Verzweigte DNA (bDNA)-Technologie

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Einführung

Der Assay für verzweigte DNA (bDNA) bietet ein einzigartiges und leistungsfähiges Instrument für die zuverlässige Quantifizierung von Nukleinsäuremolekülen. Der bDNA-Assay unterscheidet sich grundlegend von Target-Amplifikationsmethoden wie der PCR, da er Nukleinsäuremoleküle direkt auf physiologischer Ebene misst, indem er das Reportersignal verstärkt, anstatt die Zielsequenzen als Nachweismittel zu replizieren, und somit die mit der Extraktion und Amplifikation der Zielsequenzen verbundenen Fehler vermeidet. Der bDNA-Assay verwendet eine lineare Signalverstärkung unter Verwendung synthetischer Oligonukleotid-Sonden und bDNA-Moleküle und kann zwischen etwa 500 und 10.000.000 Molekülen genau und präzise messen. Zu den neuen Fortschritten in der bDNA-Technologie gehören die Hinzufügung von Vorverstärkermolekülen und die Aufnahme neuer Nukleotide, isoC und isoG, in Oligonukleotid-Sondensequenzen, um das Signal weiter zu verstärken und das durch unspezifische Hybridisierung von bDNA-Assay-Komponenten verursachte Rauschen zu verringern. Diese Verbesserungen haben die quantitative Nachweisgrenze des bDNA-Assays auf bis zu 50 Moleküle erhöht.

Geschichte der bDNA-Technologie

Der bDNA-Assay eignet sich gut für den routinemäßigen Einsatz im klinischen Bereich oder in der Forschung und wurde in einer Reihe von Bereichen erfolgreich angewandt, einschließlich der Prognose und Überwachung von Patienten mit Viruserkrankungen. Als zuverlässiges Mittel zur direkten Quantifizierung der Viruslast in klinischen Proben wurden bDNA-Assays zur Messung der DNA des Hepatitis-B-Virus, der RNA des Hepatitis-C-Virus, der RNA des humanen Immundefizienzvirus Typ 1 und der DNA des Cytomegalovirus entwickelt. Mit dem kundenspezifischen Design von Oligonukleotid-Sonden reichen die Anwendungsmöglichkeiten des bDNA-Assays weit über die Quantifizierung viraler Nukleinsäuren hinaus. Durch die Entwicklung von Oligonukleotid-Sonden für spezifische Sequenzen von Ziel-Nukleinsäuremolekülen konnte der bDNA-Assay an eine Vielzahl von Anwendungen angepasst werden. So haben Forscher beispielsweise Sonden für den bDNA-Assay entwickelt, um zelluläre mRNA-Spiegel zu messen. Dies hat sich als fruchtbarer Ansatz für eine Reihe von Forschungsanwendungen erwiesen, darunter die Überwachung von Veränderungen der mRNA-Spiegel von Zytokinen in gesunden und immungeschwächten Patientengruppen, die Untersuchung von Insulin-Spleißmustern und die Bewertung der Induktion von Stressgenen für molekulare toxikologische Anwendungen. Aufgrund seiner Vielseitigkeit, einfachen Anwendung und hohen Leistungsfähigkeit entwickelt sich der bDNA-Assay schnell zur Methode der Wahl für die Nukleinsäurequantifizierung

Übersicht

Der bDNA-Assay verwendet ein 96-Well-Mikroplattenformat und basiert auf einer Reihe spezifischer Hybridisierungsreaktionen und dem Chemilumineszenznachweis der hybridisierten Sonden. An der Oberfläche jeder Mikrotiterplatte sind „Fängersonden“ angebracht, die eine spezifische Nukleotidsequenz enthalten. Diese Fängersonden binden an eine Untergruppe von „Zielsonden“, die an spezifische Nukleotidsequenzen im Ziel-Nukleinsäuremolekül gebunden sind. Durch diese Reihe von Hybridisierungen wird das Ziel-Nukleinsäuremolekül an der Oberfläche der Mikrotiterplatte verankert. Der Nachweis der Zielnukleinsäure und die Verstärkung des Signals erfolgt durch eine weitere Reihe von Hybridisierungen.

Eine zweite Untergruppe von Zielsonden verbindet das Zielnukleinsäuremolekül mit bDNA-Verstärkermolekülen. Durch den Zusatz von Vorverstärkermolekülen, die eine zusätzliche Verstärkungsschicht zwischen den Zielsonden und den bDNA-Verstärkermolekülen bilden, kann eine noch größere Signalverstärkung erreicht werden. Jedes bDNA-Verstärkermolekül wurde so konzipiert, dass es 15 Arme enthält, von denen jeder drei Bindungsstellen für alkalische Phosphatase-konjugierte „Markierungssonden“ aufweist. Nach Einführung eines Dioxetan-Substrats, das durch die alkalische Phosphatase aktiviert wird, wird ein chemilumineszentes Signal erzeugt. Dieses Signal lässt sich leicht quantifizieren, indem die Anzahl der emittierten Photonen in einem Luminometer gezählt wird. Der bDNA-Assay ist von Natur aus quantitativ, da die Anzahl der emittierten Photonen direkt mit der Menge der Zielnukleinsäure in der Probe zusammenhängt.

Materialien

Ausrüstung – Chiron-Plattenheizung mit 8×12-Mikrotiterplattenhalter – Chiron-Plattenleseluminometer

Reagenzien für Tag 1

  • Oligonukleotid-modifizierte Mikrovertiefungen
  • Lyseverdünnungsmittel
  • Lysereagenz (Proteinase K)
  • Zielsonden für Capture
  • Zielsonden für Markierung
  • Proben
  • Standards und Kontrollen (fakultativ)

Reagenzien für Tag 2

Vorgehensweise

Tag 1

  1. Vorbereitung des Proben-Arbeitsreagenzes durch Kombination:
  • 6 ml Lyseverdünner
  • 600 ml Lysereagenz
  • 32 ml 500 fm/ml Zielsonden für die Erfassung (20 fm/200 ml Endmenge)
  • 96 ml500 fm/ml Zielsonden für die Markierung (60 fm/200 ml Endmenge)

Anmerkung: Die tatsächlichen Konzentrationen der Zielsonden variieren je nach dem Ziel-Nukleinsäuremolekül.

  1. Für Plasma- oder Serumproben pipettieren Sie 150 ml Probenarbeitsreagenz und 50 ml Serum oder Plasma in doppelte Oligonukleotid-modifizierte Mikrovertiefungen. Bei Zell- oder Gewebeproben werden die RNA-Pellets wie beschrieben im Probenarbeitsreagenz vorbereitet und extrahiert, und 200 ml jedes RNA-Extrakts werden in doppelte Oligonukleotid-modifizierte Mikrovertiefungen pipettiert.
  2. Wenn gewünscht, können Positiv- und Negativkontrollen zu Spezifitätszwecken mitgeführt werden. Die Kontrollen sollten in der gleichen Weise wie die Proben in Schritt 2 (oben) behandelt und in doppelter Ausführung durchgeführt werden.
  3. Wenn gewünscht, können Standards zur absoluten Quantifizierung beigefügt werden. Pipettieren Sie 150 ml des Proben-Arbeitsreagenzes und 50 ml des entsprechenden Standardkurvenmitglieds in doppelte Oligonukleotid-modifizierte Mikrovertiefungen.
  4. Versiegeln Sie die Mikrovertiefungen mit Mylar-Folie und inkubieren Sie die Mikrovertiefungen über Nacht bei 53°C in der Chiron-Plattenheizung. (Hinweis: Die Temperatur hängt von der optimalen Temperatur für den jeweiligen Test ab.)

Tag 2

  1. Die Platte aus dem Chiron-Plattenheizgerät nehmen und 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen. Während die Platte abkühlt, bereiten Sie die Verstärkerlösung vor, indem Sie das Verstärkerkonzentrat mit 200 fm/ml in Etikettenverdünner verdünnen. Die Endkonzentration sollte 10 fm/50 ml betragen.
  2. Die Mikrovertiefungen zweimal mit Wash A waschen, dann 50 ml des verdünnten Verstärkers in jede Vertiefung pipettieren. Inkubieren Sie die Vertiefungen 30 Minuten lang bei 53 °C im Chiron-Plattenheizer.
  3. Nehmen Sie die Platte aus dem Chiron-Plattenheizer und lassen Sie sie 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Während die Platte abkühlt, bereiten Sie die Etiketten-Arbeitslösung vor, indem Sie die Etiketten-Sonde mit 500 fm/ml in Etiketten-Verdünnungsmittel verdünnen. Die Endkonzentration sollte 20 fm/50 ml betragen.
  4. Waschen Sie die Mikrovertiefungen zweimal mit Wash A und pipettieren Sie dann 50 ml der Label Working Solution in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Vertiefungen 15 Minuten lang bei 53 °C im Chiron-Plattenheizer.
  5. Nehmen Sie die Platte aus dem Chiron-Plattenheizer und lassen Sie sie 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen. In dieser Zeit bereiten Sie die Substratlösung aus 99,7 % v/v LumiphosPlus und 0,3 % v/v 10 % SDS vor (z. B.: 3 ml LumiphosPlus, 9 ml 10 % SDS).
  6. Waschen Sie die Mikrovertiefungen zweimal mit Wash A und dann dreimal mit Wash B. Geben Sie 50 ml der Substratlösung in jede Vertiefung.
  7. Messen Sie die Chemilumineszenz im Platten-Luminometer. (Dies schließt die Inkubation der Mikrovertiefungen für 30 Minuten bei 37°C vor der Messung ein, um die Steady-State-Kinetik zu erreichen).

Störungssuche

  • Oligonukleotid-modifizierte Vertiefungen sollten mit Vorsicht behandelt werden. Brechen Sie die Vertiefungsstreifen nicht in Segmente auseinander. Verschließen Sie die Vertiefungen sicher mit einem frischen Plattenkleber, um eine Verdunstung während der Inkubation zu verhindern. Beim Entfernen der Plattenversiegelung nach der Inkubation ist darauf zu achten, dass die Vertiefungen nicht aus dem Mikrotiterplattenhalter herausgezogen werden.
  • Alle Proben, Standards und Kontrollen sollten für eine optimale Quantifizierung in doppelter Ausführung getestet werden. Für optimale Ergebnisse sollten alle Reagenzien vor der Verwendung auf die in der Testvorschrift angegebene Temperatur gebracht werden. Die Reagenzien werden in die Mikrovertiefungen gegeben, indem die Pipettenspitze die Wand in der Nähe des Mittelpunkts der Vertiefung berührt, und zwar oberhalb der Oberfläche der Flüssigkeit in der Vertiefung.

Anwendung

Die Quantifizierung des Virus oder die Prüfung der Viruslast ist Teil der Routinebehandlung von Patienten, die mit dem HIV-1- oder Hepatitis-C-Virus (HCV) infiziert sind. Derzeit gibt es mehrere molekulare Technologien, die für den Einsatz im klinischen Labor verfügbar sind. Von diesen sind nur die Assays für verzweigte DNA (bDNA) von der FDA für HIV-1- und HCV-Viruslasttests zugelassen. Diese Signalverstärkungstechnologie basiert auf einer Reihe von Hybridisierungsreaktionen, die sich in hohem Maße automatisieren lassen und somit den Arbeitsaufwand für diese Art von Analyse verringern.

Molekulardiagnostische Assays, die die bDNA-Technologie zum Nachweis von Nukleinsäure-Zielmolekülen nutzen, sind empfindliche, spezifische und zuverlässige Instrumente für die Diagnose von viralen und bakteriellen Infektionen und für die Überwachung des Krankheitsverlaufs während der Therapie. bDNA-Tests haben sich von den Entwicklungsstadien im Forschungslabor zu von der US Food and Drug Administration zugelassenen quantitativen Assays mit wertvollen klinischen Anwendungen entwickelt. Die bDNA-Tests sind weniger arbeitsintensiv als viele molekularbiologische Verfahren, da sie sich sehr gut automatisieren lassen. Bei der Verwendung von bDNA ist die Amplifikation einer Zielsequenz nicht erforderlich, und daher ist eine Kreuzkontamination zwischen Wiederholungsproben aufgrund übermäßiger Amplikons oder Verschleppung bei bDNA-Assays weniger wahrscheinlich. Da es sich bei bDNA um eine Signalamplifikationstechnologie handelt, ist der Assay außerdem in der Lage, über seinen gesamten dynamischen Bereich mit einer Variabilität von weniger als 0,5 log oder dem Dreifachen zu quantifizieren.

Die bDNA-Technologie hat sich als vielseitig erwiesen, da Methoden für den Nachweis von Infektionen durch eine Vielzahl von Mikroorganismen entwickelt wurden, darunter der Parasit Trypanosoma

brucei, das Cytomegalovirus, antibiotikaempfindliche und antibiotikaresistente Staphylokokken-Bakterien, das humane Papillomavirus und das Hepatitis-B-Virus. In jüngster Zeit konzentrierten sich die Bemühungen jedoch auf die Entwicklung von bDNA-Assays für die Quantifizierung von HIV-1- und Hepatitis-C-Virus (HCV)-RNA, was zur routinemäßigen Anwendung von bDNA-Methoden im klinischen Molekulardiagnostiklabor führte. Bei der Beschreibung des Fortschritts der bDNA-Methoden liegt der Schwerpunkt dieser Übersicht auf bDNA-Assays für HIV-1 und HCV.

HIV-1 bDNA-Assays der ersten Generation

Genaue, reproduzierbare bDNA-Assays der ersten Generation wurden für den Nachweis von HIV-1 RNA und HCV RNA in menschlichem Plasma entwickelt (Quantiplex HIV-1 oder HCV RNA 1.0 Assay, Bayer, Tarrytown, NY).9-11 In einem der ersten Berichte über den Quantiplex bDNA-Assay wurde keine Reaktivität bei Plasmaproben von seronegativen Spendern mit dem bDNA-Assay der ersten Generation

beobachtet, was auf eine ausgezeichnete Spezifität hinweist.9 Positive Ergebnisse im bDNA-Assay wurden bei 83 % der Proben von 348 Patienten beobachtet, die seropositiv für HIV-1 waren.9 Der dynamische Bereich für die Quantifizierung mit dem Quantiplex HIV-1 RNA 1.0 Assay reichte von 104 (untere Nachweisgrenze) bis zu mehr als 106 HIV-RNA-Kopien/ml.9,11 Veränderungen der Viruslast um das 2- bis 3-fache waren mit dem bDNA-Test statistisch signifikant, was darauf hindeutet, dass der Quantiplex HIV-1 RNA 1.0 Assay sehr genau und reproduzierbar war.11 Im Vergleich dazu waren bei den ersten Versionen des RT-PCR-Assays Veränderungen der Viruslast um das 3,7- bis 5,8-fache erforderlich, bevor die Ergebnisse statistisch signifikant waren.11 Daher wurde bDNA zur Methode der Wahl für die meisten klinischen Studien, in denen die Viruslast und die klinische Wirksamkeit neuer HIV-1 Reverse-Transkriptase- und Protease-Inhibitoren untersucht wurden.

Die Empfindlichkeit der bDNA-Nachweismethode wurde im HIV-1-Assay der zweiten Generation (Quantiplex HIV-1 RNA 2.0 Assay, Bayer) durch eine Änderung des Designs der Ziel- und Fängersonden und durch die Hinzufügung von Vorverstärker-Oligonukleotiden verbessert. Das verbesserte Design der Ziel- und Fängersonden ermöglichte eine Erhöhung der Stringenz der Hybridisierung und damit eine Verringerung des Assay-Hintergrunds. Vorverstärker erhöhen die Signalintensität drastisch, da jedes Vorverstärkermolekül mehrere Regionen für die Hybridisierung mit vielen bDNA-Molekülen aufweist. Darüber hinaus verfügt jedes bDNA-Molekül über mehrere, sich wiederholende Sequenzen für die Hybridisierung von AP-markierten Sonden. Das mit dem Quantiplex HIV-1 RNA 2.0 Assay ausgegebene Signal zeigte Linearität von etwa 500 Kopien/ml bis 1,6 × 106 Kopien/ml (der angegebene dynamische Bereich lag bei 500 bis 8 × 105 Kopien/ml). Die Empfindlichkeit des HIV-1 bDNA-Assays der zweiten Generation war im Vergleich zum Assay der ersten Generation um das 20-fache erhöht (untere Nachweisgrenzen lagen bei 500 Kopien/mL bzw. 10 × 104 Kopien/mL). In einer ausführlichen Analyse der Präzision wurden die Erst- und Wiederholungsergebnisse des Quantiplex HIV-1 RNA 2.0 Assays verglichen. Der HIV-1 RNA 2.0 Assay erwies sich als hochgradig reproduzierbar.14 Von 174 Proben mit Viruslasten von mehr als 5.000 Kopien/ml wiesen 96 % Unterschiede von weniger als 0,3 log10 in der Kopienzahl zwischen den ursprünglichen Ergebnissen und den Ergebnissen der Wiederholungsuntersuchung auf. Von 69 Proben mit Viruslasten zwischen 500 und 5.000 Kopien/ml wiesen 86 % Unterschiede von weniger als 0,3 log10 zwischen den Ergebnissen der Erst- und der Wiederholungsuntersuchung auf. Bei 5.339 Patienten, die im Rahmen von klinischen Routineuntersuchungen in einem 1-Jahres-Intervall getestet wurden, wurden jedoch in 41,6 % der Proben Viruslasten von weniger als 500 Kopien/ml festgestellt.

Daher war für einen erheblichen Teil der Patienten ein bDNA-Assay mit höherer Empfindlichkeit (d. h. mit einer unteren Nachweisgrenze von <500 Kopien/ml) erforderlich.

Die Leistungsmerkmale des Quantiplex HIV-1 RNA 2.0 Assays und eines RT-PCR-Tests (Amplicor HIV-1 Monitor 1.0 Assay, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) wurden anhand von Verdünnungen von Standardproben mit bekannter HIV-1 Viruskopienzahl verglichen. Wenn Verdünnungen der gleichen Standards in den beiden Assays getestet wurden, waren die HIV-1-Kopienzahlen im RT-PCR-Assay im Allgemeinen höher als im bDNA-Assay. So lag die Spanne der RNA-Kopienzahlen beim bDNA-Test bei 900 bis 7,68 × 105 Kopien/ml und beim RT-PCR-Assay bei 3.360 bis 1,88 × 106 Kopien/ml. Beide Assays waren in den angegebenen dynamischen Bereichen linear.

Der Vergleich der Steigungen der Regressionslinien zwischen HIV-1-Kopienzahl und Signalleistung deutet darauf hin, dass der bDNA-Test einen geringeren proportionalen systematischen Fehler aufweist. Die Variabilität zwischen den Testläufen war bei Verwendung einer Standardprobe mit 1.650 HIV-1-Kopien/ml beim bDNA-Test geringer als beim RT-PCR-Assay; die Variationskoeffizienten für den bDNA- und den RT-PCR-Assay lagen bei 24,3 % bzw. 34,3 %, was darauf hindeutet, dass der bDNA-Assay bei dieser HIV-1-RNA-Kopienzahl etwas präziser war. Im Vergleich zur Verwendung des Standards mit 1.650 Kopien/ml waren die Variationskoeffizienten zwischen den Testläufen bei einer Probe mit 165 HIV-1 RNA-Kopien/ml höher (44,0 % und 42,0 %).7 % für den bDNA- bzw. RT-PCR-Test). Die Assay-Ergebnisse waren ähnlich, wenn gleiche HIV-1-Kopienzahlen bei den HIV-Subtypen A bis F mit dem bDNA-Test verglichen wurden. Mit dieser Version der RT-PCR wurden jedoch die Subtypen A, E und F weniger effizient nachgewiesen als die Subtypen B, C und D. Die Unterschiede zwischen dem bDNA-Test der zweiten Generation und dem Amplicor Monitor RT-PCR-Test für die HIV-1-Quantifizierung deuteten darauf hin, dass für jeden einzelnen Patienten während der gesamten Diagnose und Behandlung eine einheitliche Testmethode erforderlich ist.

HCV bDNA-Assays

Während die Entwicklung eines verbesserten HIV-1 bDNA-Assays der dritten Generation fortgesetzt wurde, erkannte Bayer die Notwendigkeit, einen HCV-Viruslast-Assay zu entwickeln, der einen ähnlichen klinischen Nutzen hat wie der HIV-1-Test. Für den Nachweis von HCV hatte der bDNA-Assay der ersten Generation (Quantiplex HCV RNA 1.0 Assay, Bayer) einen dynamischen Quantifizierungsbereich in menschlichem Plasma von 3,5 × 105 bis 1,2 × 108 HCV-RNA-Kopien/ml. Die Genotypen 1 bis 6 wurden mit diesem Assay nachgewiesen, obwohl die Sensitivität für die Genotypen 2 und 3 (67 % Nachweisrate: positives Signal für 60 von 89 Serumproben, die bekanntermaßen die HCV-Genotypen 2 oder 3 enthalten) geringer war als für den Genotyp 1 (97 % Nachweisrate: positives Signal für 67 von 69 Serumproben, die bekanntermaßen den HCV-Genotyp 1 enthalten). Ein Vergleich zwischen dem Quantiplex HCV RNA 1.0 Assay und einem von einem Forschungslabor entwickelten RT-PCR-Test für HCV ergab eine höhere Sensitivität des RT-PCR-Tests, der eine untere Nachweisgrenze von 2,5 × 104 HCV-RNA-Kopien/ml aufwies. Der HCV bDNA-Test hatte jedoch eine bessere Reproduzierbarkeit und war weniger zeitaufwendig als der im Labor entwickelte HCV-RT-PCR-Test.

Um die Nachweisrate für die HCV-Genotypen 2 und 3 zu verbessern, wurde ein Assay der zweiten Generation entwickelt (Quantiplex HCV RNA 2.0 Assay, Bayer).15 Die wichtigste Änderung im Design des HCV-RNA-Assays der zweiten Generation war die Verwendung von Sonden für Sequenzen im HCV-Genom, die über die Genotypen hinweg stärker konserviert sind. Diese konservierten Regionen waren 5′ untranslatierte Sequenzen und Sequenzen im Kerngen des HCV-Genoms. Die Änderungen an den Ziel- und Fängersonden führten zu einer drastischen Verringerung der Unterschiede in der Nachweisrate zwischen den HCV-Genotypen im Assay der zweiten Generation. Jeder der sechs HCV-Genotypen wies eine hohe Nachweisrate auf, und es gab eine deutliche Verbesserung beim Nachweis der HCV-Genotypen 2 und 3 (Nachweis von 93 % bzw. 67 % der Proben, von denen bekannt war, dass sie die HCV-Genotypen 2 oder 3 enthielten, in den Assays HCV 2.0 und HCV 1.0). Auch die Sensitivität des bDNA-Assays der zweiten Generation war im Vergleich zum HCV 1.0-Assay leicht verbessert (untere Grenzen der Quantifizierung lagen bei 2,0 × 105 gegenüber 3,5 × 105).

BDNA-Assays der dritten Generation für HIV-1 und HCV

Bei den bDNA-Assays der ersten und zweiten Generation war die Sensitivität des Assays durch die unspezifische Hybridisierung von Oligonukleotid-Sonden mit Nicht-Zielsequenzen eingeschränkt. Die entscheidende technologische Verbesserung im bDNA-Assay der dritten Generation (Quantiplex HIV-1 RNA 3.0 Assay, Bayer) bestand in der Verwendung von nicht natürlichen Basen, 5′-Methyl-2′-Desoxyisoguanosin (isoG) und 5′-Methyl-2′-Isooxycytidin (isoC), bei der Synthese aller Sonden im bDNA-System, mit Ausnahme der Capture-Extender, die das Abfangen der viralen Zielnukleinsäure auf der Plattenoberfläche vermitteln. Da Oligonukleotide, die isoG und isoC enthalten, in der Natur nicht vorkommen, ist die unspezifische Hybridisierung deutlich reduziert. Daher bilden die mit den nicht natürlichen Basen modifizierten Sonden in Abwesenheit der Ziel-RNA keine stabilen Hybride mit der Fängersonde. In der Erstbeschreibung des Assays der dritten Generation lag die Nachweisgrenze von HIV-1 in Plasmaproben von 11 Patienten bei 50 Kopien pro ml, was eine 10-fache Verbesserung der Nachweisgrenze gegenüber dem Assay der zweiten Generation darstellt. Während der Behandlung mit einer hochaktiven antiretroviralen Therapie sank die HIV-1-Viruslast bei allen 11 Patienten unter die Nachweisgrenze.

Der VERSANT HIV-1 RNA 3.0 Assay hat einen dynamischen Bereich von 75 bis 5 × 105 HIV-RNA-Kopien/ml. Die Version 3.0 ist auch in mehreren anderen Ländern bis zu einer unteren Nachweisgrenze von 50 Kopien/ml zugelassen. Beim Vergleich von übereinstimmenden Proben mit dem HIV-1 bDNA-Test der zweiten Generation (Quantiplex Version 2.0) und dem Amplicor Monitor 1.0 RT-PCR-Test wurden mit dem bDNA-Test durchweg niedrigere HIV-1-Kopienzahlen ermittelt. Allerdings wurde eine enge quantitative Korrelation der HIV-1-RNA-Kopienzahlen zwischen dem Assay der dritten Generation (Version 3.0) und dem Amplicor Monitor 1.5 RT-PCR-Test beobachtet.18 Die Ergebnisse der Viruslast im bDNA-Assay der Version 3.0 und im Amplicor RT-PCR-Assay waren etwa 2-mal höher als im Assay der Version 2.0. Quantitativ ähnliche Ergebnisse im bDNA-Test der Version 3.0 und im RT-PCR-Test sind für die Patientenversorgung wichtig, da es wahrscheinlich ist, dass bei der Untersuchung von Proben desselben Patienten für den Verlauf von Anti-HIV-Therapien unterschiedliche Methoden verwendet werden. Jüngste Daten deuten darauf hin, dass ein erneutes Baselining bei Patienten, die mit einem RT-PCR-Assay getestet wurden, möglicherweise nicht erforderlich ist.

Ähnlich wie beim bDNA-Assay für HIV-1 Version 3.0 wurden auch beim bDNA-Assay der dritten Generation für HCV isoC- und isoG-substituierte Oligonukleotide verwendet, um unspezifische Hybridisierung zu verringern. Die Verwendung von isoC- und isoG-substituierten Oligonukleotiden erhöhte die Assay-Empfindlichkeit um das 62-fache. Die untere Nachweisgrenze des HCV-RNA-3.0-Assays lag bei 3,2 × 103 Kopien/ml im Vergleich zu 2 × 105 Kopien/ml beim HCV-RNA-2.0-Assay. Der dynamische lineare Quantifizierungsbereich des HCV-RNA-3.0-Assays reichte von 3,2 × 103 Kopien/mL (615 IU/mL) bis 4 × 107 HCV-RNA-Kopien/mL (7,7 × 106 IU/mL). Der HCV-RNA-3.0-Assay wies eine hohe Spezifität (98,2 %) auf und war, ähnlich wie der Assay der zweiten Generation, bei der Quantifizierung von HCV-RNA über alle Genotypen hinweg gleich effektiv. Die Standardabweichungen zwischen und innerhalb von Wiederholungsproben betrugen 0,2 log10 bzw. 0,14 log10, was auf eine hohe Reproduzierbarkeit des Assays der dritten Generation hindeutet.

Neben der Eradikation von HCV im Serum besteht ein wichtiges Ziel von Anti-HCV-Therapien darin, die HCV-Konzentrationen in der Leber zu senken. Die Nützlichkeit des HCV-RNA-3.0-Tests für den Nachweis und die Quantifizierung von HCV-RNA in Leberbiopsieproben wurde bei 25 mit HCV und HIV koinfizierten Patienten untersucht.20 Die Reproduzierbarkeit des HCV-bDNA-Tests der dritten Generation war bei Leberbiopsieproben und Serumproben ähnlich. Auch der Nachweis von HCV-RNA in Leberproben von Patienten, die mit den Genotypen 1, 3 und 4 infiziert waren, mit dem HCV-RNA-3.0-Assay war hochspezifisch und sensitiv. In dieser Studie mit 25 Patienten korrelierten hohe intrahepatische

HCV-Werte vor der Behandlung mit einer geringen Häufigkeit des Ansprechens auf eine HCV-Therapie. Die intrahepatischen HCV-Konzentrationen vor der Behandlung waren am höchsten bei Patienten, die mit HCV-Genotyp 1 infiziert waren. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass wichtige Marker für das Fortschreiten der HCV-Erkrankung, nämlich die HCV-Konzentrationen in der Leber und im Serum, durch bDNA-Analysen während der Behandlung zuverlässig quantifiziert werden können. Die Methoden für bDNA-Assays der dritten Generation umfassen die Probenvorbereitung, die Hybridisierung und den Signalnachweis fürHIV-1-RNA und HCV-RNA. Für den HCV-RNA 3.0-Assay, der keinen separaten Extraktionsschritt erfordert, werden alle drei Tests in den Mikrovertiefungen auf der Plattform des Systems 340 durchgeführt. Beim HIV-1-RNA-Assay der Version 3.0 unterscheidet sich die Probenvorbereitung von der HCV-RNA-Methode und wird außerhalb der System-340-Plattform durchgeführt. In einer kürzlich durchgeführten Studie wurde eine Anpassung der HIV-1-RNA-Methode der Version 3.0 evaluiert, bei der der Schritt der HIV-1-Probenaufbereitung modifiziert wurde, um die gleichzeitige Untersuchung auf HCV und HIV-1 auf der System 340-Plattform zu ermöglichen. Die HIV-1-Methode wurde dahingehend modifiziert, dass die 2-stündige Inkubation bei 63°C zur Viruslyse weggelassen wurde. Stattdessen wurde die HIV-1- und HCV-Lyse auf der System 340-Plattform durchgeführt. Die HCV-bDNA-Testmethoden wurden im kombinierten Assay nicht verändert. Die Spezifität und Quantifizierung durch die kombinierte bDNA-Methode lagen innerhalb der Spezifikationen für die einzelnen HIV-1- und HCV-Assays. Die gleichzeitige Untersuchung auf HIV-1 und HCV verbesserte die Arbeitsabläufe im klinischen Labor und führte zu geringeren Kosten. Da der Nachweis und die Quantifizierung von HIV-1-RNA und HCV-RNA für die Diagnose und die Bewertung des Ansprechens auf eine Therapie von entscheidender Bedeutung sind, stellt die Möglichkeit der gleichzeitigen Testung auf beide Viren einen bedeutenden Fortschritt in der Molekulardiagnostik dar.