Deficit AP endonukleázy EXO-3 způsobuje zpoždění vývoje a abnormální vulvární organogenezi, Pvl, prostřednictvím aktivace kontrolního bodu iniciovaného DNA glykosylázami u Caenorhabditis elegans

Hladina exprese AP endonukleáz se zvyšuje po stadiu L4

Po vylíhnutí se C. elegans vyvíjejí v dospělce prostřednictvím čtyř larválních stadií (L1-L4), z nichž každé je přerušeno odlupováním kutikuly. Dospělá stadia se ještě dělí na dvě stadia: stadium mladého dospělce a stadium gravidního dospělce. Abychom získali představu o úloze AP endonukleáz po embryogenezi, měřili jsme časové změny v úrovni exprese mRNA exo-3 nebo apn-1. V 0., 24. a 48. hodině, kdy je většina červů N2 ve stadiu vajíčka, resp. ve stadiu L1 a L4, nebyl zjištěn žádný rozdíl v úrovni exprese mRNA jak pro exo-3, tak pro apn-1 (obr. 1a,b). Po 60 hodinách, kdy je většina červů N2 ve stadiu mladých dospělců, byly hladiny exprese exo-3 a apn-1 přibližně 13krát, resp. 2,3krát vyšší než v 0 hodinách (obr. 1a,b). Úroveň exprese po 72 hodinách, kdy je většina červů N2 ve stadiu gravidního dospělce, byla stejná jako po 60 hodinách (obr. 1a,b). Tyto výsledky naznačují, že AP endonukleázy jsou nutné po embryogenezi, zejména po stadiu L4.

Mutanti exo-3 vykazují vývojové zpoždění

Pro objasnění podílu AP endonukleáz na vývoji červů od stadia L4 po dospělce byli červi s nedostatkem jedné nebo obou AP endonukleáz (EXO-3 a APN-1) inkubováni za normálních podmínek chovu po dobu 3 dnů od stadia oplozených vajíček (obr. 1c). Vývojová stadia mezi stadii L4, young adult a gravid adult byla rozlišena podle stavu morfologie vulvy a líhnutí vajíček (obr. 1d,f). Ačkoli se všichni červi N2 vyvinuli v gravidní dospělce, pouze 14 % mutantů exo-3 bylo ve stadiu gravidního dospělce, 85 % bylo ve stadiu mladého dospělce a 1 % bylo ve stadiu larvy (obr. 1g), což naznačuje, že nedostatek EXO-3 způsobuje zastavení vývoje nebo opoždění vývoje. Naproti tomu všichni mutanti apn-1 se stali gravidními dospělci a mutanti apn-1;exo-3 byli v téměř stejných vývojových stadiích jako mutanti exo-3 (obr. 1g). O dvanáct hodin později dosáhli všichni mutanti exo-3 a apn-1;exo-3 stadia gravidního dospělce (údaje nejsou uvedeny), což naznačuje, že nedostatek EXO-3 nezpůsobuje zastavení vývoje ve stadiu mladého dospělce, pouze opoždění vývoje. Abychom přesně zjistili, jak dlouhé bylo zpoždění mutantů exo-3, měřili jsme každé dvě hodiny dobu dosažení gravidního dospělce každého červa a vypočítali jsme rozdíl průměrné doby mezi N2 (N = 8) a mutanty exo-3 (N = 16). Rozdíl činil 6 hodin.

Zpoždění vývoje u mutantů exo-3 je závislé na DNA glykosyláze NTH-1

Dá se usuzovat, že fenotyp zpoždění vývoje u mutantů exo-3 je způsoben hromaděním AP míst nebo 3´-blokovaných SSB v DNA, protože to jsou substráty pro EXO-315. Zpoždění vývoje u mutantů exo-3 je závislé na DNA glykosyláze. Tyto struktury v DNA mohou být vytvářeny DNA glykosylasami. Ze dvou DNA glykosylas konzervovaných v C. elegans vytváří UNG-1 AP místa prostřednictvím monofunkční DNA glykosylasové aktivity na uracilu v DNA a NTH-1 vytváří 3′ blokované SSB prostřednictvím bifunkční DNA glykosylasové aktivity na oxidativních pyrimidinových lézích v DNA. Proto jsme zkoumali závislost zpoždění u mutantů exo-3 na UNG-1 a NTH-1. Tři dny po vývoji z vajíček bylo 9 % mutantů ung-1;exo-3 ve stadiu gravidního dospělce, 86 % ve stadiu mladého dospělce a 5 % ve stadiu larvy, přičemž tyto poměry byly téměř stejné jako u mutantů exo-3 (11 % ve stadiu gravidního dospělce, 85 % ve stadiu mladého dospělce a 4 % ve stadiu larvy) (obr. 2), což naznačuje, že zpoždění je na UNG-1 nezávislé. Naproti tomu 94 % mutantů nth-1;exo-3 bylo ve stadiu gravidního dospělce a 6 % ve stadiu mladého dospělce. Mutanti nth-1;ung-1;exo-3 vykazovali podobné výsledky (obr. 2), což naznačuje, že zpoždění je závislé na NTH-1.

Zpoždění vývoje mutantů exo-3 je zesíleno působením MMS a NaHSO3

Pro objasnění, zda látky vytvářející AP místa mohou způsobit zpoždění vývoje, jsme provedli vývojový test s použitím MMS a disiřičitanu sodného (NaHSO3) (obr. 3a). Je známo, že MMS nepřímo vytváří AP místa20,21 a je prokázáno, že vyvolává léze DNA v genomu C. elegans22. Po 3,5 dnech od nakladení vajíček na destičky obsahující 0,94 mM MMS bylo 97 % mutantů N2 ve stadiu gravidního dospělce a 3 % ve stadiu larvy, zatímco 61 % mutantů exo-3 bylo ve stadiu gravidního dospělce, 34 % ve stadiu mladého dospělce a 5 % ve stadiu larvy (obr. 3b), což naznačuje, že MMS indukovaná AP místa způsobují u mutantů exo-3 další vývojové zpoždění než u N2. Naproti tomu 93 % mutantů apn-1 bylo ve stadiu gravidního dospělce, 6 % ve stadiu mladého dospělce a 1 % ve stadiu larvy, což je podobné výsledkům pro N2 (obr. 3b). NaHSO3 poškozuje DNA především deaminací cytosinu na uracil23. Čtyři dny po vývoji ze stadia vajíčka se všichni mutanti exo-3, kteří nebyli ošetřeni NaHSO3, vyvinuli v gravidní dospělce, ale 33 % mutantů ošetřených 10 mM NaHSO3 bylo ve stadiu gravidního dospělce, 12 % ve stadiu mladého dospělce a 55 % ve stadiu larvy (obr. 3c), což naznačuje, že NaHSO3 vyvolal u mutantů exo-3 opoždění vývoje. U mutantů ung-1;exo-3 se toto zpoždění zmírnilo, protože 79 % mutantů ošetřených 10 mM NaHSO3 bylo ve stadiu gravidního dospělce, 14 % ve stadiu mladého dospělce a 7 % ve stadiu larvy (obr. 3c), což naznačuje, že vývojové zpoždění způsobené NaHSO3 bylo způsobeno aktivitou UNG-1. Dohromady mohou místa AP způsobovat zpoždění vývoje stejně jako 3′ blokované SSB generované NTH-1.

Vývojové zpoždění mutantů exo-3 je indukováno CHK-2

Příště jsme předpokládali, že vývojové zpoždění mutantů exo-3 iniciované glykosylázou DNA je způsobeno aktivací kontrolního bodu poškození DNA řízenou produkty štěpení produkovanými glykosylázami DNA. U C. elegans byly popsány geny kontrolního bodu poškození DNA, jako jsou chk-2 a clk-224 . K ověření naší hypotézy byl proveden vývojový test za podmínek chk-2 (RNAi) nebo clk-2 (RNAi) (obr. 4a). Ačkoli 14 % exo-3;kontrolních (RNAi) červů bylo ve stadiu gravidního dospělce a 84 % ve stadiu mladého dospělce a exo-3;clk-2 (RNAi) červi vykazovali podobné poměry (18 % ve stadiu gravidního dospělce a 82 % ve stadiu mladého dospělce), 93 % exo-3;chk-2 (RNAi) červů bylo ve stadiu gravidního dospělce (obr. 4b). Vyřazení chk-2 tedy zachránilo vývojové zpoždění u mutantů exo-3, což naznačuje, že CHK-2 indukuje vývojové zpoždění u mutantů exo-3.

EXO-3 zabraňuje tvorbě Pvl vyvolané dut-1 (RNAi)

DUT-1 je deoxyuridin trifosfát nukleotidohydroláza (dUTPáza), která hydrolyzuje dUTP na dUMP. Proto dut-1 (RNAi) vede ke zvýšení dUTP v nukleotidovém poolu, který je inkorporován do DNA prostřednictvím replikace DNA místo dTTP, což způsobuje akumulaci uracilu v DNA25,26 . Bylo zjištěno, že dut-1 (RNAi) indukuje abnormální vulvární organogenezi, Pvl, u divokého typu N2 červů a že dut-1 (RNAi) indukovaná Pvl je závislá na UNG-127. Předpokládali jsme, že nedostatek EXO-3 způsobuje zvýšení výskytu dut-1 (RNAi) indukovaného Pvl, protože EXO-3 je potřebný k opravě AP míst po štěpení uracilu v DNA pomocí UNG-1. Abychom to potvrdili, byla u mutantů s deficitem AP endonukleázy pozorována tvorba Pvl vyvolaná dut-1 (RNAi) (obr. 5a-c). Z dospělců přežívajících 4 dny po vývoji z vajíček bylo 52 % exo-3 mutantů s dut-1 (RNAi) indukovaným Pvl a 13 % N2 červů s Pvl (obr. 5d), což naznačuje, že nedostatek EXO-3 způsobuje zvýšení dut-1 (RNAi) indukovaného Pvl. Na druhé straně 15 % mutantů apn-1 mělo Pvl, což je podobné podílu N2 červů s Pvl (obr. 5d). U mutantů apn-1;exo-3 a exo-3 byl podíl podobný, 52 % mělo Pvl (obr. 5d).

Zvýšení Pvl vyvolaného dut-1 (RNAi) u mutantů exo-3 je závislé na UNG-1 bez ohledu na NTH-1

Abychom zjistili, zda ke zvýšení Pvl vyvolaného dut-1 (RNAi) u mutantů exo-3 došlo díky aktivitě UNG-1, zkoumali jsme závislost fenotypu na UNG-1. Procento mutantů ung-1;exo-3 s Pvl bylo 2 %, což bylo stejné jako u mutantů ung-1 s Pvl (1 %) (obr. 6a), což naznačuje, že zvýšení Pvl u mutantů exo-3 je způsobeno pouze expresí UNG-1. V případě mutantů exo-3 jsme zjistili, že se jedná o mutanty s Pvl.

Dále jsme zkoumali, zda jsou štěpné produkty produkované UNG-1 potřebné k indukci Pvl, tj. zda jsou AP místa přeměněna na 3′ blokované SSB prostřednictvím AP lyázové aktivity NTH-1.

Dále jsme zkoumali, zda jsou štěpné produkty produkované UNG-1 potřebné k indukci Pvl. Procento mutantů exo-3 s Pvl bylo srovnatelné s mutanty nth-1;exo-3 (obr. 7b), což naznačuje, že NTH-1 není pro dut-1 (RNAi) indukovanou Pvl nezbytná.

Zvýšení Pvl indukovaného dut-1 (RNAi) u mutantů exo-3 je řízeno CHK-2

Předpokládali jsme, že ke zvýšení Pvl indukovaného dut-1 (RNAi) u mutantů exo-3 v závislosti na UNG-1 může dojít kromě vývojového zpoždění také prostřednictvím aktivace kontrolního bodu DNA řízené štěpnými produkty produkovanými UNG-1. V případě mutantů exo-3 se jedná o zpoždění vývoje. Bylo také zjištěno, že dut-1 (RNAi) indukovaný Pvl je způsoben kinázou kontrolního bodu CLK-227. Proto jsme zkoumali, zda je zvýšení dut-1 (RNAi) indukovaného Pvl u mutantů exo-3 závislé na CHK-2 a CLK-2. U mutantů exo-3 jsme zjišťovali, zda je zvýšení dut-1 (RNAi) indukovaného Pvl závislé na CHK-2 a CLK-2. Ačkoli 49 % exo-3;kontrolních (RNAi) červů mělo dut-1 (RNAi) indukovaný Pvl, pouze 10 % exo-3;chk-2 (RNAi) červů jej mělo (obr. 6b). Naproti tomu podíl červů exo-3;clk-2 (RNAi) s Pvl byl téměř stejný (44 %) jako u červů exo-3;control (RNAi). Vyřazení chk-2 tedy zachránilo zvýšení Pvl vyvolané dut-1 (RNAi) u mutantů exo-3, jak bylo pozorováno u vývojového zpoždění. Tyto výsledky naznačují, že ke zvýšení dut-1 (RNAi) indukovaného Pvl u mutantů exo-3 dochází prostřednictvím exprese CHK-2.

Oxidační látky poškozující DNA zvýšily podíl Pvl u mutantů exo-3 pouze v kombinaci s dut-1 (RNAi)

Pro zkoumání dalších látek poškozujících DNA, které způsobují zvýšení Pvl u mutantů exo-3, jsme hodnotili, zda je tvorba Pvl zvýšena oxidačními látkami poškozujícími DNA, jako jsou ndx-1 (RNAi), ndx-2 (RNAi) a metylviologen (MV). NDX-1 a NDX-2 hydrolyzují 8-oxo-dGDP na 8-oxo-dGMP24,28 . V souladu s tím vedou ndx-1 (RNAi) a ndx-2 (RNAi) ke zvýšení 8-oxo-dGDP v nukleotidovém poolu. Přítomnost 8-oxo-dGDP snižuje aktivitu 8-oxo-dGTPasy NDX-4, což způsobuje hromadění 8-oxo-dGTP v poolu24. Během replikace DNA se 8-oxo-dGTP inkorporuje do DNA, což vede k akumulaci 8-oxoG v DNA24,28. MV vytváří superoxidové radikály, které následně způsobují oxidační léze v DNA29. Jednorázové ošetření ndx-1 (RNAi), ndx-2 (RNAi) nebo MV však nemělo na výskyt Pvl u mutantů exo-3 žádný vliv. (údaje nejsou uvedeny). Dále jsme zkoumali, zda v kombinaci s ošetřením dut-1 (RNAi) jednotlivé oxidační látky poškozující DNA dále zvyšují nárůst Pvl u mutantů exo-3 (obr. 7a). Každé testované ošetření zvýšilo zvýšení Pvl vyvolané dut-1 (RNAi) u mutantů exo-3 přibližně o 10 % (obr. 7b), což naznačuje, že oxidační léze v DNA mohou také způsobit zvýšení Pvl.

V experimentech in vitro bylo zjištěno, že NTH-1 má slabou DNA glykosylázovou aktivitu vůči 8-oxoG v DNA, kromě mnohem vyšší aktivity vůči oxidačním pyrimidinovým lézím30. Předpokládáme tedy, že vyšší zvýšení Pvl vyvolané dut-1 (RNAi) dalšími oxidačními činidly závisí na aktivitě NTH-1. Přestože jsme potvrdili závislost fenotypu na NTH-1, nedostatek NTH-1 nezměnil podíl červů vykazujících Pvl (obr. 7b).

.