Análisis genómicos integradores de la firma mutacional APOBEC, expresión y deleción de la línea germinal de los genes APOBEC3, e inmunogenicidad en múltiples tipos de cáncer

Patrones distintos de los genes APOBEC3, asociados con la firma mutacional de APOBEC en múltiples tipos de cáncer

Siguiendo el análisis anterior de la firma mutacional de APOBEC, medimos las mutaciones utilizando el número de deaminasa C que se encontraban dentro de las mutaciones del motivo trinucleótido TCW a T o G por cada muestra a través de 10 tipos de cáncer (ver Métodos). Realizamos análisis univariantes para evaluar las asociaciones de la firma mutacional APOBEC con los niveles generales de expresión génica de APOBEC3A y APOBEC3B. Observamos que el nivel de expresión de APOBEC3A se asociaba positivamente con la firma mutacional APOBEC en un total de seis tipos de cáncer: vejiga, mama, cuello uterino, adenocarcinoma de pulmón, cabeza y cuello, y tiroides. No se observaron asociaciones significativas en los restantes tipos de cáncer, aunque se observaron las mismas direcciones de asociación (archivo adicional 1: tabla S1). Curiosamente, observamos que el nivel de expresión de APOBEC3B se asociaba positivamente con la firma mutacional APOBEC en todos los tipos de cáncer, excepto en el carcinoma escamoso de pulmón (archivo adicional 1: tabla S1). En comparación con las asociaciones de APOBEC3A, APOBEC3B se asoció específicamente con la firma mutacional de APOBEC en los cánceres de estómago, páncreas y riñón, con una P = 5,2 × 10- 11, P = 2,0 × 10- 3, y P = 1,1 × 10- 4, respectivamente (Archivo adicional 1: Tabla S1). Estos resultados coinciden con los de estudios anteriores. Además, también evaluamos las asociaciones de la firma mutacional APOBEC con la expresión génica de otros genes APOBEC3: APOBEC3C, APOBEC3D, APOBEC3F, APOBEC3G y APOBEC3H. Nuestros resultados mostraron que las expresiones de estos genes se asociaron con la firma mutacional APOBEC variando en distintos tipos de cáncer (Archivo adicional 1: Tabla S2). Por ejemplo, la expresión de APOBEC3C se asoció con un aumento de la firma mutacional APOBEC en los cánceres de cuello uterino y de cabeza y cuello, mientras que su expresión se asoció con una disminución de la firma mutacional APOBEC en el cáncer de estómago. Nuestro resultado también mostró que la expresión de APOBEC3D, APOBEC3F y APOBEC3G se asoció con un aumento de la firma mutacional APOBEC, mientras que el resultado de la asociación de APOBEC3G estaba en línea con el hallazgo anterior. Curiosamente, observamos que la expresión de APOBEC3H se asoció con un aumento de la firma mutacional APOBEC en el cáncer de cuello uterino, pero no se observó en el cáncer de mama.

Patrones distintos de las isoformas de APOBEC3A y APOBEC3B, asociados con la firma mutacional APOBEC en múltiples tipos de cáncer

Evaluamos además las asociaciones entre la firma mutacional APOBEC y los niveles de expresión de cada una de las isoformas transcritas de APOBEC3A y APOBEC3B. Se analizaron un total de seis isoformas, incluyendo uc003awn y uc011aob transcritas a partir de APOBEC3A, uc003awo, uc003awp y uc003awq transcritas a partir de APOBEC3B, y otra isoforma, uc011aoc, derivada de un evento de fusión involucrado en una región que cubre el último intrónico de APOBEC3A hasta el último exón de APOBEC3B (Fig. 1a, b). Confirmamos que las isoformas uc003awn y uc003awo se transcribían principalmente a partir de APOBEC3A y APOBEC3B, respectivamente (archivo adicional 1: Figura S1) . Como se esperaba, la dirección de la asociación de los niveles de expresión de uc003awn y uc003awo y la firma mutacional de APOBEC eran consistentes con las observaciones de los niveles de expresión génica general en todos los tipos de cáncer (Fig. 1c, d; Archivo adicional 1: Tabla S3). Sorprendentemente, el nivel de expresión de uc011aoc (APOBEC3A/B) se asoció positivamente con la firma mutacional APOBEC sólo en el cáncer de mama (P = 5,0 × 10- 10) (Fig. 1e; Archivo adicional 1: Tabla S3). Sin embargo, no se observaron asociaciones para las isoformas restantes en ningún tipo de cáncer, excepto una débil asociación observada para uc011aob (APOBEC3A) con el cáncer de cabeza y cuello (P = 0,02; Archivo adicional 1: Tabla S3).

Usando análisis de regresión múltiple que incluyeron todas las isoformas de APOBEC3A y APOBEC3B, encontramos que los niveles de expresión de uc003awn (APOBEC3A) y uc003awo (APOBEC3B) estaban asociados de forma independiente y común con la firma mutacional APOBEC evaluada en múltiples tipos de cáncer: vejiga (una asociación marginal para uc003awn), mama, cuello uterino, adenocarcinoma de pulmón y cabeza y cuello (Tabla 1). Asimismo, se observó una asociación adicional para uc011awn (APOBEC3A) en tiroides, mientras que las asociaciones para uc003awo (APOBEC3B) se observaron en cánceres de estómago, páncreas y riñón. En consonancia con el análisis univariante, se observó una sorprendente asociación para uc011aoc (APOBEC3A/B) con la firma mutacional APOBEC en el cáncer de mama (P = 5,3 × 10- 11), y también se observó una asociación adicional en el adenocarcinoma de pulmón (P = 0,01) (Tabla 1). Estos hallazgos sugieren que uc011aoc desempeña un papel específico de tejido que afecta a la firma mutacional APOBEC principalmente en el cáncer de mama, mientras que uc003awn y uc003awo desempeñan un papel ubicuo pero distinto en todo el espectro del cáncer humano. En particular, nuestro análisis adicional mostró la correlación de expresión positiva entre la isoforma uc011aoc y APOBEC3A en la mayoría de los tipos de cáncer, especialmente en el cáncer de mama (archivo adicional 1: Tabla S4).

Además, realizamos un análisis de asociación estratificado por subtipos clínicos en cáncer de mama. Observamos que las asociaciones de las isoformas de uc003awn (APOBEC3A) y uc011aoc (APOBEC3A/B) con la firma mutacional APOBEC variaban en los diferentes subtipos clínicos, observándose la asociación más significativa en el subtipo LumA (Archivo adicional 1: Tabla S5).

La deleción de APOBEC3A/B en la línea germinal afecta a los niveles de expresión de las isoformas de los genes APOBEC3A y APOBEC3B

Para investigar cómo la deleción de APOBEC3A/B en la línea germinal afecta a la expresión de las isoformas de APOBEC3A y APOBEC3B, primero identificamos 30 muestras con deleción homocigota, 239 muestras con deleción heterocigota y 2287 muestras sin deleción (archivo adicional 1: Tabla S6, ver Métodos). A continuación, evaluamos las asociaciones entre la deleción de APOBEC3A/B en la línea germinal y los niveles de expresión de cada isoforma mediante un análisis univariante (ver Métodos). Como se esperaba, observamos que la deleción de APOBEC3A/B en la línea germinal se asociaba significativamente con la disminución de los niveles de expresión de la isoforma uc003awo (APOBEC3B) en todos los tipos de cáncer con una P < 0,05, excepto en el caso del cáncer de páncreas con una P = 0,14. También se observaron asociaciones significativas con la disminución de los niveles de expresión de uc003awn (APOBEC3A) en tres tipos de cáncer: vejiga, mama y tiroides (Fig. 2; Tabla 2). Por el contrario, nuestros resultados mostraron que la deleción de APOBEC3A/B en la línea germinal se asoció significativamente con un mayor nivel de expresión de uc011aoc (APOBEC3A/B) en todos los tipos de cáncer, excepto en los de estómago, páncreas y riñón. Para estos, no hubo significación estadística pero tuvieron las mismas direcciones de asociación (Fig. 2; Tabla 2). En particular, el cáncer de cabeza y cuello mostró la asociación más significativa con P = 3,8 × 10- 65, y los cánceres de mama y vejiga mostraron la asociación significativa con P = 3,0 × 10- 8, y P = 2,9 × 10- 7, respectivamente. Además, realizamos el mismo análisis, estratificado por población, y se observó una tendencia similar en estos tipos de cáncer (datos no mostrados). Nuestros resultados sugieren que, en casi todos los tipos de cáncer investigados, la deleción de APOBEC3A/B en la línea germinal se asoció significativamente con una disminución de los niveles de expresión de uc003awn y uc003awo, pero hubo un aumento del nivel de expresión de uc011aoc.

La deleción de APOBEC3A/B en la línea germinal influye en la firma mutacional de APOBEC-firma mutacional, la carga de neoantígenos y la composición relativa de las células inmunitarias, específicamente en el cáncer de mama

Un estudio anterior demostró que la deleción de APOBEC3A/B en la línea germinal se asocia con una mayor firma mutacional de APOBEC en el cáncer de mama, mientras que se observó un patrón similar, pero sin significación estadística, en muchos otros tipos de cáncer, como el de vejiga . Utilizando un análisis univariante para evaluar los efectos globales de la deleción de APOBEC3A/B en la firma mutacional de APOBEC, encontramos que la deleción estaba significativamente asociada con una mayor firma mutacional de APOBEC sólo en el cáncer de mama (P = 5,6 × 10- 3; Tabla 3; Fig. 3a). Sin embargo, se observó una tendencia opuesta en la mayoría de los demás tipos de cáncer, aunque la mayoría de las asociaciones no fueron estadísticamente significativas (Tabla 3). En concreto, en el cáncer de vejiga, observamos que la deleción de APOBEC3A/B en la línea germinal se asociaba significativamente con una disminución de la firma mutacional APOBEC (P = 1,7 × 10- 3; Tabla 3). Para dilucidar aún más si la influencia de la deleción de APOBEC3A/B de la línea germinal en la firma mutacional de APOBEC se debe a su efecto en la expresión génica, evaluamos además las asociaciones entre la firma mutacional de APOBEC y la deleción con un ajuste para la expresión de las isoformas (ver Métodos). Del mismo modo, nuestros resultados revelaron que la deleción de APOBEC3A/B en la línea germinal se asoció significativamente con un aumento de la firma mutacional APOBEC sólo en el cáncer de mama (P = 2,8 × 10- 6; Tabla 3; Fig. 3b). Se observó un mayor tamaño del efecto (Beta = – 0,620) de la deleción con una expresión de isoforma ajustada en comparación con la observación inicial del efecto global (Beta = – 0,281; Tabla 3). Para evaluar si la deleción de la línea germinal puede contribuir a la proporción de la firma mutacional APOBEC, también analizamos la proporción de la firma mutacional APOBEC en relación con el total de mutaciones para cada muestra (ver Métodos). En consonancia con la observación inicial de la firma mutacional APOBEC, observamos que la deleción de la línea germinal se asoció significativamente con una mayor proporción de la firma mutacional APOBEC sólo en el cáncer de mama (Beta = – 0,287, P = 4,8 × 10- 3 y Beta = – 0,5, P = 1,4 × 10- 4 para el efecto global y los efectos con la expresión génica ajustada; véase la Tabla 3). Estos resultados indican que la deleción de APOBEC3A/B en la línea germinal, que conduce a un aumento de la firma mutacional de APOBEC, se debe probablemente a la función distinta de uc011aoc transcrita a partir de la deleción, aparte de su efecto en el aumento de las expresiones de uc011aoc. Se ha informado de que el haplotipo I de APOBEC3H (APOBEC3H-I) puede contribuir en gran medida a la firma mutacional de APOBEC en las muestras que llevan deleciones de APOBEC3A/B en la línea germinal del cáncer de mama. Además, analizamos el haplotipo APOBEC3H-I para un total de 76 muestras que se predijo que eran portadoras de deleciones APOBEC3A/B en la línea germinal (ver Métodos). Nuestros resultados mostraron que la firma mutacional APOBEC no estaba significativamente correlacionada con el haplotipo APOBEC3H-I, independientemente de las muestras en las que se predijo que eran portadoras de deleciones APOBEC3A/B de línea germinal homocigóticas o heterocigóticas (Datos no mostrados). Sin embargo, nuestros hallazgos están en consonancia con el hallazgo anterior de que la proteína APOBEC3A/B, generada por la deleción, tiene un mayor nivel de expresión que la proteína APOBEC3A basado en la investigación de ensayos funcionales in vitro .

Para explorar más a fondo la función distinta y las vías potenciales en las que la expresión de la isoforma uc011aoc (transcrita a partir de la deleción APOBEC3A/B) puede estar implicada, analizamos los genes que se coexpresaban con la isoforma uc011aoc en las muestras en las que se preveía que había deleciones de APOBEC3A/B en la línea germinal (ver Métodos). Un análisis de enriquecimiento en las vías de señalización canónicas utilizando IPA reveló que estos genes coexpresados estaban significativamente enriquecidos en distintas vías canónicas que variaban entre los tipos de cáncer. En concreto, observamos que las vías más enriquecidas eran la señalización HIPPO para la vejiga, la señalización PTEN para la mama, la señalización iNOS e Interferón para el adenocarcinoma de pulmón, la hidrólisis de acil-CoA para el estómago, y la reparación de la rotura del doble filamento del ADN y la α-oxidación de los ácidos grasos para el páncreas, la señalización EIF2 para la tiroides y la integración mediada por GPCR para el riñón (P < 0,01 para todas; archivo adicional 1: Tabla S7). Además, se observó un enriquecimiento funcional en Muerte Celular y Supervivencia en múltiples tipos de cáncer, incluyendo vejiga, mama, cuello uterino, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma de pulmón (P < 0,05 para todos).

Evaluamos además la asociación entre la deleción de APOBEC3A/B en la línea germinal y las cargas de neoantígenos. En consonancia con la observación de la firma mutacional APOBEC, nuestros resultados mostraron que la deleción de APOBEC3A/B en la línea germinal se asoció significativamente con el aumento de las cargas de neoantígenos sólo en el cáncer de mama (P = 6,5 × 10- 3; Fig. 3c), mientras que se observó una tendencia opuesta en muchos otros tipos de cáncer (archivo adicional 1: Tabla S8). Del mismo modo, descubrimos que la deleción de la línea germinal estaba marginalmente asociada con la abundancia relativa de la composición de las células T (CD8+) en los TIL, pero sólo en el cáncer de mama (P = 0,08; Fig. 3d). La asociación significativa se detectó cuando peinamos las muestras con deleciones homocigóticas y heterocigóticas y las comparamos con las muestras con deleciones no portadoras (una prueba de rango con signo de Wilcoxon, P < 0,05). Sin embargo, no se observó ninguna asociación con otras células inmunitarias. Nuestros hallazgos mostraron que la deleción de APOBEC3A/B en la línea germinal desempeña un papel específico en los tejidos al afectar a la firma mutacional de APOBEC y a la inmunogenicidad en el cáncer de mama, lo que probablemente refuerza los hallazgos en estudios previos de asociación de todo el genoma sobre los posibles mecanismos de su asociación con un mayor riesgo de cáncer de mama.

La firma mutacional APOBEC contribuye significativamente a los neoantígenos

Para investigar hasta qué punto la firma mutacional APOBEC contribuye a los neoantígenos, analizamos las cargas de neoantígenos predichas para cada muestra recogida en un estudio anterior (ver Métodos). Mediante un análisis univariante, evaluamos las asociaciones entre la firma mutacional APOBEC y las cargas de neoantígenos para cada tipo de cáncer. Como se esperaba, la firma mutacional APOBEC se asoció positivamente con las cargas de neoantígenos en todos los tipos de cáncer (P < 1,0 × 10- 4 para todas las comparaciones), mientras que las asociaciones más significativas se observaron en los tipos de mama y vejiga con P = 5,1 × 10- 125, y P = 1,5 × 10- 90, respectivamente (archivo adicional 1: Tabla S9). Del mismo modo, se observó una tendencia general de asociación positiva entre las cargas de neoantígenos predichas y la proporción de la firma mutacional APOBEC, con la excepción del cáncer de estómago (Fig. 4; Archivo adicional 1: Tabla S10). Específicamente, las asociaciones significativas se observaron en múltiples tipos de cáncer, incluyendo vejiga, mama, cuello uterino, adenocarcinoma de pulmón, cabeza y cuello, y tiroides. En particular, el cáncer de mama y el de vejiga mostraron las mejores asociaciones con P = 8,9 × 10- 29, y P = 2,8 × 10- 27, respectivamente (archivo adicional 1: tabla S10). Nuestros hallazgos sugieren que la firma APOBEC-mutacional juega un papel importante en la contribución a la biogénesis de neoantígenos en el cáncer humano.

Asociación entre la abundancia relativa de las composiciones de células inmunitarias en los TIL con la carga de neoantígenos y la firma mutacional APOBEC

Para investigar la relación entre la carga de neoantígenos y los TIL, utilizamos datos de expresión génica en tejidos tumorales para medir la abundancia de las composiciones celulares relativas de cada tipo de célula inmunitaria, incluyendo células B naïve, células B de memoria, células T CD8 y células T CD4 de memoria activada en TILs (ver Métodos). Mediante un análisis univariante, evaluamos la asociación entre la carga de neoantígenos y la abundancia relativa de las composiciones de células inmunitarias para cada tipo de cáncer. Observamos que había una tendencia de asociación positiva entre las cargas de neoantígenos y los tipos de células T CD8+ y CD4+ activadas por la memoria en todos los tipos de cáncer, excepto en el de tiroides y riñón (prueba binomial P = 0,11 y P = 0,02 para los tipos de células T CD8+ y CD4+ activadas por la memoria, respectivamente). Se observó un patrón opuesto para los tipos de células B naïve y con memoria en todos los tipos de cáncer, con la excepción del adenocarcinoma de pulmón (prueba binomial P = 0,02 y P = 2,2 × 10- 16 para los tipos de células B naïve y con memoria, respectivamente). En particular, nuestros resultados mostraron que las cargas de neoantígenos tenían una asociación con las abundancias relativas de los tipos de células T CD8+ y CD4+ con memoria, y de células B naive y con memoria en el cáncer de vejiga. Hubo una asociación para los tipos de células B naive y de memoria en el cáncer de mama, y para los tipos de células T CD4 activadas por memoria en el adenocarcinoma de pulmón, el cáncer de cabeza y cuello y el cáncer de páncreas (archivo adicional 1: tabla S11). Dado que la firma mutacional APOBEC contribuyó significativamente a los neoantígenos, evaluamos adicionalmente la asociación entre las abundancias relativas de las composiciones de células inmunitarias en los TIL y la firma mutacional APOBEC. En consonancia con la observación del análisis de asociación de la carga de neoantígenos, también se encontró un patrón similar para la firma mutacional APOBEC (archivo adicional 1: tabla S12). Nuestros hallazgos sugieren que la firma mutacional APOBEC influye en las capacidades inmunogénicas del cáncer, como la atracción de ciertas células inmunitarias en las TIL, posiblemente mediada por el aumento de la carga de neoantígenos.