immunantworten und Entzündungsreaktionen identifiziert und vermittelt proinflammatorische Reaktionen durch die Aktivierung von TNFα. Der Rezeptor war im Vergleich zum normalen Niveau signifikant hochreguliert, was darauf hindeutet, dass er an der durch OGD induzierten Neuronenverletzung beteiligt ist.
In der Forschungsliteratur wird TLR2 im zentralen Nervensystem (ZNS) als direkte Quelle des schädigenden Signals und als wichtiges potenzielles therapeutisches Ziel erkannt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Expression von TLR2 und TNFα einige Stunden nach Zugabe der Präparate abnahm. Im gleichen Profil wurden die Expressionen von TLR2 und TNFα durch Wogonin und Wogonosid stärker gehemmt als durch Baicalin und Baicalein. Die Hemmung der Expression begann 0,5 Stunden nach der Verabreichung von Wogonin und Wogonosid; die Hemmung der TLR2- und TNFα-Expression trat jedoch erst 3 Stunden nach der Verabreichung von Baicalin und Baicalein auf. Daher wurde festgestellt, dass Wogonin und Wogonosid eine Präferenz für TLR2 haben. In Verbindung mit ihren chemischen Strukturen deuteten alle Ergebnisse darauf hin, dass die Methoxylgruppe an Kohlenstoff 8 in der Struktur die pharmakophorische Hypothese für die Wirkung der TLR2-Hemmung ist, die mit der Entzündungshemmung zusammenhängt.
Unter der Voraussetzung, dass TLR2 und TNFα durch diese Analoga unterdrückt werden, haben wir Caspase3 nachgewiesen, um zu bestätigen, dass durch den Zusatz der Analoga Apoptose auftritt. Im Vergleich zum Normalzustand war die Expression des Caspase3-Proteins im OGD-Modell tatsächlich in gewissem Maße erhöht, zeigte aber keinen statistischen Unterschied. Bei der Verabreichung der vier Analoga zeigte das Niveau des Caspase3-Proteins keine offensichtliche Veränderung, obwohl es nach 6 Stunden tendenziell abnahm und sich der normalen Kontrolle annäherte (Vergleich mit dem normalen oder dem Modell, 𝑃>0,05). Die obigen Ergebnisse deuten darauf hin, dass die verletzten PC12-Zellen im OGD-Modell keine offensichtliche Apoptose aufwiesen, und die vier Analoga konnten auch keine Apoptose in den verletzten PC12-Zellen auslösen. Laut Literatur milderte Baicalin die globale zerebrale Ischämie-Reperfusionsverletzung bei Wüstenrennmäusen über antioxidative und antiapoptotische Wege ab, und Baicalein und Wogonin konnten beide die Apoptose in menschlichen Bauchspeicheldrüsenkrebszellen und HL-60 Leukämiezellen induzieren. Daher müssen unsere Ergebnisse der Apoptose durch diese Verbindungen weiter untersucht werden.
Bezugnehmend auf die T-AOC-Erkennung, fanden wir, dass die gesamte Antioxidation Fähigkeit Sequenz war Baicalin und Wogonosid > Baicalein und Wogonin, was darauf hindeutet, dass eine glykosylierte Form auf Seite 2 von Baicalin und Wogonosid spielte eine Schlüsselrolle in der gesamten Antioxidation.
Zusammengenommen zeigten Baicalin und seine drei Analoga einen umfassenden Schutz von Nervenzellen vor OGD-Schäden und die Hemmung der TLR2-Expression und von TNFα (dem Faktor im Downstream), was auf die Möglichkeit hinweist, dass diese Verbindungen in der Schlaganfalltherapie eingesetzt werden können, indem sie auf TLR2 abzielen, einen der Hauptmechanismen der zerebralen Schäden. Es besteht eine Struktur-Aktivitäts-Beziehung zwischen ihnen, die Sicherheit, Wirksamkeit und Spezifität der medikamentösen Ausrichtung auf TLR2 gewährleistet. Dies ist das erste Mal, dass Baicalin und seine natürlichen Analoga auf molekulare Ziele von TLR2 und TNFα sowie T-AOC untersucht werden. All das wird bei der Aufklärung und Entwicklung neuer Medikamente von Nutzen sein.
Beitrag der Autoren
Die ersten beiden Autoren trugen gleichermaßen bei.
Danksagung
Die Autoren danken allen Mitgliedern ihres Labors. Die Studie wurde teilweise von der National Natural Science Foundation of China (30801523, 81073092), dem National S&T Major Special Project for New Drug R&D of China (2012ZX09103-201-041, 2012ZX09102-201-008, and 2011ZX09101-002-11), und Special Foundation for Laboratory of Tsinghua University (LF 20103579) unterstützt.