Alcaloides de aporfina de Ocotea macrophylla (Lauraceae)
ARTIGO
Alcaloides de aporfina de Ocotea macrophylla (Lauraceae)
Ludy Cristina Pabon*; Luis Enrique Cuca
Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Bogotá, KR 30 45 03, Colombia. AA 14490
ABSTRACT
Cuatro alcaloides de aporfina de la madera de Ocotea macrophylla (Lauraceae) fueron aislados y caracterizados como (S)-3-metoxi-nordomesticina (1), (S)-N-etoxicarbonil-3-metoxi-nordomesticina (2), (S)-N-formil-3-metoxi-nordomesticina (3) y (S)-N-metoxicarbonil-3-metoxi-nordomesticina (4); Los alcaloides 2-4 se presentan por primera vez. La estructura de los compuestos aislados se determinó a partir de sus datos espectrales y por comparación de los mismos con los valores descritos en la literatura. La fracción alcaloide y el compuesto 1 mostraron actividad antifúngica frente a Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici y también el compuesto 1 mostró actividad antimicrobiana frente a Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis también.
Palabras clave: Ocotea macrophylla; alcaloides de aporfina; Lauraceae.
INTRODUCCIÓN
El género Ocotea (Lauraceae) incluye más de 350 especies que se encuentran en el continente americano y en el sur de África.1,2 En Colombia, existen 35 especies de Ocotea distribuidas por todo el país, principalmente en los bosques andinos.3 En la medicina tradicional, algunas especies de Ocotea muestran diferentes aplicaciones. O. quixos se utiliza como desinfectante, anestésico local y antidiarreico.4 O. lancifolia se utiliza como antiparasitario, y O. caparrapi se utiliza para tratar picaduras de insectos, mordeduras de serpientes, bronquitis y tumores cancerosos.5,6
Químicamente, el género Ocotea es conocido principalmente como fuente de metabolitos del tipo furofurano7 y lignanos de tetrahidrofurano,8 ciclooctano9 y neolignanos de benzofurano,10 y alcaloides de bencilisoquinolina11 y aporfina.5 En estudios anteriores, se aislaron cuatro alcaloides de aporfina de la madera de Ocotea macrophylla y se identificaron como nantenina, glaucina, isocorydina y dehydronantenina.12,13 En este trabajo, describimos el aislamiento y la determinación estructural de tres nuevos alcaloides de aporfina 2-4 además de (S)- 3-metoxi-nordomesticina 1 y los informes de actividades antibacterianas y antifúngicas de los compuestos.
RESULTADO Y DISCUSIÓN
El extracto etanólico del tallo de O. macrophylla se sometió a una extracción ácido-base para obtener una fracción alcaloidal, que se sometió además a un fraccionamiento y purificación por métodos cromatográficos que condujeron al aislamiento de cuatro alcaloides: (S)-3-metoxi-nordomesticina (1), (S)-N-etoxicarbonil-3-metoxi-nordomesticina (2), (S)-N-formil-3-metoxi-nordomesticina (3) y (S)-N-metoxicarbonil-3-metoxi-nordomesticina (4). Las estructuras de los alcaloides 1-4 se muestran en la Figura 1 y los datos espectroscópicos en la Tabla 1.
La señal en δH 6,30 (1H, s) no mostró conectividad en el experimento de HMQC, lo que indica la presencia de un grupo OH fenólico, apoyado por el IR. El análisis del espectro HMBC permitió la localización de los sustituyentes, según las correlaciones observadas entre las señales a δH 5,94 y 5,95 (para el grupo metilendioxi) con las señales a δC 145,9 (C-9) y 1462 (C-10), y estas dos últimas señales con los protones a δH 6,70 (H-8) y 7,90 (H-11), respectivamente, lo que sugiere la presencia de un grupo metilendioxi en las posiciones 9 y 10 y dos hidrógenos en el anillo aromático en orientación para. La presencia del grupo hidroxilo en la posición 1 se determinó mediante correlaciones entre las señales de δH 6,30 y δC 116,5, asignadas a C-11b. La localización de los grupos metoxilo en las posiciones C-2 y C-3, se asignó según la correlación de los hidrógenos en δH 3,96 y 3,86 con los carbonos en δC 138,4 (C-2) y δC 147,8 (C-3), respectivamente.
La configuración absoluta de C-6a se asignó como S, porque tiene un efecto Cotton negativo a 280 nm y un efecto Cotton positivo a 240 nm en la curva CD.17 Además, esto se confirmó por el valor positivo de la rotación óptica 25D = +51,7 (c 0,38, CHCl3).18 Por lo tanto, el alcaloide 1 se determinó como (S)-3-metoxi-nordomesticina, un alcaloide de aporfina reportado previamente de Nectandra sinuata19 también perteneciente a la familia Lauraceae. Este informe corrige y completa los datos espectroscópicos de este compuesto.
El alcaloide 2 se obtuvo como un aceite amarillo que da una reacción positiva al reactivo de Dragendorff y su valor de rotación óptica fue 25D 25D = +33,3 (c 0,60, CHCl3). El espectro UV e IR de 2 fueron similares a los de 1, excepto por la aparición, en ambos espectros, de absorciones debidas a un grupo carbamato a 282 nm y a 1688 cm-1, respectivamente.20 Los espectros de RMN de 1H y 13C mostraron un perfil similar al de 1. En la RMN de 1H aparecieron dos nuevas señales a δH 4,29 (2H, m) y 1,29 (3H, m), así como el desplazamiento de la señal H-5, debido a la presencia de un grupo desprotector en proximidad. El experimento COSY mostró la correlación de las señales δH 4,29 y 1,29, lo que indica la presencia de un grupo etilo que, debido a su desplazamiento, sugiere estar unido a un heteroátomo. Los espectros de RMN 13C y DEPT mostraron la aparición de tres nuevas señales a δC 158,8 (C), 61,0 (CH2) y 14,8 (CH3), señales típicas de un grupo etoxicarbonilo unido a un átomo de nitrógeno. La configuración absoluta de C-6a se determinó como S, porque mostraba los mismos efectos de algodón que 1. Por lo tanto, el compuesto alcaloide 2 se identificó como (S)-N-etoxicarbonilo-3-metoxi-nordomesticina. Su espectro ESIMS dio un pico de iones pseudomoleculares a m/z 414 + correspondiente a la fórmula molecular de C22H22NO7, y las fragmentaciones se debieron a la pérdida de CH3OH y CH3CH2OH a m/z 382 + y m/z 368 +, respectivamente. El espectro ESI en modo de iones negativos mostró picos a m/z 412 – y m/z 383 ., siendo este último la pérdida de un grupo etilo. Este tipo de alcaloides con sustituyentes N-etoxicarbonilo han sido aislados de Lindera angustifolia (Lauraceae).21
El alcaloide 3, se obtuvo como un aceite amarillo, con un valor de rotación óptica de 25D 25D = +7,5 (c 0,53 CHCl3). El espectro IR fue similar al de los alcaloides 1 y 2. Además, se observó la presencia de absorciones en 2830, 2700, 1739 cm-1, características del grupo formilo. En el modo negativo de HRESIMS se observó el ion pseudomolecular – a m/z 369,1133, correspondiente a la fórmula molecular de C20H20NO6. En el modo de iones negativos de los espectros ESI-MS se observó la pérdida de un grupo formilo a m/z 339. El perfil de RMN fue similar al de los alcaloides 1 y 2. En la RMN de 1H aparecieron diferentes señales pertenecientes a una mezcla de dos isómeros en proporción 3:1. La comparación del isómero mayor con el alcaloide 1 en RMN, mostró el mismo patrón de sustitución del anillo aromático, además de la aparición de dos nuevas señales a δH 8,25 (1H, s) en el 1H y a δC 161,9 en el 13C del grupo formilo a 3. Esta funcionalidad sobre el nitrógeno condujo a la formación de isómeros rotacionales, que han sido descritos previamente para alcaloides con un grupo N-formilo y N-acetilo.22 La configuración absoluta se determinó como S, de la misma manera que para 1 y 2. Por lo tanto, este alcaloide 3 se identificó como (S)-N-formil-3-metoxi-nordomesticina.
El alcaloide 4 se obtuvo como un sólido blanco con un punto de fusión de 222-223 ºC (MeOH), y con una rotación óptica de 25D 25D = +47,0 (c 0,55 CHCl3). El análisis de los datos de RMN de 4 reveló que tiene el mismo esqueleto básico que 2, pero tiene un éster metílico según las señales de δH 3,76 (3H, s) y δC 52,6 para 4 en lugar de las señales para el grupo etilo en 2. HRESIMS mostró un ion pseudomolecular – a m/z 398,1233 correspondiente a la fórmula molecular C22H22NO7. Por lo tanto, el alcaloide 4 se identificó como (S)-N-metoxicarbonil-3-metoxi-nordomesticina.
La actividad antifúngica se evaluó mediante el método de difusión en disco contra Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici,23 un hongo fitopatógeno que afecta a los cultivos de tomate, causando enormes pérdidas a los agricultores. La fracción alcaloide fue activa contra F. oxysporum a 250 μg/μL. La actividad inhibitoria contra el crecimiento del hongo fue moderada a 5 μg/μL para (S)-3-metoxi-nordomesticina 1, mientras que los demás alcaloides fueron ineficaces, lo que sugiere que la presencia de sustituyentes retiradores de electrones en el átomo de nitrógeno disminuye la actividad antifúngica.
Aunque son pocos los informes de evaluación de la actividad antifúngica de las aporfinas, se ha encontrado que éstas son activas contra especies como Candida albicans,24,25 pero inactivas contra hongos patógenos como Cladosporium herbarium.26 Estos resultados constituyen un nuevo informe de evaluación de la actividad antifúngica de estos alcaloides, donde se destaca que el tipo de sustituyentes sobre el nitrógeno de las aporfinas tiene un efecto sobre la actividad antifúngica que presentan.
La actividad antibacteriana fue evaluada por el método de difusión radial reportado por Lerhrer27 contra dos cepas estándar Gram (+): Staphylococcus aureus 6538 y Enterococcus faecalis 29212 y tres Gram (-): Escherichia coli 25922 y Salmonella tiphymurium, cepas MS7953 y 14028s. El alcaloide 1 (2,5 μg) mostró actividad antimicrobiana frente a las dos bacterias Gram positivas evaluadas con valores de 30 UA como se muestra en la Tabla 2.
Se ha informado para la mezcla racémica del compuesto 3-metoxi-nordomesticina, su actividad frente a E. coli (MIC= 256 μg/mL) y S. aureus (MIC= 512 μg/mL),28 sin embargo en este caso el compuesto 1 no es activo frente a E. coli.
Al igual que en la actividad antifúngica, los resultados muestran que la naturaleza del sustituyente sobre el nitrógeno influye en la actividad antibacteriana (Tabla 2).
EXPERIMENTAL
Procedimientos generales
El punto de fusión se determinó utilizando el dispositivo de laboratorio Mel-temp Fisher Johns. Los espectros UV se registraron en un Perkin Elmer Lambda 2S y los espectros CD en un espectrómetro JASCO J-720. Los espectros IR se obtuvieron en un Perkin Elmer FT-IR Panagon 500 series 1000 como película fina. Las rotaciones ópticas se registraron en el polarímetro Schmidt-Haensch. Los espectros de RMN de 1H (400 MHz) y 13C (100 MHz), así como los espectros 2D (COSY, HMQC y HMBC) se realizaron en un espectrómetro Bruker Avance 400 MHz utilizando CDCl3 como referencia interna. Los HRMS se determinaron en un sistema de espectrómetro de masas Shimadzu LCMS-IT-TOF con ESI en modo de iones positivos y en modo de iones negativos. La cromatografía en columna (CC) se llevó a cabo con gel de sílice (malla 70-230 y 230-400, Merck), y la cromatografía analítica se realizó con gel de sílice 60 PF254 (0,25 mm).
Material vegetal
Los tallos de O. macrophylla fueron recogidos en julio de 2006 en Nocaima, Colombia, por W. Delgado. El espécimen botánico fue identificado por A. Jara, y un espécimen voucher (COL-517191), y fue depositado en el Herbario Nacional Colombiano de la Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, Colombia.
Extracción y aislamiento
Los tallos secos y potenciados (2,0 kg) de Ocotea macrophylla fueron extraídos con EtOH por maceración a temperatura ambiente y concentrados al vacío para obtener un extracto (102,6 g). Una muestra (48,9 g) de este extracto se solubilizó en agua mediante ultrasonidos y se acidificó con HCl al 5% hasta alcanzar un pH de 2,0. La suspensión ácida se filtró y se basificó con NaOH al 20% hasta alcanzar un pH de 8,0, y se extrajo sucesivamente con cloroformo. La fracción de cloroformo (3,01 g) se sometió a cromatografía en columna con gel de sílice y se eluyó con un gradiente de éter de petróleo:AcOiPr (4:6 a 0:10) y AcOiPr:MeOH (10:0 a 0:10), obteniéndose cuatro fracciones (I-IV). La fracción I (347 mg) se cromatografió repetidamente por columna (CC) sobre gel de sílice y se eluyó con n-hexano:AcOiPr (9:1-8:2), CHCl3 y Tol:AcOiPr 7:3. Se obtuvieron los alcaloides 1 (7 mg) y 2 (4 mg). La fracción II (250 mg) se sometió a cromatografía en columna sobre gel de sílice y se eluyó con CHCl3:AcOEt (85:15), luego se sometió a CC sobre Sephadex LH-20 (CH3OH) para producir el alcaloide 3 (8 mg). La fracción IV (1433 mg) se purificó mediante cromatografía en columna repetida sobre gel de sílice utilizando CH2Cl2:MeOH 97:3 y CH2Cl2 como sistemas de elución. Finalmente, los lavados sucesivos con MeOH produjeron el alcaloide 4 (98 mg).
Ensayo antifúngico
F. oxysporum se obtuvo de la colección de cultivos de la Universidad de Cundinamarca (Departamento de Agronomía, Laboratorio de Fitopatología). Se utilizó PDA como medio para los ensayos de actividad antifúngica. El medio de cultivo se inoculó con 100 μL de una solución de 105 esporas. Las muestras se prepararon en soluciones de diferentes concentraciones, correspondientes a 50, 25 y 10 μg/μL de la fracción alcaloide y 5, 2,5 1,0, 0,5, 0,2 y 0,1 μg/μL de los alcaloides puros. Se aplicaron diez microlitros de muestras en los discos de papel de filtro y se colocaron en el medio inoculado. Las placas se sellaron y se dejaron en una incubadora durante 3 días a 25 °C. Las zonas claras que aparecían contra un hongo en crecimiento indicaban la cantidad mínima de fracción o alcaloide necesaria para inhibir el crecimiento del hongo. Se hicieron tres réplicas para cada tratamiento. El benomilo (benzimidazol – 5 μg) se utilizó como control positivo, y la acetona sirvió como control negativo.23
Ensayos antibacterianos
La actividad antibacteriana se evaluó mediante el método de difusión radial adaptado de la metodología publicada previamente por Lehrer.27 Los compuestos se evaluaron contra dos cepas Gram (+): Staphylococcus aureus ATCC 6538 y Streptococcus fecalis ATCC 29212 y tres cepas Gram (-): Escherichia coli ATCC 25922 y Salmonella tiphymurium, ATCC 14028s y Salmonella tiphymurium MS7953. Una colonia aislada de cada cepa, se depositó en 3 mL de tripticasa de soja (TSB) para las cepas Gram (+) y de Caldo Luria (LB) para las cepas Gram (-), y se incubaron a 37 °C con agitación, hasta que los microorganismos estuvieran en fase logarítmica. Se eliminó el sobrenadante y el sedimento obtenido se resuspendió en tampón fosfato (PBS), seguido de lavados con PBS y centrifugado. Finalmente el sedimento se resuspendió en PBS y se determinó la densidad óptica en 620 nm para calcular el número de UFC (unidades formadoras de colonias) por mililitro. Se dispersa un determinado volumen que contiene 4 x 107 UFC en cada plato. El volumen medido se mezcló y homogeneizó en 15 mL de agarosa fundida a más o menos 45 °C. Esta suspensión bacteriana se sirvió en placas de Petri y se dejó solidificar a temperatura ambiente, tras lo cual se hicieron agujeros de 2 mm de diámetro con un punzón estéril.
Las muestras de ensayo se prepararon disolviendo 1 mg del compuesto puro en 500 μL de DMSO, en los que se colocaron 8 μL de la muestra por duplicado y se incubaron a 37 °C durante 30 min. Después de este tiempo se añadió el medio nutritivo, que contiene agar fundido y TSB, se incubó durante 18 h a 37 ºC y luego se midió el diámetro de las zonas de inhibición por la actividad del compuesto. Los controles positivos utilizados fueron diferentes antibióticos, Ampicilina (50 mg/mL), Kanamicina (10 mg/mL) y Tetraciclina (4,12 mg/mL) a una dilución 1:100 en PBS y se utilizaron como controles negativos DMSO y PBS, sirviendo cada control 8 μL por cada pocillo. Los diámetros de las zonas de inhibición se midieron en milímetros y los resultados se reportaron como unidades de actividad según la relación que estipula que 1 Unidad de Acción (UA) es igual a 0,1 mm de la zona de inhibición.
Material Complementario
Reconocimientos
Los autores agradecen a la Universidad Nacional de Colombia por el apoyo financiero para este proyecto. Así mismo, se agradece al Laboratorio de Resonancia Magnética Nuclear y al Laboratorio de Espectrometría de Masas por su apoyo en el registro de los espectros de RMN y de HR-ESI-MS, respectivamente. Además, los autores desean agradecer a la Universidad Javeriana por las rotaciones ópticas, a la FIDIC (Fundación Instituto de Inmunología de Colombia) por el registro de los espectros de CD y especialmente al Prof. J. M. Lozano por los ensayos de actividad antibacteriana.
1. Takaku, S.; Haber. W.; Setzer, W.; Biochem. Syst. Ecol. 2007, 35, 525.
2. Guerrini, A.; Sacchetti, G.; Muzzolli, M.; Moreno, G.; Medici, A.; Besco, E.; Bruni R.; J. Agric. Food Chem. 2006, 54 , 7778.
4. Ballabeni, V.; Tognoli, M.; Bertoni, S.; Bruni, R.; Guerrini, A.; Moreno, G.; Barocelli, E.; Pharmacol. Res. 2007, 55, 23.
5. Fournet, A.; Ferreira, M.; Rojas, A.; Guy, I.; Guinaudeau, H.; Heinzen, H.; Fitoterapia. 2007, 78, 382.
6. Palomino, E.; Maldonado, C.; J. Nat. Prod. 1996, 59, 77.
7. Marques, R.; Batistuzzo, S.; Silva, C.; Barbosa, J.; Fassarella, L.; Mutat. Res. 2003, 536, 117.
8. López, H.; Valera, A.; J. Nat. Prod. 1995, 58, 782.
9. Zschocke, S.; Staden, J.; Paulus, K.; Bauer, R.; Horn, M.; Munro. O.; Brown N.; Drewes, S.; Phytochemistry 2000, 54, 591.
10. Lordello, A.; Yoshida, M.; Phytochemistry 1997, 46, 741.
11. Silva, I.; Barbosa, J.; Silva, M.; Lacerda C. da-Cunha, E.; Biochem. Syst. Ecol. 2002, 30, 881.
12. Franca, N.; Giesbrecht, A.; Gottlieb, O.; Malgalhaes, A.; Malgalhaes, E.; Maia, J.; Phytochemistry 1975, 14, 1671.
13. Warrumby, S.; Lordello, A.; Quim. Nova 2007, 30, 92.
14. Wu, Y.; Chao, Y.; Chang, F.; Chen, Y.; Phytochemistry 1996, 46, 181.
15. Mathouet, H.; Elomri, A.; Lameiras, P.; Daich, A.; Vérité, P.; Phytochemistry 2007, 68, 1813.
16. Tantisewie, B.; Pharadai, T.; Pandhuganont, M.; Guinaudeau, H.; Freyer, A.; Shamma, M.; J. Nat. Prod. 1989, 52, 652.
17. Ringdahl, B.; Chan, R.; Craig, J.; J. Nat. Prod. 1981, 44, 80.
18. Nishiyama, Y.; Moriyasu, M.; Ichimaru, M.; Iwasa, K.; Kato, A.; Mathenge, S.; Chalo, P.; Juma, F.; Phytochemistry 2006, 67, 2671.
19. Castro, O.; Hasbun, C.; Calderon, M.; Fitoterapia 1991, 62, 72.
20. Chen, Y.; Chang, F.; Wu, Y.; J. Nat. Prod. 1996, 59, 904.
21. Zhao, O.; Zhao, Y.; Wang, K.; J. Ethnopharm. 2006, 106, 408.
22. Chang, F.; Wei, J.; Teng, C.; Wu. Y.; J. Nat. Prod. 1998, 61, 1457.
23. Gómez, Y.; Gil, K.; González, E.; Farías, L.; Rev. Biol. Trop. 2007, 55, 767.
24. Kuo, R.; Chang, F.; Chen, C.; Teng, C.; Yen, H.; Wu. Y.; Phytochemistry 2001, 57, 421.
25. Agnihotri, V.; ElSohly, H.; Khan, S.; Jacob, M.; Joshi, V.; Smillie, T.; Khan, I.; Walker, L.; Phytochem. Lett. 2008, 1, 89.
26. Ma, W.; Fukuski, Y.; Tahara, S.; Osawa, T.; Fitoterapia 2000, 71, 527.
27. Lerhrer R.; Rosenman, M.; Harwig. S.; Jackson, R.; Eisenhaver, P.; J. Inmunol. Métodos. 1991, 137, 167.
28. Nimgirawath, S.; Udomputtimekakul, P.; Taechowisan, T.; Wanbanjob, A.; Shen Y.; Chem. Farmacéutica. Toros. 2009, 57,
Recibido el 26/6/09; aceptado el 6/11/09; publicado en la web el 10/3/10
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MATERIAL COMPLEMENTARIO
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