Actividad antinociceptiva del extracto de metanol de Tabebuia hypoleuca (C. Wright ex Sauvalle) Urb. Stems

Abstract

Objetivo: El objetivo de este estudio fue evaluar la actividad antinociceptiva del extracto de metanol de tallos de Tabebuia hypoleuca (THME). Materiales y métodos: Los animales se dividieron en 5 grupos de 8 ratones para cada prueba (controles negativos, controles positivos y 3 grupos tratados con THME a dosis de 150, 300 y 500 mg/kg, p.o.). El efecto antinociceptivo del THME se evaluó mediante los modelos de retorcimiento, formalina, movimiento de la cola y placa caliente en ratones. Resultados: En la prueba de retorcimiento, el THME (150, 300 y 500 mg/kg) produjo conclusiones significativas (p p p p p): Estos resultados muestran que el THME tuvo actividad antinociceptiva utilizando varios modelos de nocicepción, y sugieren que el efecto está mediado por la participación de mecanismos antinociceptivos tanto periféricos como centrales.

© 2017 El autor(es) Publicado por S. Karger AG, Basel

Significado del estudio

– En este estudio se demostró que Tabebuia hypoleuca tiene efectos antinociceptivos mediados por la participación de mecanismos antinociceptivos tanto periféricos como centrales. La especie T. hypoleuca podría convertirse en una nueva opción terapéutica para el tratamiento del dolor.

Introducción

El dolor es una experiencia subjetiva resultante de la percepción de un estímulo perjudicial e incluye un componente emocional que requiere que el individuo sea consciente cuando esto ocurre . En 1986, la Asociación Internacional para el Estudio del Dolor (IASP) definió el dolor como una experiencia sensorial y emocional desagradable asociada a un daño tisular real o potencial, o descrita en términos de dicho daño . El dolor también tiene un componente fisiológico que se denomina nocicepción, es decir, el proceso por el cual los estímulos térmicos, mecánicos o químicos intensos son detectados por una subpoblación de fibras nerviosas periféricas denominadas nociceptores .

En el alivio del dolor se utilizan los fármacos analgésicos clásicos, especialmente los opiáceos y los antiinflamatorios no esteroideos . Sin embargo, el uso a largo plazo de estos agentes puede producir importantes efectos secundarios, como úlceras gástricas, daño renal, broncoespasmo, anomalías cardíacas, dependencia y otros, lo que limita su uso . A pesar de los recientes avances en el desarrollo de terapias para el tratamiento del dolor, todavía se necesitan analgésicos eficaces. A lo largo de los años, los productos naturales han demostrado ser una fuente inigualable de diversidad molecular que ha conducido al descubrimiento de fármacos actualmente utilizados en la medicina moderna, especialmente en el tratamiento del dolor .

Tabebuia spp. (Bignoniaceae) incluye aproximadamente 100 especies, conocidas como estrictamente leñosas, que se encuentran en zonas de selva tropical en toda América Central y del Sur . Las especies del género Tabebuia se han utilizado tradicionalmente para tratar la sífilis, la malaria, las infecciones cutáneas, los trastornos estomacales, el cáncer, la inflamación, el dolor, las infecciones bacterianas y fúngicas, la ansiedad, la falta de memoria, la irritabilidad y la depresión, entre otros .

Tabebuia hypoleuca (C. Wright ex Sauvalle) Urb., conocida comúnmente como «Roble macho», es una especie endémica de Cuba, originaria de la Sierra Maestra y Guantánamo. Anteriormente hemos reportado la actividad antiinflamatoria del extracto metanólico de tallos de T. hypoleuca (THME) utilizando modelos de edema de pata inducido por carragenina y edema auricular inducido por aceite de crotón en ratones . El presente estudio se realizó para evaluar la actividad antinociceptiva del THME administrado por vía oral en modelos animales de dolor.

Material y métodos

Material vegetal y extracción

Los tallos de T. hypoleuca fueron recolectados en el Jardín Botánico Nacional (JBN), provincia de La Habana, Cuba. La identificación de la planta fue confirmada por el Dr. Eldis R. Becquer y una muestra fue depositada en el herbario de la estación experimental con el número HFC-88204. Para la extracción de los tallos de T. hypoleuca se utilizó la extracción sólido-líquido en Soxhlet con metanol (Merck®). El extracto de metanol se filtró y concentró mediante evaporación rotatoria.

Fármacos y productos químicos

Los fármacos y productos químicos utilizados fueron: indometacina (SOLMED, La Habana, Cuba), diclofenaco (SOLMED), metanol (Merck, Alemania), ácido acético (Merck) y formol (Merck). El extracto y todos los fármacos se diluyeron en solución salina al 0,9% (NaCl diluido en agua destilada).

Animales

Ratones Balb/c machos y hembras (20-25 g) y ratas Sprague-Dawley hembras (180-200 g) fueron suministrados por el Centro Nacional de Producción Animal de Laboratorio (CENPALAB, Santiago de Las Vegas, La Habana, Cuba). Los animales se mantuvieron en condiciones estándar de 23 ± 2°C, 40-60% de humedad relativa y un ciclo de luz-oscuridad de 12/12 h, y se les suministró comida y agua ad libitum durante 7 días. Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con las Directrices Internacionales para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Centro Nacional de Sanidad Animal y Vegetal (CENSA, La Habana, Cuba) (protocolo nº 03/FT/15).

Toxicidad oral aguda

El estudio de toxicidad oral aguda se realizó según las directrices de la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico (OCDE; directriz 423). Para este estudio se utilizaron ratas hembras nulíparas y sanas. Las ratas se dividieron en 2 grupos, con 3 animales en cada grupo. Desde 12 horas antes hasta 3 horas después de la administración oral, los animales se mantuvieron sin acceso a comida y agua. El grupo de control recibió solución salina normal a 1 mL/kg por sonda, mientras que el grupo expuesto recibió 2.000 mg/kg de THME. La seguridad de la dosis de 2.000 mg/kg se confirmó posteriormente en otros 3 animales, tal como recomiendan las directrices de la OCDE. Inmediatamente después de la administración, se observó a todos los animales durante un total de 14 días según los criterios establecidos, prestando especial atención a las primeras 4 h; se observaron los signos clínicos o la mortalidad. En el día 15, todos los animales fueron eutanasiados por dislocación cervical, seguida de necropsia y observación macroscópica de los órganos.

Prueba de retorcimiento

La prueba de retorcimiento se llevó a cabo según lo descrito por Koster et al. con algunas modificaciones . Los ratones macho se dividieron en 5 grupos de 8 ratones cada uno. Los animales fueron tratados por vía oral con indometacina (20 mg/kg), agua destilada (10 mL/kg) y THME (150, 300 y 500 mg/kg). Se indujo el retorcimiento mediante la inyección intraperitoneal de una solución de ácido acético al 0,8% (0,01 mL/g de peso corporal) una hora después del tratamiento. Se contaron los retorcimientos (constricciones abdominales y estiramientos de las extremidades traseras) durante 15 minutos después de la inyección de la solución de ácido acético. El porcentaje de actividad analgésica se calculó como sigue

Prueba de la formalina

La prueba de la formalina se realizó según lo descrito por Santos y Calixto . El comportamiento del dolor inducido por la formalina fue bifásico; la fase aguda inicial (dolor neurogénico) duró de 0 a 5 min y fue seguida por un período de quiescencia relativamente corto, tras el cual vino una respuesta tónica prolongada (dolor inflamatorio) que duró de 15 a 30 min. Los ratones macho se dividieron en 5 grupos de 8 ratones cada uno. Los animales fueron tratados por vía oral con diclofenaco (10 mg/kg), agua destilada (10 mL/kg) y THME (150, 300 y 500 mg/kg). Después de 30 minutos, se inyectó a los animales 20 μL de una solución de formalina al 2,5% (37% de formaldehído) en la superficie plantar de la pata trasera derecha. Se registró el índice de nocicepción, es decir, el tiempo total dedicado por cada animal a lamer o morder la pata inyectada, durante 30 min.

Prueba de deslizamiento de la cola

La prueba de deslizamiento de la cola se realizó según D’Amour y Smith . Los ratones macho se dividieron en 5 grupos de 8 ratones cada uno. Se sumergieron de uno a 2 cm de la cola del ratón en agua caliente mantenida constante a 55 ± 0,5°C. Se registró la latencia entre la inmersión de la cola y la deflección de la misma. Los ratones que mostraron un periodo de latencia entre 1,5 y 3,5 s fueron seleccionados para este estudio 24 h antes del experimento y se registró la latencia previa al tratamiento. Los animales fueron tratados por vía oral con indometacina (20 mg/kg), agua destilada (10 mL/kg) y THME (150, 300 y 500 mg/kg). Sesenta minutos después de la administración oral, se registró de nuevo el tiempo de reacción. Se utilizó un tiempo límite de 10 s para evitar daños en el tejido de la cola de los ratones. El porcentaje de actividad analgésica se calculó de la siguiente manera:

Prueba de la placa caliente

La prueba de la placa caliente se realizó según lo descrito por Asongalem et al. . Los ratones hembra se dividieron en 5 grupos de 8 ratones cada uno. El dispositivo consistía en un baño de agua en el que se colocaba un cilindro metálico (de 20 cm de diámetro y 10 cm de altura). La temperatura del cilindro se fijó en 55 ± 0,5°C. Se seleccionaron para este estudio los ratones que mostraron lamido de la pata delantera, retirada de la(s) pata(s) o una respuesta de salto dentro de los 15 s en la placa caliente, 24 h antes del experimento, y se registró la latencia previa al tratamiento. Los animales fueron tratados por vía oral con indometacina (20 mg/kg), agua destilada (10 mL/kg) y THME (150, 300 y 500 mg/kg). Sesenta minutos después de la administración oral, se registró de nuevo el tiempo de reacción. Se utilizó un tiempo límite de 15 s para evitar daños en la pata. El porcentaje de actividad analgésica se calculó utilizando la misma fórmula que en la prueba de deslizamiento de la cola.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó utilizando el paquete de software estadístico SPSS, versión 21.0 para Windows (IBM Corp., Armonk, NY, USA). Los datos se expresan como media ± SEM. Se utilizó un ANOVA de una vía seguido de la prueba post hoc de Dunnett para determinar las diferencias significativas entre los grupos de control y de tratamiento. p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados

Estudio de toxicidad oral aguda

Un estudio de toxicidad oral aguda mostró que el THME hasta 2.000 mg/kg de peso corporal no produjo ninguna mortalidad ni signos de toxicidad conductual o neurológica en los animales tras 14 días de observación. Se observó un aumento de peso corporal normal y no hubo diferencias en el peso de los órganos de las ratas de control y las tratadas (Tabla 1).

Prueba de mordedura

La administración oral de THME a 150, 300 y 500 mg/kg y de indometacina (20 mg/kg) causó una significativa (F = 168.63, p < 0,001) en el número de episodios de retorcimiento inducidos por el ácido acético de manera dependiente de la dosis en comparación con el grupo de control (Fig. 1). El porcentaje calculado de inhibición de las constricciones de la indometacina fue del 80%, para la THME a 150 mg/kg fue del 53%, para la THME a 300 mg/kg fue del 67%, y para la THME a 500 mg/kg fue del 87%.

Test de formalina

En este modelo, el tiempo de lamido para THME (300 y 500 mg/kg, p.o.) y diclofenaco sódico (10 mg/kg, p.o.) fue significantemente (F = 43,86, p < 0,001) inferior al del grupo de control (Fig. 2a). En la primera fase (0-5 minutos), el tiempo de lamido para la THME a dosis de 300 y 500 mg/kg, p.o., y el diclofenaco sódico (10 mg/kg, p.o.) fue significativamente más corto (F = 50,08, p < 0,001) que en el grupo de control, con una inhibición del 82% (diclofenaco sódico), el 69% (THME a 300 mg/kg) y el 86% (THME a 500 mg/kg). La THME en dosis de 150 mg/kg, p.o., no mostró un efecto analgésico significativo (Fig. 2b). En la segunda fase (15-30 min), el THME mostró un efecto antinociceptivo significativo (F = 26,67, p < 0,001) sólo a una dosis de 500 mg/kg, p.o. Además, el tiempo de lamido del grupo de control positivo tratado con diclofenaco sódico (10 mg/kg, p.o.) fue significativamente más corto (p < 0,001) en comparación con el grupo de control, con una inhibición del 91% (diclofenaco sódico) y del 79% (THME 500 mg/kg). La THME en dosis de 150 y 300 mg/kg, p.o., no mostraron un efecto analgésico significativo en esta fase (Fig. 2b).

Tail Flick Test

La administración oral de 300 y 500 mg/kg de THME y 20 mg/kg de indometacina causó un significativo (F = 13.63, p < 0,002 ; F = 5,49, p < 0,034 ; y F = 26,86, p < 0,001 ) un aumento de la respuesta del tiempo de latencia en comparación con la latencia previa al tratamiento (indometacina, 13%; THME a 300 mg/kg), 7%; y THME a 500 mg/kg, 16% de inhibición). El THME a dosis de 150 mg/kg, p.o., no indujo un efecto analgésico significativo (Fig. 3).

Prueba de la placa caliente

La administración oral de 300 y 500 mg/kg de THME aumentó significativamente (F = 14,24, p < 0,002 ; F = 25,32, p < 0,001 ) la respuesta del tiempo de latencia en comparación con la latencia previa al tratamiento. El umbral del dolor también se redujo significativamente (F = 6,76, p < 0,021) en el grupo de control positivo tratado con indometacina (20 mg/kg) en comparación con la latencia previa al tratamiento. La inhibición fue del 51% para la indometacina, del 51% para la THME a 300 mg/kg y del 61% para la THME a 500 mg/kg. Las respuestas nociceptivas no se vieron afectadas de forma significativa por el THME a 150 mg/kg (Fig. 4).

Discusión

El presente estudio demostró que el THME hasta 2.000 mg/kg de peso corporal (estudio de toxicidad oral aguda) no tuvo ningún efecto tóxico. Además, la administración oral de THME en ratones causó efectos antinociceptivos frente a los estímulos químicos (retorcimiento y formalina) y térmicos (movimiento de la cola y placa caliente) de la nocicepción.

La prueba de retorcimiento describe un modelo típico de dolor inflamatorio. El ácido acético es un inductor de las contracciones abdominales y de la torsión de los músculos abdominales al aumentar el nivel de agentes proinflamatorios en el líquido tisular periférico . En esta prueba, el número de retorcimientos en los ratones tratados con THME fue menor que en los controles, lo que indica la inhibición de la nocicepción visceral inducida por el ácido acético. Este hallazgo confirmó el informe anterior de que el THME mostró actividad antiinflamatoria en 2 modelos de inflamación aguda en ratones, por lo que el efecto antinociceptivo observado podría haberse debido en parte a la inhibición de la liberación de mediadores inflamatorios o al bloqueo de la actividad ciclooxigenasa periférica. Es probable que el dolor asociado a este ensayo pueda generarse indirectamente a través de la estimulación de las neuronas nociceptivas periféricas por mediadores endógenos como la serotonina, la histamina, la bradiquinina y las prostaglandinas . Sin embargo, este método químico tiene una buena sensibilidad pero una escasa especificidad, lo que permite una interpretación errónea de los resultados, ya que se trata de un estímulo inespecífico de la nocicepción, sensible a fármacos con mecanismos diferentes. Este problema puede evitarse mediante la complementación con otros modelos de nocicepción.

La prueba de la formalina se considera un modelo de dolor persistente producido en 2 fases. La primera fase (0-5 min) se caracteriza por el dolor neurogénico y la segunda (15-30 min) por el dolor inflamatorio . En esta prueba, el tiempo de lamido para el THME a dosis de 300 y 500 mg/kg fue significativamente más corto que en el grupo de control en la primera fase, mientras que en la segunda el THME mostró un efecto antinociceptivo sólo a una dosis de 500 mg/kg. El efecto antinociceptivo en la segunda fase está relacionado con estudios anteriores en los que el THME mostró actividad antiinflamatoria sólo a una dosis de 500 mg/kg. El dolor en la fase temprana fue causado predominantemente por la activación de las fibras C, mientras que en la fase tardía intervino una combinación de reacción inflamatoria en el tejido periférico y cambios funcionales en el cuerno dorsal de la médula espinal. Los fármacos de acción central inhiben ambas fases del dolor, mientras que los de acción periférica inhiben principalmente la segunda fase . Estos resultados sugieren que la actividad antinociceptiva del THME en la prueba de formalina podría atribuirse a la acción de mediadores tanto neurogénicos como antiinflamatorios.

En la prueba del movimiento de la cola, la estimulación térmica activó los nociceptores periféricos, lo que condujo a la retirada reflexiva de la cola. El aumento del tiempo de reacción se considera generalmente un parámetro importante para evaluar la actividad antinociceptiva central, como se ha informado anteriormente. El hallazgo de la flick de la cola podría deberse a un arco reflex en la médula espinal que fue modulado a través de un mecanismo de vía descendente . El efecto antinociceptivo observado de la THME (300 y 500 mg/kg, p.o.) en la prueba de sacudida de la cola confirmó su actividad central. En la prueba de la placa caliente, un reflejo predominantemente supraespinal reveló un efecto antinociceptivo de acción central del THME. La placa, calentada a una temperatura constante, produjo 2 componentes conductuales, es decir, lamer la pata y saltar, medidos por los tiempos de reacción, que podrían deberse a respuestas integradas supraespinalmente . Estos resultados revelan que el THME (300 y 500 mg/kg, p.o.) indujo efectos antinociceptivos centrales porque aumentó significativamente el tiempo de latencia en este modelo, confirmando así su actividad central.

Varios estudios fitoquímicos han revelado que los extractos de las especies de Tabebuia contienen una gran diversidad de metabolitos secundarios como taninos, flavonoides, quinonas, alcaloides, naftoquinonas e iridoides . En cuanto al THME, un análisis fitoquímico preliminar reveló la presencia de taninos, alcaloides y compuestos fenólicos que han demostrado tener diversas acciones biológicas, entre ellas actividades antinociceptivas y antiinflamatorias, por lo que los efectos antinociceptivos observados con el THME podrían atribuirse a la presencia de esos compuestos. Sin embargo, se necesitan más investigaciones para identificar los componentes bioactivos y determinar el mecanismo de acción por el que estos compuestos ejercen sus propiedades antinociceptivas.

Conclusiones

Este estudio demostró la actividad antinociceptiva del extracto de metanol de tallos de T. hypoleuca utilizando varios modelos (químicos y térmicos) de nocicepción en ratones, indicando así que esta especie tiene efectos antinociceptivos mediados central y periféricamente.

Agradecimientos

Los autores agradecen el apoyo técnico ofrecido por Rafael Lorenzo y Damileysi Castro de la División de Desarrollo Biofarmacéutico del CENSA. Los autores también desean agradecer al Dr. Eduardo Sistachs por su ayuda en la revisión del idioma.

Declaración de divulgación

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

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