EMBL – European Molecular Biology Laboratory

Informace o tvaru a konformaci proteinu a také o interakci mezi makromolekulami lze získat ze sedimentačních a difúzních koeficientů získaných z experimentu se sedimentační rychlostí. Sedimentační koeficienty jsou užitečné zejména pro sledování změn konformace proteinu. Výsledný model celkového tvaru proteinu nebo proteinového komplexu lze porovnat se snímky získanými elektronovou mikroskopií a posoudit, nakolik jsou tyto snímky použitelné pro chování těchto částic v roztoku.

Asociace

Na rozdíl od jiných metod studia vazebných procesů je metoda sedimentační rovnováhy zvláště senzitivní pro studium relativně slabých asociací s asociačními konstantami (Ka) v řádu 10-100 M-1 . Lze však studovat i vazebné procesy s hodnotami Ka výrazně vyššími než 107 M-1.

Přístroj

Analytická ultracentrifuga, kterou máme k dispozici v EMBL, je Beckman Optima XL-A. Přístroj roztočí vzorek proteinu ve vakuu při kontrolované rychlosti a teplotě a zároveň v nastavených časech zaznamenává rozložení koncentrace. V závislosti na rotoru může být rychlost až 60 000 otáček za minutu (což odpovídá 250 000 x g). Pro měření se používají speciální cely, které odolávají vysokému gravitačnímu poli a které umožňují průchod světla vzorkem. Vlastní vzorek je umístěn v dutině sektorového tvaru vložené mezi dvě křemenná okna (viz obr. 1). Tato dutina je umístěna ve středovém dílu z hliníkové slitiny nebo vyztuženého epoxidu. Dvojité sektorové komory se používají také proto, aby bylo možné korigovat absorbanci rozpouštědla vzorku. Tyto cely rovněž umožňují měření rozdílů sedimentačních koeficientů a difuzních koeficientů. Středové články mají délku dráhy 3 až 12 mm, což v kombinaci s volitelnými vlnovými délkami umožňuje zkoumat široký rozsah koncentrací vzorku. Chcete-li zjistit, jak buňku sestavit, přejděte na protokol o sestavení.

.