ADAR

Reconocimiento de la enzima-sustrato

Se sabe poco sobre cómo las ADARs interactúan con sus sustratos específicos y cómo los dominios de unión al ARN y el dominio catalítico trabajan juntos durante la reacción de edición. A diferencia de la maquinaria de edición de ARN de C a U, que emplea un motivo de secuencia primaria cerca del sitio de edición como determinante crítico para el reconocimiento del sustrato (Niswender, 1998), las enzimas ADAR carecen de cualquier especificidad de secuencia intrínseca aparente. De hecho, cuando se les presentan moléculas de ARN completamente de doble cadena, tanto ADAR1 como ADAR2 desaminarán de forma casi promiscua hasta el 50-60% de todas las adenosinas de la secuencia (Nishikura, 2010). Sin embargo, la presencia de bucles, desajustes y protuberancias dentro de la estructura de un sustrato de ARN aumenta la selectividad del sitio y, como se ha visto para algunas dianas fisiológicas de ADAR, el intrincado pliegue de ARN de dicho sustrato parece restringir el acceso para la unión en el ARN y la catálisis productiva a menudo a una sola adenosina (Nishikura, 2010). Por lo tanto, la mayor parte de la especificidad de la edición de A a I puede residir en el pliegue tridimensional del sustrato. Sin embargo, recientes estudios estructurales basados en RMN de los dominios de unión a ARN de la proteína ADAR en complejo con sustratos de ARN mínimos indican que los dominios individuales de unión a ARNds también pueden estar implicados en contactos específicos de secuencia que podrían contribuir a la selectividad para ciertas dianas de ARN sobre otras (Stefl et al, 2006, 2011).

Otra propiedad de las ADARs que puede tener implicaciones en el reconocimiento e interacción de sustratos es la constatación de que para una desaminación productiva y de alta actividad, las proteínas ADAR forman un dímero sobre el sustrato (Jaikaran et al., 2002; Cho et al., 2003; Gallo et al., 2003; Poulsen et al., 2006). Potencialmente, se pueden formar homo- y heterodímeros entre las proteínas ADAR (Chilibeck et al., 2006) y, por tanto, representan otra capa de regulación que influye en el reconocimiento específico del sustrato, así como en la actividad de edición del ARN. Dado que hasta la fecha no se conoce ninguna diana de edición para ADAR3 y que esta proteína no muestra ninguna actividad enzimática en los ensayos estándar de deaminasa (Melcher et al., 1996a; Chen et al., 2000), se ha sugerido que su papel es de naturaleza reguladora a través de la heterodimerización con las otras ADARs.

Relacionado con la formación de dímeros ADAR para la actividad de edición general es la observación de que ciertos eventos de edición de ARN que ocurren dentro del mismo sustrato muestran un acoplamiento positivo o negativo. Por ejemplo, las adenosinas directamente vecinas entre sí o las que están situadas en el mismo lado de la estructura del dúplex de ARN (a unos 11 nt de distancia dentro de la forma A del ARN) a menudo muestran un acoplamiento en la edición por parte de los ADARs, probablemente debido a su proximidad al sitio catalítico de la enzima en el espacio (Koeris et al., 2005; Enstero et al., 2009).

A pesar de estos conocimientos, actualmente todavía no es posible predecir un sitio de edición de ARN basado en la secuencia primaria del ARN. Esto se debe principalmente a la compleja naturaleza de las estructuras terciarias del ARN y a su comportamiento dinámico. Incluso teniendo en cuenta que los dominios de unión del dsRNA pueden ser capaces de discriminar ciertos motivos de la secuencia primaria sobre otros, pequeñas alteraciones en la secuencia primaria circundante o en la estructura secundaria y terciaria pueden modular o incluso anular los contactos específicos de la secuencia. Como resultado, los intentos de diseñar algoritmos de búsqueda que combinen varias de las características moleculares (incluyendo la probabilidad de emparejamiento de bases, el entorno de la secuencia, la conservación de la secuencia) que se sabe que influyen en la probabilidad o la actividad de edición con el fin de predecir los posibles sitios de edición han dado lugar a largas listas de posiciones candidatas en los ARNm, pero pocos sitios de modificación nuevos, selectivos y de alto nivel han sido validados como objetivos in vivo de buena fe (Clutterbuck et al., 2005; Levanon et al., 2005; Gommans et al., 2008; Sie y Maas, 2009). La dicotomía entre la detección de miles de sitios probables de edición basados en características moleculares en los pre-mRNAs y la escasez de sitios de recodificación de alto nivel sugiere que, o bien los algoritmos de predicción sufren de una alta tasa de falsos positivos y la mayoría de estas posiciones candidatas no son editadas por los ADARs, o bien la detección experimental de la edición de ARN es el problema y para muchos sitios reales de edición se analizan los tejidos equivocados (edición específica del tipo de célula) o se analizan en el momento equivocado (edición regulada). Alternativamente, los niveles de edición in vivo de la mayoría de los sitios son tan pequeños que los métodos de detección actuales no son lo suficientemente sensibles para probar o refutar la edición.