Zytotoxische und genotoxische Wirkungen von Acephat auf menschliche Spermien

Abstract

Der intensive Einsatz von Organophosphor-Pestiziden (OPs) könnte die Spermienqualität und die Spermien-DNA in verschiedenen Stadien der Spermatogenese verändern. Acephat ist ein hochtoxisches, häufig verwendetes OP, weshalb wir die Auswirkungen von Acephat auf die Qualität des menschlichen Spermas und die Integrität der Spermien-DNA untersuchen wollten. Spermien gesunder Männer wurden 0, 50, 100 und 200 μg/ml Acephat ausgesetzt und 1, 2 und 3 Stunden lang inkubiert. Anschließend wurden die Motilität, Vitalität, funktionelle Integrität der Plasmamembran, Spermienkapazitation und DNA-Schäden untersucht. Die Ergebnisse zeigten einen signifikanten Rückgang der Motilität bei 100 μg/mL nach 3 h und bei 200 μg/mL nach 1 h, 2 h und 3 h. Die Lebensfähigkeit war bei 200 μg/mL nach 2 h und 3 h signifikant reduziert. Die funktionelle Integrität war bei 100 μg/mL nach 3 h und bei 200 μg/mL nach 2 h und 3 h signifikant beeinträchtigt. Ebenso war die Spermien-Kapazitation bei 200 μg/mL nach 1 h, 2 h und 3 h und bei 100 μg/mL nach 3 h signifikant beeinträchtigt. Die DNA-Schäden waren nur bei der 200 μg/mL-Dosis nach 3 h signifikant erhöht. Die Studie deutet darauf hin, dass die Exposition gegenüber Acephat zu Veränderungen der Spermienstruktur und -funktion führen kann, was zu einer Verschlechterung der menschlichen Samenqualität beiträgt und Unfruchtbarkeit auslöst.

1. Einleitung

In den letzten Jahrzehnten haben mehrere Studien gezeigt, dass die Fortpflanzungsfunktion bei Tieren und Menschen durch vom Menschen hergestellte Chemikalien und andere Giftstoffe beeinträchtigt wird. Leider haben sich relativ wenige Studien systematisch mit den Auswirkungen der Umweltexposition auf die menschliche Fortpflanzungsgesundheit befasst. Jüngsten Studien zufolge leiden jedes Jahr weltweit etwa 60-80 Millionen Paare an Unfruchtbarkeit (keine Empfängnis nach 12 Monaten regelmäßigen ungeschützten Geschlechtsverkehrs). Achtundneunzig Prozent der Fälle von männlicher Subfertilität lassen sich hauptsächlich auf eine mangelhafte Qualität der Spermien zurückführen. Subfertilität kann jedoch auch als idiopathisch angesehen werden und könnte das Ergebnis von Risikofaktoren wie umweltbedingten endokrinen Disruptoren, einschließlich Pestiziden, sein.

Organophosphat-Pestizide sind Ester von Phosphor- und Thiophosphorsäuren, und ihre Toxizität wurde mit ihrer Fähigkeit in Verbindung gebracht, die Wirkung von Acetylcholinesterase zu hemmen, was zu einer Anhäufung von Acetylcholin an Nervenknotenpunkten führt. In vielen epidemiologischen Studien wurde ein Zusammenhang zwischen der Exposition gegenüber Organophosphatpestiziden (OP) und Fortpflanzungsstörungen wie Unfruchtbarkeit, Geburtsfehler, ungünstige Schwangerschaftsergebnisse und perinatale Todesfälle festgestellt. Es wird vermutet, dass Organophosphat-Pestizide die Fortpflanzungsfunktion verändern, indem sie die Acetylcholinesterase-Aktivität im Gehirn verringern und dadurch die Hypophyse beeinflussen und Unfruchtbarkeit verursachen. Die Auswirkungen auf die Samenqualität können anhand von Parametern wie der Spermienkonzentration, dem prozentualen Anteil beweglicher Spermien und dem prozentualen Anteil von Spermien mit normaler Morphologie sowie anhand von Parametern der Spermienbewegung beurteilt werden. Mehrere Studien haben gezeigt, dass Männer, die OP ausgesetzt waren, ein hohes Risiko hatten, anormale Spermienparameter zu entwickeln, darunter eine verringerte Spermienkonzentration, eine verringerte Spermienbeweglichkeit, eine verringerte Spermienzahl und eine höhere Aneuploidie der Geschlechtschromosomen im Sperma. Eine in China durchgeführte Studie mit verschiedenen OP zeigte einen deutlichen Zusammenhang zwischen dem Vorhandensein von Insektizidmetaboliten im Urin und der Spermienkonzentration und -motilität bei frisch verheirateten Männern. In-vitro-Studien mit OP haben gezeigt, dass diese Pestizide die DNA in menschlichen Spermien schädigen und damit genotoxische Wirkungen hervorrufen können.

Unter den in Sri Lanka weit verbreiteten und toxischen OPs ist Acephat (O,S-Dimethylacetylphosphoramidothioat) ein Insektizid, das aufgrund seines breiten insektiziden Spektrums in der Landwirtschaft und im Haushalt eingesetzt wird. Acephat ist ein systemisches Insektizid mit Kontakt- und Magenwirkung. Der toxische Mechanismus von Acephat wird nicht nur auf die Hemmung der Acetylcholinesterase (AchE) zurückgeführt, sondern auch auf seine Wirkung als verzögertes Neurotoxikum. Sing und Jiang berichteten, dass Acephat eine starke neurotoxische, mutagene, karzinogene und zytotoxische Verbindung ist. In ähnlicher Weise zeigten Farag et al., dass 14 und 28 mg/kg/Tag Acephat die Spermienmotilität und die Spermienzahl bei erwachsenen männlichen Mäusen verringerte. Zwei weitere Studien bestätigten, dass Acephat die Fruchtbarkeit, die Spermadynamik, das Gewicht der Geschlechtsorgane und die Sexualhormone bei männlichen Albino-Ratten signifikant verringert. Daher besteht, ähnlich wie bei anderen OPs, ein potenzielles Risiko dieser Verbindung für die reproduktive Gesundheit des Menschen.

Acephat wird in großem Umfang von Landwirten in Sri Lanka verwendet, die sich im besten reproduktiven Alter befinden. In den letzten zwei bis drei Jahrzehnten hat sich gezeigt, dass die berufsbedingte Exposition gegenüber Pestiziden die Fruchtbarkeit von Männern beeinträchtigen kann, was auf ein hohes Expositionsrisiko für diese jungen Landwirte hinweist. Die Regulierung von Pestiziden basiert hauptsächlich auf Tiermodellen, und die Daten über die Exposition des Menschen und die Qualität der Spermien sind nach wie vor spärlich und begrenzt. Daher wurde die vorliegende Studie durchgeführt, um die Auswirkungen von Acephat auf die menschliche männliche Fruchtbarkeit und die DNA-Integrität von Spermazellen in vitro zu untersuchen.

2. Materialien und Methoden

2.1. Testmaterial

Unformuliertes Acephat (Handelsname: Surrender; Molekularformel: C4H10NO3PS; Molekulargewicht: 183,16 g/mol; Reinheit: 99,0%; empfohlene Felddosierung des Herstellers: 1 g Acephat in 1 l Wasser) wurde von Hayleys Agriculture Ltd. in Colombo, Sri Lanka, bezogen. Da Acephat in Biggers Whitten Whittingham (BWW) leicht löslich ist, wurde es als Kontrolle verwendet.

2.2. Spermagewinnung und -aufbereitung

Samenproben wurden von gesunden männlichen Spendern (Alter 20-30 Jahre) der Universität Sri Jayewardenepura, Sri Lanka, in einem sterilen Probengefäß entnommen. Vor der Spermagewinnung erhielten die Spender ein Informationsblatt und eine Einverständniserklärung, in der sie um ihre Bereitschaft zur Teilnahme an der Studie gebeten wurden. Alle teilnehmenden Probanden wurden gebeten, sich vor der Samenentnahme 3 bis 5 Tage lang jeglicher sexueller Aktivität zu enthalten. Für die Studie wurden Männer (Durchschnittsalter von ) mit normaler Spermienkonzentration, -motilität, -morphologie, -viskosität, Verflüssigungszeit und pH-Wert sowie ohne unreife Formen und Leukozyten ausgewählt. Die Spermienparameter (Motilität, Vitalität, hypoosmotischer Schwelltest und Morphologie) wurden gemäß den Richtlinien der Weltgesundheitsorganisation bewertet. Da sich die Auswirkungen von Acephat bei abnormalen Spermien verstärken könnten, ist es wichtig, Spender mit akzeptabler Spermienqualität für die Studie auszuwählen.

Die ethische Genehmigung (Ethical clearance ref. nnumber: 712/13) wurde von der Ethikkommission der Fakultät für medizinische Wissenschaften der Universität Sri Jayewardenepura, Nugegoda, Sri Lanka, eingeholt.

2.3. Bestimmung der Dosisstufen

Um die Dosisstufen zu bestimmen, wurde der LD50-Wert von Acephat für die Spermienmotilität ermittelt. Dazu wurde eine Probe mit 1 mg Acephat in 1 mL BWW hergestellt, was der empfohlenen Felddosierung (1 g Acephat in 1 L Wasser) von Acephat entspricht. Die vorbereiteten Proben wurden anschließend mit BWW verdünnt, um verschiedene Konzentrationen von Acephat zu erhalten. Die Spermasuspensionen (50 × 106 Spermien/mL) wurden in Eppendorf-Röhrchen gefüllt und mit der gewünschten Menge BWW oder Testlösung versetzt (das Endvolumen des Röhrchens entspricht 1 mL). Die Proben wurden gründlich gemischt und dann 1 Stunde lang in einem befeuchteten Inkubator (Sanyo Electric Co. Ltd., Tokio, Japan) bei 37°C und 5% CO2 bebrütet. Nach der Inkubation wurde die prozentuale Beweglichkeit der Spermatozoen bei jeder Konzentration von zwei unabhängigen Beobachtern unter dem Olympus-Mikroskop mit Phasenkontrastoptik (X 400; Olympus Corporation, Japan) bestimmt. Auf der Grundlage dieser Pilotstudie zur Ermittlung von Hinweisen auf toxische Dosen für Spermaproben wurde festgestellt, dass der LD50-Wert für Acephat 200 μg/ml beträgt. Daher wurden in der vorliegenden Studie subletale Konzentrationen unterhalb des LD50-Wertes einschließlich des LD50-Wertes verwendet.

Nachfolgend sind die für die vorliegende Studie ausgewählten Dosisstufen aufgeführt: Hohe Dosis: 200 μg/mL (entspricht dem LD50-Wert). Mittlere Dosis: 100 μg/mL. Niedrige Dosis: 50 μg/mL. Außerdem wurde beschlossen, die Zeitpunkte von 1 h auf 2 h und 3 h zu verlängern, um die verlängerten Auswirkungen der Acephat-Exposition zu bestimmen.

2.4. Pestizid-Inkubation

Frische Spermaproben () wurden mit BWW verdünnt, um eine endgültige Spermienkonzentration von 40 × 106 Spermatozoen/ml zu erhalten. Anschließend wurden die Proben entweder mit Pestiziden in Konzentrationen von 50, 100 und 200 μg/mL oder mit BWW inkubiert. Die Inkubation erfolgte in 1 mL Endvolumen für 1, 2 und 3 h bei 37°C in einem Inkubator (Sanyo Electric Co. Ltd., Tokio, Japan) in 5% CO2 und 95% O2 Atmosphäre.

2.5. Bestimmung der Spermienmotilität

Die Gesamtzahl der beweglichen Spermien wurde von zwei unabhängigen Beobachtern unter Phasenkontrast-Optik (X 400; Olympus Corporation, Japan) geschätzt (etwa 100 Zellen). Der Prozentsatz der Vorwärtsbeweglichkeit wurde berechnet.

2.6. Zytotoxizitätstest

Die Lebensfähigkeit der Spermien wurde mit Hilfe der Eosin-Y-Färbetechnik bestimmt und die toten und lebenden Spermien wurden berechnet. Prozentuale Lebensfähigkeit = (Gesamtzahl der Zellen – gefärbte Anzahl/Gesamtzahl der Zellen) × 100. Gesamtzahl der Zellen = 100.

2.7. Bestimmung der funktionellen Integrität der Spermienplasmamembran

Die funktionelle Integrität der Spermienplasmamembran wurde mit dem von Jeyendran et al. beschriebenen hypoosmotischen Schwellungstest (HOS) bewertet. Mindestens 100 Spermien wurden pro Präparat gezählt.

2.8. Bestimmung der Kapazität

Ein Aliquot von 150 μl BWW-Medium wurde in eine vorgewärmte Kulturschale (35 × 10 mm, Corning, New York, USA) gegeben und mit einem vorgewärmten Deckglas (22 × 22 mm) abgedeckt. Ein Aliquot von 20 μl Spermaprobe wurde in eine Ecke des Deckglases gegeben. Die Kulturschale wurde in ein inverses Mikroskop (Diaphot, Nikon, London, UK) gestellt, das mit einem thermostatisch geregelten Luftheizungsschrank (Nikon, London, UK) ausgestattet war, der bei 37 °C im Gleichgewicht stand. Der Kapazitätsstatus der Spermien wurde anhand der Hyperaktivierung mit der objektiven Fotomethode unter Verwendung eines Olympus IX71 Phasenkontrastmikroskops beurteilt. Da es sich bei der Hyperaktivierung um ein Geißelphänomen handelt, ist es möglich, die Hyperaktivierung anhand der Spermienmotilität visuell zu beurteilen; die Bewegungsmuster der Geißeln wurden für die Zählung der nicht hyperaktivierten und hyperaktivierten Spermien ausgewertet. Die Experimente wurden in doppelter Ausführung durchgeführt und unabhängig voneinander viermal wiederholt.

2.9. Bestimmung von DNA-Schäden in Spermatozoen

Spermienausstriche wurden auf gereinigten Objektträgern präpariert und der Prozentsatz der Spermien mit normaler DNA wurde durch Zählung von 500 Spermien unter dem Fluoreszenzmikroskop (BH-2, Olympus Ltd., Japan) mit einer Anregung von 490 nm bestimmt. Die Beobachtungszeit für ein einzelnes Feld betrug weniger als 40-50 Sekunden. Spermien, die eine gelbe bis rote Farbe aufwiesen, wurden als denaturierte DNA gewertet, Spermien, die eine grüne Farbe aufwiesen, wurden als normale DNA gewertet.

2.10. Statistische Analyse

Die Spermienzahlen erwachsener Männer waren normalverteilt und wurden zwischen den Gruppen mit einer Zweiwege-Varianzanalyse (ANOVA) unter Verwendung des Minitab-Softwarepakets (Minitab Co., USA) auf den Haupteffekt der Pestizide verglichen. Wurde ein signifikanter Behandlungseffekt festgestellt, wurden die Unterschiede zwischen den Mittelwerten der einzelnen Gruppen mit „Tukey 95%“ getestet. Die Daten werden als Mittelwert ± Standard Error Mean (SEM) ausgedrückt. Wert wurde auf .

3. Ergebnisse

3.1. Spermienmotilität

Im Vergleich zur Kontrolle war die prozentuale Motilität bei mittlerer Dosis (100 μg/mL) nach 3 Stunden Inkubation signifikant () um 16 % verringert (Tabelle 1). Im Gegensatz dazu wurde bei 200 μg/mL nach 1, 2 und 3 Stunden Inkubation eine hochsignifikante () Verringerung im Vergleich zu den Kontrollen festgestellt. Darüber hinaus ist die Verringerung der Motilität bei jeder Dosierung mit zunehmender Inkubationszeit deutlich.

3.2. Zytotoxizität

Die prozentuale Lebensfähigkeit verringerte sich (Tabelle 1) in allen Behandlungsgruppen mit der Zeit, aber eine signifikante Verringerung (um 20%; ) wurde bei 200 μg/mL (hohe Dosis) nach 2 Stunden nach der Inkubation im Vergleich zu den Kontrollen festgestellt. Eine hochsignifikante () Reduktion wurde bei der hohen Dosis nach 3 Stunden Inkubation festgestellt, und sie war um 31% im Vergleich zur Kontrolle verringert.

3.3. Funktionelle Integrität der Spermienplasmamembran

Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse der funktionellen Integrität der Spermien nach 1 h, 2 h und 3 h Inkubation. Signifikante Reduzierungen () der funktionellen Integrität wurden bei der mittleren Dosis von 13.5 % nach 3 Stunden und auch in hoher Dosierung um 26 % nach 2 Stunden Inkubation im Vergleich zu den Kontrollen. Eine hochsignifikante () Verringerung wurde bei hoher Dosierung (um 35%) nach 3 Stunden Inkubation festgestellt.

3.4. Spermakapazität

Eine Verringerung der kapazitierten Spermien wurde in allen Behandlungsgruppen beobachtet (Tabelle 1). Der Prozentsatz der kapazitierten Spermatozoen war signifikant reduziert () bei einer Dosis von 100 μg/mL um 18% nach 3 Stunden Inkubation und bei einer hohen Dosis um 32%, 36% bzw. 38% nach 1 Stunde, 2 Stunden und 3 Stunden Inkubation.

3.5. DNA-Schäden in Spermatozoen

Der Prozentsatz der DNA-geschädigten Spermatozoen stieg mit zunehmender Dosierung und Inkubationszeit an. Ein signifikanter () Anstieg der DNA-Schäden wurde jedoch nur bei hoher Dosierung (um 33 %) nach 3 Stunden Inkubation festgestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

4. Diskussion

OP-Insektizide werden in Sri Lanka ausgiebig und mit wenig oder gar keinem Schutz durch die Anwender eingesetzt, so dass die Menschen einem hohen Expositionsrisiko ausgesetzt sind. Darüber hinaus sind diese Landwirte in ihrem besten reproduktiven Alter zwangsläufig über einen langen Zeitraum exponiert. Die vorliegende Studie sollte den Zusammenhang zwischen Acephat, einem OP, und der Spermaqualität sowie DNA-Schäden in Spermien über verschiedene Inkubationszeitpunkte hinweg aufzeigen. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass Acephat die Beweglichkeit, Lebensfähigkeit und Membranintegrität von Spermien beeinträchtigt und in vitro DNA-Schäden hervorruft. Ähnliche Ergebnisse wurden mit Chlorkohlenwasserstoffen, Organophosphaten und Benzolmetaboliten erzielt.

Die signifikante Verringerung der Spermienmotilität, die sowohl bei mittleren (100 μg/mL) als auch bei hohen (200 μg/mL) Acephat-Dosen beobachtet wurde, könnte zu einer Beeinträchtigung der Befruchtungsfähigkeit der Spermien führen. Nach 3-stündiger Exposition gegenüber der höchsten Dosis war die prozentuale Beweglichkeit der Spermien unter die von der WHO empfohlenen Werte gesunken. Die Spermienmotilität gilt als einer der empfindlichsten Indikatoren für zytotoxische Wirkungen auf Spermien und die Beeinträchtigung der Befruchtungsfähigkeit von Spermien. Veränderungen des mitochondrialen Membranpotenzials durch verschiedene Pestizide könnten zu einer Verringerung der Spermienmotilität führen. Die Spermienmotilität hängt auch von der intensiven Umwandlung und dem Energieaufwand ab, die über die oxidativen Wege der Mitochondrien erzeugt werden, und Pestizide könnten die oxidativen Wege stören, was zu einer verzögerten Spermienmotilität und schließlich zum Zelltod führt. Darüber hinaus könnten Pestizidmetaboliten die oxidativen Reaktionen in den Mitochondrien beeinträchtigen, was zur Produktion von überschüssigen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) führt und die ATP-Produktion verringert, was wiederum die Motilität beeinträchtigt. Oxidativer Stress ist Berichten zufolge der wichtigste Mechanismus der Toxizität von Organophosphaten, einschließlich Acephat. Der Verlust der Integrität kann zu einem Anstieg der Membrandurchlässigkeit und einem Verlust der Fähigkeit führen, die intrazellulären Konzentrationen von Ionen zu regulieren, die an der Kontrolle der Spermienbewegung beteiligt sind. Die Gesamtwirkung der Membranschädigung könnte für die kontinuierliche Abnahme der Beweglichkeit und Lebensfähigkeit der Spermien nach der Ejakulation verantwortlich sein.

Die Lebensfähigkeit ist der Anteil der lebenden Spermien, der durch die Bewertung der zellulären und/oder der Membranintegrität bestimmt wird. Der Eosin-Färbetest liefert Informationen über die strukturelle Integrität der Spermienmembran, während der HOS-Test Informationen über die funktionelle Integrität der Spermienmembran liefert. Die Lebensfähigkeit von Spermien ist mit intakten, funktionellen und semipermeablen Plasmamembranen verbunden. Pestizide könnten einen Anstieg der Kalziumionen verursachen, der die Spermienmembranen schädigt und so die Lebensfähigkeit der Spermien beeinträchtigt, lange bevor sie die Eizelle erreichen. Die in der vorliegenden Studie beobachteten Veränderungen der Plasmamembran könnten zu einer Verringerung der Beweglichkeit, Lebensfähigkeit und Membranintegrität der Spermien führen.

Die Hyperaktivierung ist ein Anzeichen dafür, dass die Spermien die Kapazitation abgeschlossen haben, und ist für das Eindringen in die Kumulusmasse und die Zona pellucida unerlässlich. In der vorliegenden Studie wurde gezeigt, dass hyperaktivierte Spermien in hoher Konzentration und mit zunehmender Inkubationszeit abnahmen, was auf eine gestörte Spermienkapazitation hinweist. Die Spermienmembran und die Mitochondrien sind für die Hyperaktivierung von wesentlicher Bedeutung, und jede Schädigung der Spermienmembran und der Spermienmitochondrien kann zu einer Verringerung der kapazitativen Spermien führen. Es ist bekannt, dass OP die Kapazitätsbildung durch Hemmung von AchE beeinträchtigt, wenn es in vitro mit Spermien inkubiert wird. Bei Zugabe ausreichender Mengen von AchE oder AchE-nachahmenden Enzymen zum Medium wurde der Effekt jedoch umgekehrt, was darauf hindeutet, dass die Aktivität von AchE in der Spermienmembran für die Einleitung der Kapazitation wichtig ist.

Die vorliegende Studie zeigt eine signifikante Schädigung der Doppelstrang-DNA bei der höchsten Dosierung (200 μg/mL) nach 3 Stunden Inkubation. Die Unversehrtheit der Spermien-DNA ist für die Übertragung der genetischen Information während der Fortpflanzung von entscheidender Bedeutung, und jede Schädigung der DNA könnte zu Unfruchtbarkeit führen. DNA-Basen und Phosphodiester-Grundgerüste sind besonders anfällig für Schäden, die durch oxidativen Stress verursacht werden, da ihre Plasmamembranen große Mengen an mehrfach ungesättigten Fettsäuren enthalten und ihr Zytoplasma niedrige Konzentrationen an fangenden Enzymen aufweist. Daher könnten hohe ROS-Konzentrationen zu DNA-Doppelstrangbrüchen führen, die häufig in den Spermien unfruchtbarer Männer beobachtet werden. Es wurde festgestellt, dass Acephat die zellulären reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) signifikant erhöht, was zu Modifikationen der DNA durch die Bildung von Basenpaarfehlern und Strangbrüchen führt. DNA-fragmentierte Spermien sind weniger beweglich und weniger anfällig für hypoosmotische Schwellungen, was auf eine geringere funktionelle Integrität der Spermienmembran hinweist und somit zu einer Verringerung der Spermienfunktion mit zunehmender DNA-Schädigung führt. Pestizide, die DNA-Schäden in Leukozyten verursachen, könnten auch zu DNA-Schäden in Spermien führen.

5. Schlussfolgerungen

Die vorliegende Studie deutet auf eine mögliche Beeinträchtigung der Spermienfunktion bei Acephat-Exposition hin. Die in dieser Studie getestete hohe Konzentration von Acephat (200 μg/mL, was der LD50 entspricht) veränderte die menschliche Spermienmotilität, Lebensfähigkeit, funktionelle Integrität der Plasmamembran und die Spermienkapazitation und induzierte DNA-Schäden in vitro. Unter Berücksichtigung der Ergebnisse und der natürlichen biologischen Reaktionen des Menschen, wie Abbau und Ausscheidung von Chemikalien, kann empfohlen werden, dass die getestete höhere Dosierung (200 μg/mL) und mehr ein Risiko für die menschliche Gesundheit darstellen kann.

Abkürzungen

BWW:	Biggers Whitten Whittingham
HOS:	Hypoosmotische Lösung
NaCl:	Natriumchlorid
OP:	Organophosphat-Pestizid
ROS:	Reaktive Sauerstoffspezies.

Ethische Genehmigung

Die ethische Genehmigung wurde von der ethischen Prüfungskommission der Fakultät für medizinische Wissenschaften der Universität Sri Jayewardenepura, Nugegoda, Sri Lanka, erteilt. Die ethische Unbedenklichkeitserklärung hat die Nummer 712/13.

Interessenkonflikte

Die Autoren erklären, dass es keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit der Veröffentlichung dieser Arbeit gibt.

Danksagungen

Die wertvolle Hilfe von Professor Neelika Malavige, Abteilung für Mikrobiologie, Medizinische Fakultät, Universität Sri Jayewardenepura, für die Bereitstellung eines Kohlendioxid-Inkubators und die Abteilung für Zoologie, Naturwissenschaftliche Fakultät, Universität Colombo, für die Bereitstellung von Chemikalien für das Projekt wird sehr geschätzt.