Aislamiento, caracterización y potencial toxicológico de micotoxinas de Alternaria (TeA, AOH y AME) en diferentes especies de Alternaria de varias regiones de la India

Colección y aislamiento de especies de Alternaria

Las partes infectadas, como las hojas, los frutos y los tallos de plantas enfermas de diferentes regiones de la India, se recogieron y llevaron al laboratorio. Las muestras de hojas se esterilizaron en la superficie con una solución de hipoclorito de sodio al 0,5%, se lavaron a fondo con agua destilada estéril (SDW) varias veces y se colocaron en medio de cultivo de agar papa dextrosa (PDA) en placas de Petri durante 3-4 días. Las placas de PDA que contenían trozos de hoja infectados se incubaron a 28 °C durante un fotoperiodo de 12 h de luz/oscuridad durante 6-10 días57. Para evitar la contaminación bacteriana, se complementó el medio con estreptomicina. Los conidios se produjeron monoesporulados para obtener colonias puras, que se colocaron en papel de filtro esterilizado.

Prueba de patogenicidad

Para determinar las especialidades formativas, se realizó un análisis de virulencia de los aislados en cultivares de tomate susceptibles a Alternaria. Se probó la patogenicidad de un total de 60 aislados de Alternaria. Las semillas de tomate se escarificaron en hipoclorito de sodio, se enjuagaron en agua del grifo y se secaron al aire. Las plantas se cultivaron por separado en macetas. Las condiciones fisiológicas, como la temperatura y la humedad para el crecimiento de las plantas, se mantuvieron entre 28 °C y 32 °C y entre el 40 y el 60% de humedad relativa, respectivamente. Se mantuvo una concentración óptima de inóculos (2 × 106 esporas/ml) y se roció en la zona de las hojas. Las plantas objeto del experimento se mantuvieron en cámaras de rocío durante 8 h a 25 °C. Estas plantas fueron monitorizadas regularmente durante 2-3 días para comprobar la gravedad de la infección y el desarrollo de la enfermedad con respecto a la hoja de control que no fue inoculada. Los síntomas comenzaron a ser visibles 1 día después de la inoculación de las esporas. La gravedad de la enfermedad se evaluó desde el primer día de la inoculación hasta los 6 días. Los datos se analizaron estadísticamente mediante el análisis de la varianza (ANOVA) y la prueba de Duncan (P ≤ 0,05).

Extracción de ADN e identificación del patógeno

El patógeno se identificó inicialmente sobre la base de las características morfológicas, incluyendo el tamaño y la forma y la estructura de los conidios, y se confirmó además mediante la amplificación del ITS utilizando los cebadores universales ITS1 (5′-TCCGTAGGAACCTGCGG-3′) e ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) que amplifican las regiones ITS y los genes 5.8S que codifican las especies de hongos. La extracción de ADN se realizó según el método sugerido por Doyle y Doyle58. Se trituró un tapete de micelio liofilizado de 0,5 g en un mortero con 10 ml de tampón de extracción CTAB y se incubó a 65 °C en un baño de agua durante 30 minutos. A continuación, la muestra se mezcló con un volumen igual de cloroformo/alcohol isoamílico enfriado y se mezcló suavemente, seguido de una centrifugación a 10.000 rpm durante 10 minutos a 4 °C. El sobrenadante así obtenido se mezcló con un volumen igual de isopropanol y se dejó durante 2 h a 4 °C. La muestra se centrifugó de nuevo a 10000 rpm durante 10 min a 4 °C. A continuación, el pellet se enjuagó con etanol al 70% y se secó al aire durante 4 h para eliminar los restos de alcohol. La reacción de amplificación del ADNr ITS se realizó en 25 μl de mezcla de reacción que contenía 2,5 μl de tampón de reacción 10X, 5 μl de cada desoxirribonucleótido trifosfato (dNTP), y 1,0 μl de cada uno de los cebadores universales ITS y de la región 5,8 S (ITS1) y del cebador inverso (ITS4), 0,3 μl de ADN-polimerasa Taq, 10-100 ng de ADN y 2,5 μl de MgCl2. El perfil térmico optimizado de la PCR fue la desnaturalización inicial a 95 °C durante 3 minutos, la desnaturalización a 95 °C durante 30 segundos, el recocido a 70 °C durante 30 segundos y la extensión final a 72 °C durante 1 minuto con 40 ciclos adicionales. La amplificación se confirmó en geles de agarosa al 1% en tampón TBE 0,5X, que se ejecutaron en paralelo al marcador de peso molecular de ADN estándar y se visualizaron bajo el transiluminador UV.

Análisis de la secuencia ITS

Las regiones de ADNr ITS obtenidas de los aislados seleccionados se cortaron y purificaron aún más utilizando el kit de purificación de PCR QIAquick (QIAGEN, Alemania), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los productos purificados se enviaron finalmente a SciGenome Cochin, Kerala, India, para su secuenciación. Las secuencias se compararon con las del GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) utilizando el BLAST del NCBI. El análisis BLAST se realizó con secuencias ITS de longitud completa como consultas para revelar las relaciones con las secuencias publicadas. Se anotaron la homología más alta y la puntuación total para el análisis posterior. Las secuencias obtenidas en el presente estudio se enviaron a GenBank. Las secuencias ITS de cepas de Alternaria de otras formas especiales se descargaron de la base de datos del NCBI GenBank y se utilizaron en los análisis filogenéticos como secuencias de referencia. Todas las secuencias de ADN se alinearon con el programa Clustal W incluido en el editor de alineación de secuencias BioEdit59, 60. El archivo de alineación múltiple resultante se utilizó para los análisis filogenéticos que se realizaron con MEGA 5.0 con el método Neighbor-Joining permitiendo 500 réplicas bootstrap61.

La extracción de las toxinas de las especies de Alternaria

Las extracciones de los metabolitos tóxicos se realizaron según el método de Andersen et al.62 con algunas modificaciones. Las extracciones de estas fitotoxinas se llevaron a cabo en medio de caldo de dextrosa de patata (PDB) utilizando cultivos de 20 días de edad. Se cortaron tres tapones de agar (3 mm) del centro de cada colonia de Alternaria y se inocularon en 200 ml de medio PDB. Las colonias del patógeno se cortaron con la ayuda de un sacabocados (5 mm) y luego se inocularon las colonias en el medio PDB. Los cultivos de veinte días se filtraron a través de papel de filtro mediante la máquina de filtrado al vacío. Se añadió un volumen igual de metanol a los filtrados de los cultivos, se mezcló adecuadamente y se mantuvo a 4 °C durante 24 h. A continuación, se precipitó el filtrado y se evaporó el metanol hasta sequedad en un concentrador de vacío rotativo (IKA® RV 10) a 43 °C. Se añadió un volumen igual de acetato de etilo al filtrado extraído y se mezcló adecuadamente en un embudo de separación. Se obtuvieron dos fases, una orgánica y otra acuosa. La capa acuosa se separó y se extrajo con acetato de etilo. El extracto de acetato de etilo se concentró a 44 °C en un evaporador de vacío y se disolvió en metanol.

Purificación y separación de la fitotoxina de Alternaria mediante cromatografía en columna

La purificación y separación de los compuestos se realizó siguiendo la metodología de Devi et al.63 con ligeras modificaciones. La cromatografía en columna (CC) se llevó a cabo en una columna de vidrio (700 mm × 30 mm) y se eligió gel de sílice (tamaño de malla 100-120 Merk) como fase estacionaria. La fase móvil consistía en un disolvente puro o en diferentes disolventes dependiendo de los requisitos de las condiciones. La columna se cargó con el complejo crudo extraído de los aislados de la especie Alternaria. Para la separación de los metabolitos tóxicos, la fase móvil consistió en cloroformo: metanol (80:20 y 95:05), y se utilizó una proporción de benceno: acetona: ácido acético (60:35:05) para separar los compuestos y se siguió un gradiente de elución. Las diferentes fracciones eluidas del CC se separaron mediante cromatografía en capa fina (TLC) y se confirmaron mediante el análisis por HPLC.

El análisis por cromatografía en capa fina (TLC) de las fitotoxinas

Se utilizó la cromatografía en capa fina (TLC) para identificar las diversas fitotoxinas producidas por esporas grandes y pequeñas de las especies de Alternaria identificadas. La TLC se realizó utilizando el método de Andersen et al.64. En este método, se añadieron 4,5 g de gel de sílice G254 (13% CaSO4 ½ H2O como aglutinante) con 25 ml de agua bidestilada y se agitó con una varilla de vidrio hasta que se formó una lechada de gel de sílice. A continuación, la suspensión se aplicó suavemente sobre una placa de vidrio y se colocó en un lugar seguro para que se secara al aire. Se utilizaron diferentes fases móviles para la separación de varias fitotoxinas en la proporción de cloroformo: metanol (80:20; v/v), benceno: acetona: ácido acético (60:35:5; v/v), cloroformo: metanol (95:5; v/v), acetato de etilo: benceno (95:5; v/v). Estas mezclas de disolventes se colocaron en desecadores y se dejaron durante 30 minutos para saturar el ambiente en su interior. Antes de realizar la TLC, las placas de vidrio recubiertas de gel de sílice se cargaron poniéndolas en la estufa a 60 °C durante 10 min. Después de la carga, se mancharon muestras de 5 µl en diferentes puntos a 2 cm de la base. Después de manchar las muestras, las placas de TLC se secaron en un desecador durante unos minutos. Las manchas resultantes se revelaron exponiendo las placas de TLC a cloruro férrico etanólico al 0,2% o se visualizaron bajo luz UV a 365 nm. Las placas de TLC se secaron al aire durante la noche, tras lo cual se calcularon los valores de Rf. Las manchas de los diferentes metabolitos cuyos valores de Rf se encontraron similares a los valores de Rf de los estándares se rasparon, se disolvieron en metanol de grado HPLC y se utilizaron para el análisis HPLC.

Análisis HPLC-UV

Preparación del estándar

TeA (cat No: T1952), AOH (cat No: A4675) y AME (cat No: A4678) se adquirieron de Biogenuix (LKT laboratories, Inc, Nueva Delhi, India) y se utilizaron en forma cristalizada para preparar el estándar. La solución madre (1000 µg ml-1) y una solución de trabajo separada de (10 µg ml-1) de toxinas se prepararon en metanol de grado HPLC y se conservaron a -20 °C para su uso posterior. Estas toxinas se utilizaron como estándares para la calibración por HPLC y para otros experimentos adicionales mediante la dilución de las soluciones de trabajo preparadas.

Condiciones de análisis por HPLC-UV

Para el análisis por HPLC las muestras se separaron cromatográficamente utilizando una base desactivada (250 mm de longitud × 4.6 mm, tamaño de partícula de 5,0 µm) C18 Waters Spherisorb, columna ODS2 (producto nº: PSS831915, EE.UU.) que se conectó a la columna de guarda, al sistema de la serie Waters (Waters, Waters Corporation, Milford, EE.UU.) con detector UV-VIS (2998 PDA) y al controlador del sistema Waters 600E. El detector 2998 PDA se ajustó a 254 nm como longitud de onda de integración. Las muestras se inyectaron utilizando un bucle de 10 μl del automuestreador Waters 717plus (Waters Corporation, Milford, EE.UU.). La columna y la columna de guarda se controlaron termostáticamente a 28 °C. El caudal fue de 0,70 ml/min y la fase móvil consistió en un 75% de metanol de grado HPLC (disolvente A), un 25% de una solución acuosa (disolvente B) de tampón fosfato 0,1 M añadida 900 ml DW para 1 litro y un pH de 5,8 mantenido mediante ácido fosfórico. El instrumento se ejecutó en modo isocrático lineal y la detección se controló en el rango de 200-400 nm. La fiabilidad del método de HPLC para el análisis de AME, TeA y AOH se validó mediante el límite de detección (LOD) y el límite de cuantificación (LOQ).

Análisis de LC-MS/MS

Para una mayor confirmación de las toxinas de Alternaria (AME, AOH y TeA), se ha llevado a cabo un método de cromatografía – espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) con ligeras modificaciones de Tölgyesi et al.65. El método implica una extracción sólido-líquido con metanol y una posterior derivatización para TeA, AOH y AME. A continuación, las muestras se purificaron con extracción en fase sólida en cartuchos de base polimérica y, finalmente, las toxinas se separaron por LC-MS/MS. Para el análisis LC-MS/MS, las muestras se prepararon en un proceso por etapas.

Reactivos, disolventes y preparación del estándar

Los calibrantes analíticos secos de AME, AOH y TeA se compraron a Biogenuix (LKT laboratories, Inc., Nueva Delhi, India). Los estándares se reconstituyeron con 1,0 ml de metanol para obtener soluciones madre de 0,1 mg ml-1. Todas las soluciones madre se conservaron a 4 °C. La 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH) y el undecanal se compraron a Sigma-Aldrich. El reactivo de derivación (DNPH al 0,58% en solución de HCl) se preparó según lo descrito por Siegel et al.7. El reactivo de parada fue undecanal al 5% (v/v) en metanol. Las soluciones estándar derivadas de TeA, AOH y AME (1,91 μg/ml, 2,54 μg/ml y 2,71 μg/ml de metanol, respectivamente) se prepararon mezclando 1 ml de las soluciones metanólicas de 10 μg/ml de TeA, AOH y AME con 1 ml de solución de DNPH. La mezcla se dejó toda la noche y se procesó como se ha escrito en las secciones de extracción de la muestra y limpieza de la SPE. El volumen final se ajustó a 10 ml con metanol. Estas soluciones se utilizaron para optimizar las condiciones de LC-MS/MS para el análisis. Se preparó un tampón de formiato de amonio de 50 mM en agua y se ajustó su pH a 3,0 con ácido fórmico. El metanol y el acetonitrilo eran de grado LC-MS obtenidos de Sigma-Aldrich. El acetato de etilo, el n-hexano, el diclorometano, el ácido fórmico y el formiato de amonio eran de grado HPLC y se compraron a Merck (Darmstadt, Alemania). La columna Kinetex C-18 UPLC LG 500 (3 × 100 mm, 2,6 μm), los cartuchos Strata SPE (6 ml, 200 mg) y los filtros de jeringa de celulosa regenerada (RC) (15 mm, 0,45 μm) se obtuvieron de Phenomenex (Utrecht, Países Bajos). Las columnas de HPLC Supelco Ascentis Express C-18, ciano (ES-CN) y fenil-hexilo (2,1 × 100 mm, 2,7 μm) se compraron a Sigma- Aldrich. Las muestras de toxinas estándar, utilizadas para el desarrollo del método, se compraron a Biogenuix (LKT laboratories, Inc., Nueva Delhi, India). Las muestras se almacenaron a -20 °C hasta su análisis.

Extracción de muestras

Las muestras de extracción de metabolitos crudos se purificaron por el método de cromatografía en columna y la fracción se eluyó y disolvió en metanol. Se mezclaron 50 ml de muestra de cada fracción en tubos de centrífuga de polipropileno (PP) de 50 ml que luego se sellaron. Las muestras se mezclaron en vórtex durante 5 segundos y se agitaron horizontalmente en un agitador CAT S50 a una velocidad de 600 min-1 durante 45 minutos a temperatura ambiente. A continuación, los tubos se centrifugaron a 5.000 rpm durante 10 min a 20 °C y la capa superior se recogió en un nuevo tubo de centrífuga de PP de 50 ml. Se añadieron 100 μl de reactivo de derivatización (0,596% de DNPH en 2 mol/lit de HCl) a la muestra y se mezcló en vórtex durante 5 s. La muestra se dejó derivatizar durante 1 h a temperatura ambiente. Después, se añadieron 500 μl de reactivo de parada 5% (v/v) de undecanal en metanol y se mezcló en vórtex durante 5 segundos. La muestra se dejó reposar durante 30 min y luego se diluyó en el tubo de PP hasta 35 ml con tampón de formiato de amonio 50 mM (pH 4, ajustado con ácido fórmico). La muestra se centrifuga a 5.000 rpm durante 10 min a 20 °C y se somete a una limpieza de extracción en fase sólida.

Limpieza de extracción en fase sólida (SPE)

Los cartuchos Strata-XL (200 mg, 6 ml, 100 μm) se acondicionaron con 6 ml de metanol seguidos de 6 ml de agua y 6 ml de tampón de formiato 50 mM. Se conectaron depósitos de 75 ml a los cartuchos y se cargaron las muestras en los depósitos. A continuación, las muestras se pasaron gota a gota. A continuación, las columnas SPE se lavaron con 6 ml de metanol-agua (15/85, v/v) y, posteriormente, con 6 ml de n-hexano. Los cartuchos se secaron al vacío durante 5 minutos antes de eluir las muestras en tubos de vidrio con 5 ml de metanol. Las muestras se evaporaron hasta sequedad a 45 °C bajo una suave corriente de nitrógeno y se volvieron a disolver en 250 μl de metanol mezclando en vórtex durante 20 segundos. Como paso final, las muestras se filtraron a través de filtros de celulosa regenerada en viales de HPLC.

Instrumentación y equipo

El desarrollo del método se llevó a cabo utilizando un sistema Ascentis Express C-18 (2,1 × 100 mm, 2.7 μm) UPLC LG 500 nm (Accucore RP-MS 100 × 3,0 MM, 2,6UM, ACQ-TQD-QBB1152, detector Waters acuity PDA, Waters Corporation, Milford, MA, USA) acoplado a un detector MS de triple cuadrupolo MassLynx (Waters, Milford, MA, USA). La adquisición y evaluación de datos se realizó con la versión 4.0 de MassLynx. El método final también se transfirió a un sistema LC-MS/MS Thermo ACQ-TQD Quantum Ultra (Thermo Finnigan, San José, CA, EE.UU.) que incluía una bomba binaria Waters acquity QSM (SN- L10QSM943A), un automuestreador Waters acquity fin (SN-M10SDI443M), un termostato de columna y un detector MS de triple cuadrupolo TQD Quantum Ultra. La temperatura de la columna y la temperatura de la muestra eran de 30 °C y 10 °C, respectivamente. La adquisición y evaluación de los datos se realizó con el software Xcalibur 2.0.7. SP1. Ambos sistemas estaban equipados con una interfaz de electrospray (ESI) en la que sólo se utilizó la ionización negativa durante la adquisición. Se utilizó nitrógeno como gas de secado y de colisión. Los parámetros de la fuente de iones se resumen en la Tabla Suplementaria S2. Además, se investigó la transferibilidad del método con un sistema LC-MS/MS que consistía en un HPLC Agilent 1100 acoplado a un MS de triple cuadrupolo AB Sciex 4000 (Framingham, MA, EE.UU.).

Condiciones del instrumento

Las toxinas de Alternaria se separan en una columna UPLC Ascentis Express C-18 (2,1 × 100 mm, 2,7 μm) equipada con una precolumna C-18 de 2,1 mm utilizando elución de gradiente lineal. Se mezclaron cuatro disolventes (disolventes A, B, C y D) mediante la bomba binaria. El disolvente A contenía acetonitrilo (ACN) + agua (5:95), el disolvente B contenía ACN: 5% de alcohol isopropílico (IPA), el disolvente C contenía 100% de metanol y el disolvente D contenía acetato de amonio puro. La velocidad de flujo fue de 0,5 ml/min. La fase móvil de los disolventes en el tiempo inicial era 0,0% A, 30% B, 30% C y 40% D. En el tiempo final (5 min) los disolventes eran 0,0% A, 30% B, 30% C y 40% D. Fue necesario un paso de lavado suficiente en el programa de gradiente para eliminar los solutos lipofílicos acumulados de la matriz. El tiempo total de análisis fue de 5 minutos. El termostato de la columna mantuvo la temperatura a 30 °C con un volumen de inyección de 1,0 μl. El automuestreador se operó a 20 °C.

El sistema UPLC LG 500 nm se acopló a un detector MS/MS (Micromass Quattro Ultima PT) a través de una interfaz de electrospray (ESI) que opera en modo negativo. Los ajustes optimizados de la ESI fueron los siguientes: temperatura de la fuente 120 °C, temperatura de desolvatación 350 °C, flujo de gas de secado 650 L/Hr, flujo de gas del cono 30 L/Hr y voltaje del capilar 3,50 kV. Se utilizó nitrógeno como gas de secado y de colisión (2,67 × 10-6 bar). Se aplicó el modo de reacción de monitorización múltiple (MRM) en el MS durante la detección y se escanearon dos transiciones iónicas para cada toxina objetivo. El modo MRM se aplicó en el detector MS/MS y se registraron dos transiciones iónicas (cuantificadora y calificadora) para cada compuesto objetivo. Las transiciones iónicas seleccionadas con los voltajes optimizados (cono o lente de tubo), las energías de colisión (CE) y los tiempos de permanencia se resumen en la tabla (Tabla Suplementaria S2).

Evaluación del potencial toxicológico de diferentes micotoxinas de Alternaria (TeA, AOH y AME)

La medición de la extensión de la muerte celular inducida por diferentes micotoxinas se determinó mediante el método de inoculación de hojas desprendidas. Para ello, se desprendieron muestras de hojas frescas de las plantas cultivadas en invernadero y se lavaron adecuadamente durante 3-4 minutos en agua corriente del grifo, se esterilizaron en hipoclorito de sodio al 1,0% (0,01 g/ml) durante aproximadamente 1 minuto y, a continuación, se limpiaron superficialmente con etanol al 70% y, por último, se enjuagaron asépticamente a fondo con agua destilada estéril. Por último, las hojas se colocaron en papel de filtro humedecido y se pincharon con una aguja estéril en la superficie inferior. Las toxinas se disolvieron en agua desionizada estéril a una concentración de 100 μg/ml. Se inyectaron gotas (100 µl) de cada una de las tres toxinas en las hojas heridas con una aguja fina (Dispovan, 1 ml). Se ajustó una muestra de control inyectando agua destilada estéril. Las muestras de hojas tratadas se mantuvieron dentro de una cámara húmeda (27 ± 0,5 °C de temperatura y 60% de humedad relativa) en condiciones de invernadero (ciclo de 14 h de luz y 10 h de oscuridad a 27 °C). Se realizó una observación periódica (cada 24 h durante 6 días) para averiguar cualquier cambio relevante para los efectos toxicológicos desarrollados en las muestras inyectadas con respecto a las muestras de control. El montaje experimental se mantuvo en tres réplicas y el porcentaje de área foliar afectada debido a la muerte celular inducida por el tóxico se midió con el medidor de área foliar Systronic 211 y se calculó mediante la fórmula que se indica a continuación.

Determinación de la muerte celular mediante el ensayo de captación de azul de Evans

La pérdida de viabilidad celular (muerte celular) se evaluó mediante el método de tinción con azul de Evans (Baker y Mock, 1994). Las hojas de tomate se trataron con la misma concentración (250 μg/ml) de las tres toxinas. Las hojas tratadas se tiñeron con una solución acuosa de azul de Evans al 0,25% (v/v) durante 15 minutos. Después de lavarlas con agua destilada durante 30 minutos, se extirparon las hojas y se empaparon con 500 µl de N, N-dimetilformamida durante 1 hora a temperatura ambiente. La densidad óptica del azul de Evans liberado se midió espectrofotométricamente a 600 nm.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó utilizando el software IBM SPSS Statistics ver. 20 mediante el análisis de la varianza (ANOVA de una vía) seguido de la prueba de rangos múltiples de Duncan al nivel de significación P ≤ 0,05. Los datos se expresaron como media ± desviación estándar (DE) de al menos tres réplicas de cada metabolito. Los análisis estadísticos de los datos se analizaron en 48 aislados seleccionados de especies de Alternaria de carácter patógeno.