Aplicaciones actuales de las micromatrices de anticuerpos
Debido a las capacidades únicas de las micromatrices de anticuerpos y a su aplicabilidad en una serie de proyectos biomédicos, se han desarrollado una serie de diferentes micromatrices de anticuerpos, de las cuales algunas se han comercializado. Aquí hemos recopilado algunos de los estudios representativos de los últimos 7 años (Tabla 1), y hemos organizado nuestra visión general en dos partes según el enfoque de los proyectos: estudios impulsados por la biología básica e investigación clínica. Como sigue siendo prácticamente imposible abarcar todas las aplicaciones recientes de las micromatrices de anticuerpos, nos centramos en aquellas aplicaciones que consideramos de gran interés y en los hallazgos de importante significado clínico.
Investigación básica
Relacionados con las vías de señalización
Los cambios en las vías de señalización son un sello distintivo de muchos estados de enfermedad, incluyendo el cáncer , la diabetes y los trastornos neurodegenerativos . La construcción de matrices de anticuerpos utilizando reactivos de captura dirigidos a las proteínas de la cascada de señalización de interés ha permitido a los investigadores investigar los cambios en los perfiles de proteínas y las modificaciones en las vías de señalización en los procesos biológicos normales y los estados de enfermedad. Los investigadores han aplicado este concepto a una serie de materiales y preparaciones de muestras biológicas, incluyendo lisados celulares , extractos de tejidos y plasma .
Calbindina-D28 k (CB), una importante proteína de unión al calcio que actúa como amortiguador del calcio y que se encuentra expresada en niveles más bajos en los cerebros de ratones y humanos con la enfermedad de Alzheimer, pero no se sabe si estos cambios contribuyen a la disfunción relacionada con la EA (enfermedad de Alzheimer). Kook et al. generaron un ratón transgénico deficiente en CB (CBKOTg) para investigar la contribución de CB a las vías de señalización en la EA. Utilizando microarrays de anticuerpos para examinar el tejido cerebral del ratón, identificaron alteraciones significativas en las vías de muerte celular, la transmisión sináptica y las vías de señalización MAPK tras la supresión de CB. Estos hallazgos se verificaron mediante inmunohistoquímica, que mostró un aumento de los marcadores apoptóticos y de la muerte neuronal, lo que demuestra que las micromatrices de anticuerpos pueden proporcionar información novedosa, mejorando nuestra comprensión del papel del CB y su implicación en la fisiopatología de la EA.
Las micromatrices de anticuerpos se han utilizado para descubrir el papel fisiológico en proteínas altamente conservadas, incluyendo el factor de elongación 4. Gao et al. diseccionaron el mecanismo del factor de control de calidad factor de elongación mitocondrial 4 (mtEF4) en la traducción utilizando un microarray de anticuerpos fosfoexploradores . Al comparar los lisados celulares entre los tejidos testiculares de ratones mtEF4 knock-out y WT, descubrieron que el enriquecimiento de pliegues de mTOR era el más alto entre las diferentes vías de señalización. Los autores demostraron que con la supresión de mtEF4, la principal señal de retroalimentación del citoplasma somático es la regulación al alza de mTOR. Esto iba acompañado de un aumento de la traducción citoplasmática, lo que indica que mTOR desempeña un papel crucial como efector descendente que compensa la deficiencia de traducción mitocondrial. Además, el estudio vinculó una interacción no descrita anteriormente entre el control de calidad dependiente de mtEF4 en las mitocondrias y la vía de mTOR en el citoplasma.
Mecanismo de los fármacos
Con la ayuda de los ensayos de microarrays de anticuerpos, los investigadores pueden investigar los mecanismos de los fármacos de una manera sistemática y eficiente. Entre las muchas aplicaciones posibles, se ha estudiado la angiogénesis inducida por el tumor, ya que desempeña un papel fundamental en la progresión del cáncer . P11, un nuevo ligando peptídico que contiene un motivo de unión a PDZ (Ser-Asp-Val) con alta afinidad a la integrina αvβ3, se identificó a partir de una biblioteca de hexapéptidos (PS-SPCL) utilizando un microarray de anticuerpos. El mecanismo farmacológico de P11, se dilucidó utilizando un enfoque de microarray farmacoproteómico específicamente diseñado que contiene 48 anticuerpos relacionados con el cáncer . El estudio reveló que P11 inhibe la proliferación de células endoteliales de la vena umbilical humana inducida por bFGF a través de la inhibición de la proteína quinasa activada por mitógenos y de la quinasa regulada por señales extracelulares. Además, el microarray reveló que P11 provocó la regulación al alza del marcador apoptótico p53, lo que dio lugar a la inducción de la apoptosis a través de la activación del sistema de caspasas, lo que indica que P11 puede desempeñar un papel clave en la prevención de la progresión del tumor. El vínculo entre P11 y p53 presenta a los investigadores clínicos y básicos del cáncer ayudará a dilucidar más pistas sobre el papel de P11 y su objetivo inhibidor.
La lovastatina, un producto natural derivado de Aspergillus terreus o Monascus ruber, se ha utilizado ampliamente como un fármaco para reducir el colesterol en la clínica. Yang et al. han utilizado una micromatriz de anticuerpos que contiene 656 anticuerpos centrados en diferentes vías celulares funcionales, lo que sugiere que la lovastatina también tiene propiedades anticancerígenas, a través de mecanismos poco definidos. Es muy necesario encontrar tratamientos eficaces contra el cáncer y comprender sus mecanismos de acción. Utilizando un microarray, se estudiaron células de cáncer de mama en condiciones de hipoxia para investigar los mecanismos moleculares a través de los cuales la lovastina ejerce su efecto. Se observaron 17 proteínas reguladas al alza y 20 reguladas a la baja en las células de cáncer de mama tratadas con lovastatina, en comparación con el control, y los resultados se validaron posteriormente mediante PCR en tiempo real. La firma proteica incluía proteínas implicadas en la apoptosis, la proliferación celular y la metástasis tumoral, lo que relaciona la modulación de estas vías con la acción farmacológica de la lovastina.
También se ha propuesto que el fármaco para la diabetes de tipo 2, la metformina, tenga propiedades anticancerígenas. Lee et al. investigaron la potencia de nuevos derivados de la metformina utilizando una micromatriz de anticuerpos construida para estudiar las moléculas relacionadas con el ciclo celular. Los autores demostraron que la metformina-butirato (MFB) tenía una mayor eficacia antitumoral que la metformina-HCl, a través de una mayor actividad neoplásica y una mejor eficiencia en el deterioro de la progresión del ciclo celular durante las fases S y G2/M, además de parecer tener efectos citotóxicos preferentes en las poblaciones de células madre del cáncer de mama . Estos hallazgos ponen de manifiesto cómo los arrays de anticuerpos pueden proporcionar pruebas proteómicas que apoyen el desarrollo de fármacos con mayor eficacia.
Para la investigación en biología básica, los microarrays de anticuerpos pueden servir para detectar proteínas de señalización y proteínas asociadas a un fenotipo concreto. Las matrices con detección paralela de proteínas brindan la oportunidad de investigar múltiples vías de señalización en un solo experimento, lo que permite conocer nuevos mecanismos, como el estudio de la progresión de la enfermedad, la interacción de los fármacos y la respuesta a las infecciones.
Investigación clínica
El análisis de muestras clínicas a nivel de proteínas permitirá mejorar los marcadores de diagnóstico y orientar las opciones de tratamiento. Dado que las proteínas están implicadas en la mayoría de los procesos celulares, el análisis de proteínas puede proporcionar una firma biológica de la enfermedad, generando conocimientos detallados sobre el estado actual de una célula, órgano o sistema. Los microarrays de anticuerpos pueden proporcionar una guía en tiempo real de los cambios actuales en los procesos biológicos durante la salud y la enfermedad. En esta sección, ejemplificaremos cómo se han utilizado los microarrays de anticuerpos para investigar cohortes clínicas, analizando principalmente muestras de suero y plasma. No es posible abarcar todos los aspectos de las micromatrices de anticuerpos para la investigación clínica, aquí sólo nos centramos en varias de las enfermedades más importantes, es decir, las enfermedades autoinmunes, las enfermedades infecciosas, el cáncer y las enfermedades neurodegenerativas.
Enfermedades autoinmunes
El diagnóstico del lupus eritematoso sistémico (LES) es un reto debido a su presentación clínica heterogénea y a la falta de biomarcadores robustos para distinguirlo de la enfermedad activa e inactiva, así como de otras enfermedades autoinmunes. Lin et al. realizaron un cribado de microarrays de anticuerpos DotScan™ de células mononucleares de sangre periférica de 60 pacientes con LES de diferente actividad de la enfermedad, 25 pacientes con artritis reumatoide, 28 muestras de otras enfermedades autoinmunes y 24 controles sanos. Los perfiles de los microarrays de anticuerpos pudieron distinguir a los pacientes con LES activo de los controles sanos. El uso de una matriz de captura de leucocitos mejoró la capacidad de discriminación de los diagnósticos convencionales de LES, al verificar el antidsDNA sérico, los complementos C3 y C4, las micromatrices aumentaron la capacidad de discriminación del LES semiactivo y activo, información que ayudará a un mejor manejo de la enfermedad.
En otro estudio, Carlsson et al. construyeron 135 fragmentos recombinantes humanos variables de cadena única (scFv) dirigidos a proteínas inmunes para construir una micromatriz de anticuerpos propia. En este estudio, examinaron a pacientes con esclerosis sistémica (SSc), LES y 15 voluntarios sanos. La SSc es un trastorno autoinmune que afecta al tejido conectivo, lo que puede suponer un reto para el diagnóstico diferencial con respecto al LES. La matriz identificó 40 proteínas expresadas diferencialmente, creando una firma proteómica candidata para delinear el LES y su severidad de la SSc. Esta firma proteica fue una mejor clasificación de la enfermedad que una sola o incluso combinaciones de parámetros clínicos convencionales, incluyendo, ANA, anti-DNA, SLEDAI-2 k, C1q, C3, C4 y CRP, ilustrando el uso potencial de los microarreglos de anticuerpos para crear nuevas firmas de la enfermedad que añadirán valor clínico a la gestión de la enfermedad.
Enfermedades infecciosas
Las infecciones activan el sistema inmunológico de manera diferente, y estos mecanismos pueden ser investigados utilizando arrays de anticuerpos a nivel de proteoma. El Helicobacter pylori es un patógeno que coloniza aproximadamente a la mitad de la población mundial y que causa gastritis crónica. Sukri et al. emplearon la micromatriz de anticuerpos DotScan™ para determinar la tolerancia del sistema inmunitario hacia las células tumorales en el cáncer gástrico utilizando 144 anticuerpos CD para perfilar la distribución de los marcadores CD entre las células de adenocarcinoma gástrico infectadas por Helicobacter pylori y las no infectadas. Curiosamente, descubrieron que la línea celular de adenocarcinoma gástrico AGS infectada por H. pylori cagA + mostraba una mayor expresión de CD27, que es esencial para el mantenimiento de la población de células T, y también se detectó un aumento de los marcadores de CD en los pacientes con cáncer gástrico infectados por H. pylori. Este estudio sugiere no sólo la tolerancia del sistema inmunitario hacia el cáncer gástrico, sino también las variaciones de la respuesta inmunitaria aprovechadas por diferentes cepas de H. pylori.
Además, las matrices de anticuerpos pueden ser útiles en el seguimiento de un cambio continuo en el entorno fisiológico, incluyendo el estado de la enfermedad y la respuesta a las terapias e intervenciones. Tras el trasplante de hígado, el 94% de los pacientes presentaban daños histológicos inducidos por el virus de la hepatitis C (VHC), y algunos de ellos sufrían una grave recurrencia de la enfermedad. Existe una necesidad urgente de biomarcadores predictivos para identificar la gravedad de la enfermedad recurrente. Utilizando una micromatriz de anticuerpos de CD, se investigó la sangre periférica de pacientes definidos como grupos de pretrasplante, de inicio, de mediados y de finales del trasplante para predecir la gravedad de la recurrencia del VHC después del trasplante . Las muestras de sangre seriadas tomadas de los pacientes antes y después del trasplante de hígado permitieron el seguimiento del entorno de la enfermedad, con sus propios controles internos. Cinco marcadores de CD (CD27, CD182, CD260, CD41 y CD34) aumentaron significativamente en la recidiva grave en comparación con la recidiva leve. Este resultado muestra que las matrices de anticuerpos pueden ayudar a evaluar la gravedad de la enfermedad del VHC recurrente después del trasplante de hígado.
Ellmark et al. idearon una micromatriz de anticuerpos recombinantes de marco único (SinFabs) que contenía 127 anticuerpos diferentes contra antígenos inmunorreguladores seleccionados de la biblioteca n-CoDeR en adenocarcinoma gástrico. Los investigadores descubrieron que las firmas de expresión de proteínas asociadas al tumor y a la infección, como la IL-9, la IL-11 y la MCP-4, podían identificarse a partir de los proteomas plasmáticos y servir como potenciales biomarcadores. Estos hallazgos pueden ayudar a mejorar la comprensión del cáncer inducido por H-pylori y pueden allanar el camino para el diagnóstico refinado en el futuro.
Se han realizado matrices de anticuerpos basadas en cuentas para investigar los perfiles diferenciales de proteínas en el plasma de los niños que sufren de malaria y complicaciones relacionadas con la malaria. De las 1.000 proteínas analizadas, 41 tenían una expresión diferencial entre los niños infectados por la malaria y los controles de la comunidad. Otras trece proteínas se relacionaron con la gravedad de la enfermedad del paludismo. Estos resultados indican la implicación de la inflamación, así como el desequilibrio del metabolismo de la glucosa en las formas graves de la enfermedad, y los mayores cambios se observaron en dos de las proteínas musculares (anhidrasa carbónica 3 y creatina quinasa), que apuntan a daños y lesiones musculares en los niños con malaria cerebral. Estos hallazgos podrían ayudar a desarrollar pruebas sencillas para clasificar a los niños infectados por la malaria en grupos con mayor riesgo de padecer la forma grave de la enfermedad.
Cáncer
Las micromatrices de anticuerpos se han aplicado a la investigación del cáncer, principalmente para estudiar su progresión y las proteínas candidatas que pueden servir como biomarcadores de diagnóstico. El cáncer de páncreas es una enfermedad agresiva con mal pronóstico, y se necesitan urgentemente biomarcadores específicos de la enfermedad que ofrezcan un diagnóstico temprano y preciso. Utilizando una plataforma de microarrays de anticuerpos recombinantes de desarrollo propio, Wingren et al. examinaron sueros de 148 pacientes con cáncer de páncreas, pancreatitis crónica, pancreatitis autoinmune (PAI) y controles sanos. Identificaron un panel de 25 proteínas diana, incluyendo IL-2, IL-11, IL-12, TNF-, que contribuyeron a distinguir el cáncer de páncreas de los controles sanos. Esta firma de 25 proteínas presenta un alto potencial diagnóstico (AUC de 0,88). Además, el grupo ha ampliado recientemente el análisis de su panel a conjuntos de muestras adicionales, incluyendo linfoma, cáncer de próstata y cáncer de mama en lisados celulares y plasma. Estos resultados son útiles para ayudar al desarrollo de métodos de diagnóstico novedosos y multivariantes.
Una de las cuestiones más importantes en la biología del cáncer, es determinar la capacidad de invasión de un tumor. Un estudio desarrolló una plataforma de microarrays de anticuerpos personalizada que contenía 4096 características para interrogar muestras de plasma que abarcaban enfermedades preinvasivas e invasivas de un modelo de ratón de adenocarcinoma ductal pancreático (PDA) . Encontraron una firma proteica, compuesta por la expresión diferencial de tres proteínas, ERBB2, TNC y ESR1, que podía utilizarse para mejorar el AUC de 0,86 (intervalo de confianza del 95%: 0,76-0,96) a 0,97 (IC del 95%: 0,92-1,0) cuando se incluía el marcador de PDA CA19-9.
La mayoría de los casos recién diagnosticados de cáncer de vejiga son de bajo estadio, de bajo grado y no invasivos para el músculo . Después de la resección transuretral estándar, el 50-70% de los tumores reaparecen, sin embargo el 10-30% de los tumores progresarán a enfermedad músculo-invasiva . Comprender el mecanismo de la progresión tumoral podría proporcionar información más útil a los ámbitos clínicos. Srinivasan et al. estudiaron lisados celulares con un microarray de anticuerpos que contenía 810 anticuerpos relacionados con el cáncer, construido por el laboratorio Hoheisel . Los autores construyeron un clasificador multivariante con 20 proteínas, que facilitó la predicción de la recurrencia con una sensibilidad del 80% y una especificidad del 100%. Curiosamente, encontraron la represión de la vía de señalización del TGF-β en el cáncer recurrente. Los factores de señalización IFNG, TNF-α y THBS1 se expresaban menos y la abundancia del inhibidor MAPK3 (también conocido como ERK1) era mayor, mientras que SMAD2, SMAD3 y SMAD4 estaban de nuevo significativamente subrepresentados . Los datos indicaron que los inhibidores de la vía de señalización del TGF-β pueden reducir la recurrencia del cáncer de vejiga.
Puig-Costa et al. emplearon microarrays de anticuerpos para descubrir biomarcadores del cáncer gástrico (GC). En particular, la micromatriz de anticuerpos contenía anticuerpos dirigidos a diferentes proteínas funcionales bien conocidas que desempeñan un papel crucial en la progresión del cáncer, incluyendo 120 citoquinas, 43 factores angiogénicos, 41 factores de crecimiento, 40 factores inflamatorios y 10 metaloproteinasas. El análisis de vías de Ingenuity confirmó que algunos biomarcadores, como ICAM-1 y angiogenina, indicaban una elevada respuesta inflamatoria en los pacientes con CG. Se descubrió que los objetivos de movimiento celular y tráfico de células inmunitarias, como la proteína quimioatrayente de monocitos (MCP)-1, estaban sobrerrepresentados en los pacientes con CG. Los valores predictivos positivos y negativos en esta cohorte de validación fueron del 75% (IC del 95%: 53-90) y del 80% (IC del 95%: 56-94), respectivamente. Por último, los análisis de micromatrices de anticuerpos del proteoma inflamatorio asociado al CG identificaron una firma de cáncer gástrico impulsada por 21 proteínas inflamatorias (INPROGAS) que discriminaba con precisión el CG de la mucosa gástrica no cancerosa, y puede proporcionar nuevas pistas para el análisis de la progresión del cáncer.
En el cáncer de próstata, Schwenk et al. utilizaron matrices de anticuerpos en matrices de microesferas en suspensión para comparar los niveles plasmáticos de proteínas entre diferentes grupos con el fin de encontrar biomarcadores adicionales junto al antígeno prostático específico (PSA). Además de clasificar a los pacientes en función del PSA, identificaron una disminución de los niveles plasmáticos de CNDP1 y, en un estudio posterior de mayor envergadura, se demostró su asociación en las formas más agresivas de la enfermedad. Se desarrolló un inmunoensayo en sándwich para validar estos hallazgos en más de 1200 pacientes, y se dilucidó la asociación de la disminución de CNDP1 con la metástasis en los ganglios linfáticos. Esto demuestra uno de los pocos estudios que han validado con éxito una indicación inicial a través de la línea de microarrays de anticuerpos y el desarrollo de un ensayo dirigido. En una investigación posterior sobre la caquexia del cáncer, se descubrió que los niveles plasmáticos de CNDP1 disminuían en los pacientes caquécticos, lo que apuntaba a un papel metabólico de los cambios en los niveles de CNDP1.
En un estudio sobre los tumores neuroendocrinos del intestino delgado, Darmanis et al. investigaron los niveles plasmáticos de dos conjuntos de estudios independientes (77 y 132 muestras) y una matriz de cuentas dirigida para 124 proteínas únicas. Lograron una precisión de clasificación de hasta el 85% utilizando un panel de proteínas y concluyeron proponiendo nuevos candidatos para clasificar los tumores. De los candidatos preseleccionados, como el IGFBP2 y el IGF1, el grupo realizó ensayos ELISA para confirmar las indicaciones. Estos resultados indican una asociación metabólica de las proteínas plasmáticas con el cáncer y apoyan la consideración de estas dianas en futuros estudios sobre el cáncer.
Enfermedades neurodegenerativas
El análisis de la expresión de las proteínas ofrece la posibilidad de ampliar los conocimientos actuales sobre la fisiopatología neurodegenerativa . Los recientes avances en el campo de la proteómica han ofrecido la posibilidad de buscar nuevos biomarcadores utilizando microarrays de anticuerpos . Los avances en el desarrollo de protocolos han permitido a los investigadores estudiar no sólo la sangre, sino también el líquido cefalorraquídeo (LCR).
Dentro de la neuroproteómica, el laboratorio de Nilsson ha llevado a cabo varios estudios utilizando anticuerpos del Atlas de Proteínas Humanas junto con los ensayos de conjuntos de cuentas en suspensión. Al analizar el LCR de pacientes con Esclerosis Múltiple (EM), encontraron GAP43, una proteína citoplasmática que participa en la formación y regeneración de las neuronas, por lo que es un prometedor biomarcador de enfermedades del cerebro. Más recientemente, Remnestål et al. compararon los niveles de proteínas en 441 muestras de LCR recogidas de diferentes conjuntos de muestras de enfermedades neurodegenerativas, así como de LCR recogido post-mortem. Entre los 376 anticuerpos, se encontró que las proteínas sinápticas GAP43 y NRGN estaban asociadas a los pacientes con EA en comparación con los controles.
Usando muestras de plasma, LCR y tejido cerebral de pacientes que sufren de EM, se llevó a cabo un cribado a gran escala que partió de la utilización de 4500 anticuerpos en arrays de cuentas. Se encontró un conjunto de proteínas asociadas a los subtipos de EM en LCR y plasma. La utilización de algunos de los anticuerpos candidatos contra IRF8, IL7 y METTL14 también para el análisis de inmunofluorescencia del tejido cerebral mostró la tinción de las neuronas en la proximidad de las lesiones de EM. Esto indica que los anticuerpos seleccionados a partir de ensayos basados en arrays para el análisis de fluidos corporales también pueden proporcionar más pruebas en el tejido afectado.
Por último, los arrays de cuentas se utilizaron para perfilar el plasma de pacientes que padecen esclerosis lateral amiotrófica (ELA) , donde se analizaron 367 pacientes de ELA y 101 controles para 278 proteínas. El estudio concluye proponiendo el polipéptido medio de neurofilamentos (NEFM), la familia de transportadores de solutos 25 (SLC25A20) y el regulador de la señalización de la proteína G 18 (RGS18) como proteínas valiosas porque están implicadas en procesos relacionados con la fisiopatología de la enfermedad, lo que justifica una mayor validación en conjuntos de muestras independientes.