Apocynin, un tratamiento oral de bajo peso molecular para las enfermedades neurodegenerativas

Abstract

Las pruebas que se acumulan sugieren que los mediadores inflamatorios secretados por las células inmunitarias innatas activadas residentes o infiltradas tienen un impacto significativo en la patogénesis de las enfermedades neurodegenerativas. Esto podría implicar que los pacientes afectados por una enfermedad neurodegenerativa podrían beneficiarse del tratamiento con inhibidores selectivos de la actividad inmunitaria innata. Aquí revisamos el potencial terapéutico de la apocinina, un compuesto fenólico esencialmente no tóxico aislado de la planta medicinal Jatropha multifida. La apocinina es un inhibidor selectivo de la NADPH oxidasa fagocítica Nox2 que puede aplicarse por vía oral y es notablemente eficaz a bajas dosis.

1. Introducción

Las sociedades que envejecen se enfrentan a una creciente prevalencia de enfermedades neurodegenerativas. Algunos ejemplos relativamente prevalentes son la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson y menos prevalentes son la enfermedad de Huntington y la enfermedad de Lou Gehrig (esclerosis lateral amiotrófica; ELA). Todas las enfermedades neurodegenerativas tienen en común que no existe ningún tratamiento eficaz que pueda detener el deterioro progresivo de las funciones neurológicas. Cabe destacar que ninguno de los agentes neuroprotectores que se han probado en la clínica tiene una eficacia que vaya más allá del control de los síntomas.

En los últimos años ha aumentado la idea de que las reacciones inflamatorias de las células inmunitarias innatas residentes o infiltradas pueden tener un impacto significativo en la patogénesis de los trastornos neurodegenerativos . Un actor central reconocido es la microglía, una célula glial que pertenece al linaje mieloide y que a menudo se indica como el macrófago del SNC. Esta nueva e intrigante idea puede implicar que los fármacos con eficacia demostrada en la protección de los órganos periféricos contra la función citotóxica de las células inmunitarias innatas, como los fagocitos mononucleares o polimorfonucleares (respectivamente, MNCs y PMNs), también podrían ser útiles para el tratamiento del componente neuroinflamatorio de las enfermedades neurodegenerativas. Uno de los principales obstáculos que deben superar los fármacos es atravesar la barrera hematoencefálica y penetrar en el parénquima del SNC, donde tiene lugar el proceso neurodegenerativo. En esta revisión discutiremos los estudios preclínicos que destacan el potencial de la apocinina, un pequeño antioxidante fenólico, como tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas.

2. La apocinina, un fenol vegetal farmacológicamente activo

La apocinina (4′-hidroxi-3′-metoxiacetofenona o acetovanillona) fue identificada como la sustancia biológicamente activa en las raíces de Picrorhiza kurroa Royle ex Benth, una planta perenne que crece en el Himalaya alpino. Los extractos de las raíces se utilizan en la tradición médica ayurvédica de la India y Sri Lanka para la preparación de medicamentos étnicos para el tratamiento de dolencias del hígado, el corazón, las articulaciones y los pulmones. Hemos preparado un extracto etanólico de la raíz al 95% en condiciones controladas en el laboratorio y hemos sometido el preparado a una purificación guiada por la actividad utilizando el estallido oxidativo de los granulocitos polimorfonucleares/neutrófilos (PMN) humanos como prueba experimental de la inflamación aguda.

El ensayo de lectura que hemos utilizado se basa en la generación de quimioluminiscencia potenciada por luminol por parte de los PMN humanos estimulados con zymosan opsonizado en suero humano. La esencia del ensayo es que las partículas de levadura opsonizadas en suero estimulan a los PMN a través de receptores de inmunoglobulinas o factores del complemento expuestos en la superficie. Las señales de activación transmitidas a través de estos receptores conducen al vaciado de los gránulos citoplasmáticos (degranulación) y al ensamblaje de la NADPH oxidasa fagocítica Nox2. El complejo enzimático Nox2 se ensambla a partir de subunidades unidas a la membrana (, ) y al citoplasma (, , y Rac2). El proceso de ensamblaje implica la fosforilación de las subunidades por quinasas específicas y la formación de puentes de tiol. El complejo ensamblado toma los electrones del NADPH y los transfiere al oxígeno molecular libre dando lugar a la formación de anión superóxido (; reducción de un electrón) y peróxido de hidrógeno (H2O2; reducción de dos electrones). Ambos oxidantes tienen actividad citotóxica como se ha podido demostrar utilizando glóbulos rojos de diferentes especies. El estallido oxidativo de los PMN comprende una cascada de especies de oxígeno fuertemente reactivas, indicadas colectivamente como ROS (Figura 1). Al reaccionar con el óxido nítrico se forma el peroxinitrito, que es fuertemente citotóxico. En presencia de iones Fe2+, el H2O2 se convierte en radicales hidroxilo (OH-) altamente reactivos, que a través de la peroxidación de los lípidos de la membrana afectan a la fluidez de las membranas celulares. La mieloperoxidasa liberada por la degranulación de los PMN cataliza la reacción del H2O2 con moléculas de haluro (Cl2, Br2 y J2) formando hipohaluros altamente tóxicos (OCl-, OBr- y OJ-). Las ERO son componentes esenciales de la eliminación intracelular de los microbios fagocitados, pero cuando se liberan en el medio extracelular son importantes mediadores de la actividad destructiva tisular de los PMN activados.

Figura 1

Especies reactivas de oxígeno producidas en la explosión oxidativa de los fagocitos. MPO: mieloperoxidasa; NOS: óxido nítrico (NO) sintasa.

Puede preverse que los componentes de los extractos vegetales químicamente complejos pueden interferir con el ensayo de lectura a múltiples niveles y también pueden ejercer efectos inespecíficos como la muerte de los PMN o la eliminación de los oxirradicales. Esto implica que el éxito de la purificación guiada por la actividad debe estar bien enfocado y controlar cuidadosamente los efectos no específicos para evitar resultados falsos positivos. A pesar de estos obstáculos, pudimos demostrar una actividad altamente específica de la apocinina en el ensayo. Se descubrió que la apocinina se activaba metabólicamente en una reacción catalizada por la MPO con el H2O2 formando un dímero simétrico, la diapocinina (Figura 2). La observación de que el intermedio de la reacción podía ser atrapado con GSH nos llevó a plantear la hipótesis de que la apocinina activada metabólicamente podría bloquear la formación de puentes de tiol entre los componentes unidos a la membrana y los citosólicos que ensamblan la Nox2 funcional. Sin embargo, posteriormente se descubrió que la apocinina inhibe directamente la producción de superóxido de la Nox2 y que esta actividad es independiente de la MPO . Un hallazgo importante con la apocinina ha sido que inhibe el estallido oxidativo de los PMN, sin impedir la muerte intracelular de las bacterias. Esto implica que el tratamiento con apocinina puede prevenir los daños colaterales en los tejidos infiltrados por los PMN activados sin impedir su función bactericida.

Figura 2

Inhibición de la Nox2 de la microglía por la apocinina activada metabólicamente. La activación mediada por receptores de las células de la microglía induce la producción de especies reactivas de oxígeno y la liberación de mieloperoxidasa (MPO). La reacción de la apocinina con H2O2, catalizada por la MPO, da lugar a la producción de un intermediario reactivo que se estabiliza mediante la unión a grupos tiol libres, por ejemplo, GSH, o por dimerización. La apocinina dimérica (diapocinina) inhibe la actividad de Nox2.

3. Eficacia de la apocinina en modelos animales AIMID

La enfermedad objetivo inicial en la que probamos el efecto clínico de la apocinina fue el modelo de rata WAG/Rij (RT-) de artritis inducida por colágeno (CIA), que es un modelo preclínico aceptado de la enfermedad inflamatoria autoinmune (AIMID) artritis reumatoide (AR). En este modelo, los PMN tienen un claro papel patogénico, que refleja la situación de los pacientes con AR. En el estudio con ratas se optó por administrar apocinina en un rango de dosis de 0,3 a 200 μg/mL de agua potable, que se suministró ad libitum. Se observó que ya en la dosis más baja de 0,3 μg/mL, correspondiente a una dosis oral diaria de 6 μg, la artritis se suprimió casi por completo . No se observó ningún efecto de la apocinina sobre los niveles séricos de autoanticuerpos anticolágeno o de IL-6, una importante citoquina patógena en la CIA y la AR, lo que sugiere una alta selectividad para el componente inflamatorio de la enfermedad. Independientemente de nosotros, Hougee et al. demostraron en un modelo de CIA de ratón que la apocinina administrada por vía oral restablece la producción bloqueada de proteoglicano de cartílago en la articulación artrítica . Un efecto secundario intrigante del tratamiento, que ilustra el potente efecto antiinflamatorio de la apocinina, fue la dramática supresión de las lesiones cutáneas necrotizantes en los lugares donde se inyectó la formulación inmunizante de antígeno/CFA .

Desde su identificación inicial como potente agente antiinflamatorio en 1990, la apocinina se ha convertido en un inhibidor establecido del estallido oxidativo de los neutrófilos, como se ha demostrado en una amplia gama de modelos in vivo de trastornos inflamatorios inmunomediados que afectan a órganos periféricos y centrales. De particular importancia para esta revisión son los prometedores efectos clínicos observados en modelos de enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la ELA, el Alzheimer y la enfermedad de Parkinson. En estos modelos, la actividad antioxidante de la apocinina no se dirige a los neutrófilos, sino a los «macrófagos del cerebro», es decir, a la microglía.

4. Microglía

El cerebro contiene varios tipos de células con capacidad para ejercer funciones inmunitarias, entre las que se encuentran los astrocitos, las células de la microglía y los macrófagos situados en las meninges y los espacios perivasculares de las arterias y los capilares cerebrales . Para sus tareas inmunitarias, estas células están equipadas con receptores conservados para patrones moleculares asociados a patógenos o a daños, que transmiten señales de activación a las células para inducir mecanismos efectores inflamatorios.

La microglía es una célula inmunitaria innata distribuida de forma ubicua en el sistema nervioso central, donde participa en estrechas interacciones con neuronas, oligodendrocitos y astrocitos. Sin embargo, sólo la microglía libera MPO tras la estimulación, siendo un requisito para la activación metabólica de la apocinina.

La microglía en el SNC sano tiene un fenotipo de reposo ramificado. Frente a conceptos anteriores, la microglía en el cerebro sano no está en reposo, sino que son células muy dinámicas que llevan a cabo una vigilancia homeostática del entorno extracelular mediante la extensión y retracción de sus protuberancias y la fagocitosis de los restos tisulares, que de otro modo podrían causar inflamación . La microglía activada se encuentra en el tejido enfermo del SNC, como en las lesiones de materia gris cortical desmielinizada en el cerebro de la esclerosis múltiple, alrededor de las placas amiloides en el cerebro de la enfermedad de Alzheimer y en la sustancia negra degenerada en la enfermedad de Parkinson. Aunque los diversos perfiles de expresión de la microglía parecen reflejar un amplio y continuo espectro de estados de activación, pueden reconocerse dos estados de activación en ambos extremos del espectro que corresponden a los estados M1 y M2 designados para los macrófagos . La microglía M1 «clásicamente activada», por ejemplo, inducida por LPS o IFNγ, tiene funciones proinflamatorias que se ejercen mediante la secreción de citoquinas proinflamatorias como TNF-α, IL-1β e IL-12 y sustancias tóxicas como especies reactivas de oxígeno y nitrógeno. La microglía M2 «activada alternativamente», como la inducida en un entorno que contiene niveles elevados de IL-4 o IL-13, tiene actividades antiinflamatorias y de regeneración de tejidos, que están mediadas por citoquinas como la IL-4, la IL-10 o el TGF-β y factores de reparación como el factor de crecimiento similar a la insulina, la arginasa-1 o la quitinasa-1. No sólo el entorno de citoquinas, sino también el estado redox del microambiente, que está directamente relacionado con la actividad de la NADPH oxidasa, determina la diferenciación funcional de la microglía hacia un fenotipo M1 o M2.

5. La apocinina como tratamiento potencial de las enfermedades neurodegenerativas

Las células de microglía M1 son el principal recurso de Nox2 en el cerebro. La expresión por parte de la microglía M1 de Nox2 activada que produce ROS es un componente esencial de la neurotoxicidad mediada por la microglía. La noción ampliamente aceptada de que las ROS derivadas de la microglía son importantes mediadores de la lesión cerebral neurodegenerativa plantea la cuestión de si el perfil farmacológico favorable y la baja toxicidad de la apocinina pueden utilizarse para el tratamiento neuroprotector. Las células de la microglía no sólo expresan Nox2, sino que también segregan MPO tras su activación, por lo que podrían ejercer una activación metabólica de la apocinina. Varios autores han informado sobre el efecto beneficioso de la apocinina en (modelos de) trastornos neurológicos agudos, como la isquemia, la hemorragia intracerebral y el accidente cerebrovascular (revisado en ). ¿Cuáles son las perspectivas de la apocinina en los trastornos neurodegenerativos crónicos?

Los estudios in vitro con microglía cultivada han implicado a las ROS derivadas de Nox2 en la proliferación y polarización funcional de la microglía . Un hallazgo crucial ha sido que la inhibición de Nox2 promueve la activación alternativa y antiinflamatoria de la microglía durante la neuroinflamación . Esto implica que la supresión de Nox2 con apocinina podría restaurar un equilibrio saludable entre un fenotipo M1 proinflamatorio y un fenotipo M2 antiinflamatorio/proregenerativo de la microglía. Otros han demostrado que la apocinina reduce la producción de IL-1β, TNF-α y óxido nítrico por parte de la microglía, interrumpiendo así un ciclo autoperpetuado de actividad perjudicial. Aunque el mecanismo neurotóxico exacto de la microglía activada en las enfermedades neurodegenerativas sigue siendo incierto, también es muy interesante que la liberación de la excitotoxina glutamato requiera la actividad de Nox2 y que ésta pueda ser inhibida por la apocinina. En conjunto, estos datos sugieren un papel potencialmente beneficioso de la apocinina en las enfermedades neurodegenerativas. De hecho, se han observado efectos prometedores de la apocinina en modelos de ratón de algunas de las principales enfermedades neurodegenerativas.

Esclerosis lateral amiotrófica (ELA, enfermedad de Lou Gehrig). La esclerosis lateral amiotrófica es una enfermedad neurodegenerativa común de inicio en la edad adulta que afecta a las neuronas motoras. La enfermedad conduce a un deterioro motor de rápida progresión y a la muerte, generalmente en un plazo de 5 años. Mientras que en la mayoría de los pacientes se desconoce la causa de la enfermedad, en un subgrupo de casos la enfermedad tiene una causa genética, concretamente, mutaciones en el gen de la superóxido dismutasa-1 (SOD1). La mutación aumenta el estrés oxidativo por la producción desregulada del anión superóxido debido a la reducción de la dismutación a H2O2. Los astrocitos mutantes que expresan SOD1 están relacionados con la patología de la ELA debido a su reducida capacidad de absorción de glutamato y/o por su liberación de factores neurotóxicos . El silenciamiento selectivo de la SOD1 mutante o la sustitución de la microglía mutante por la de tipo salvaje en el modelo de ratón SOD1 mutante apuntan fuertemente a un papel patogénico central de la microglía. Harraz et al. han utilizado la apocinina oral para controlar la progresión de la neurodegeneración en un modelo de ratón mutante de SOD1 y han observado efectos prometedores; se observó que la administración de apocinina en el agua de bebida prolongaba significativamente la supervivencia y retrasaba la aparición de defectos motores. Este estudio muestra que la apocinina administrada por vía oral puede acumular una concentración suficientemente alta dentro del parénquima del SNC para mitigar los niveles neurotóxicos de producción de ROS. Sin embargo, estos prometedores datos no pudieron reproducirse en otro estudio en el que se utilizó la misma cepa de ratones mutantes.

Enfermedad de Alzheimer (EA). La enfermedad de Alzheimer es un trastorno neurológico progresivo asociado al envejecimiento que conduce a una demencia irreversible. Las características neuropatológicas de la EA son las placas seniles de agregados amiloides-β mal plegados y fibrilares y los ovillos intraneuronales de proteína tau en la corteza cerebral. Se encontraron células de microglía activadas agrupadas alrededor de las placas seniles produciendo agentes neurotóxicos como ROS, NO y TNF-α. Se ha informado de la activación de la Nox2 de la microglía por el amiloide-β oligomérico y/o fibrilar y de la expresión de la Nox2 activada en el cerebro de Alzheimer.

Lull et al. han probado la apocinina en una dosis oral diaria de 10 mg/kg a través del agua de bebida en un modelo de ratón transgénico hAPP de EA . Observaron en los ratones tratados con apocinina una reducción significativa del tamaño de las placas en la corteza y el hipocampo y una reducción del número de microglías en la corteza, pero no en el hipocampo. Sin embargo, una característica conductual de la EA observada en este modelo de ratón, es decir, el rendimiento en la prueba de natación del laberinto acuático de Morris, que pone a prueba la memoria espacial organizada en el hipocampo, no mejoró notablemente con el tratamiento. El limitado efecto clínico de la apocinina en el modelo podría deberse a la ausencia de una clara neuroinflamación, mientras que ésta es más prominente en los pacientes con EA, y al hecho de que la formación de placas no predice necesariamente el deterioro cognitivo.

Enfermedad de Parkinson (EP). El sello patológico de la EP es una degeneración progresiva de las neuronas productoras de dopamina en la sustancia negra (SN), una estructura pigmentada situada en la parte inferior del cerebro medio. A través de la liberación de dopamina, la SN tiene un papel central en la coordinación de varias funciones neurológicas, incluyendo la recompensa, la adicción y el movimiento. Esta última función está especialmente alterada en la EP. Para compensar la pérdida de dopamina, se administra un precursor metabólicamente estable de la dopamina (L-DOPA), que en un número considerable de pacientes provoca los típicos movimientos involuntarios conocidos como síndrome hipercinético. Mientras que en la gran mayoría de los pacientes con EP (esporádica) se desconoce la causa de la enfermedad, en una pequeña fracción se ha encontrado una causa genética, a saber, mutaciones en varios genes, como la alfa-sinucleína, la parkina, la quinasa 2 rica en leucina, la quinasa putativa 1 inducida por PTEN y el ATP13A2. La observación de que los consumidores de heroína contaminada con MPTP desarrollaban síntomas de EP permitió generar un modelo animal de EP clínicamente relevante. Tras la conversión del MPTP en MPP+ por la monoamino oxidasa B en los astrocitos, el MPP+ se concentra en las células dopaminérgicas a través del transportador específico de la dopamina, donde bloquea el complejo I de la cadena respiratoria mitocondrial. El consiguiente estrés redox provoca, entre otras cosas, una desregulación del Ca2+ celular que conduce a la muerte celular. Al igual que en la ELA y la EA, la neurodegeneración en la EP está asociada a la activación de la microglía Nox2, que se cree que contribuye significativamente al proceso patogénico.

Usando un sistema in vitro, Gao et al. demostraron que las ROS generadas por la microglía Nox2 aumentan la sensibilidad de las neuronas dopaminérgicas al MPP+. Se ha demostrado un efecto beneficioso de la apocinina sobre los efectos neurotóxicos mediados por la microglía en un modelo de ratón de EP.

6. El efecto de la apocinina en un modelo de enfermedad de Parkinson en primates no humanos

La inyección repetitiva de una dosis baja de MPTP en el tití común, un primate neotropical de cuerpo pequeño, provoca una enfermedad neurológica que a nivel de presentación clínica y neuropatológica se aproxima mucho a la EP. Hemos utilizado este modelo de MPTP en 5 titíes gemelos para comprobar si la apocinina oral es también eficaz en una especie superior. Para la administración oral, la apocinina se disolvió en goma arábiga; a un hermano de cada gemelo se le administró la goma que contenía apocinina y al otro sólo la goma. El tratamiento con apocinina (100 mg/kg, TID) comenzó una semana antes de la inducción de la EP con MPTP (1 mg/kg, vía inyección subcutánea durante 8 días). La apocinina limitó la típica pérdida de peso corporal asociada al síndrome parkinsoniano. También mejoró la función motora en los monos tratados con apocinina, lo que indica una eficacia antiparkinsoniana de la apocinina. Además, el número de neuronas dopaminérgicas supervivientes aumentó con la apocinina, lo que indica una eficacia neuroprotectora. Sorprendentemente, la apocinina tiene una estructura molecular similar a la del ácido homovanílico (HVA), un metabolito de la dopamina. Una explicación de la eficacia protectora de la apocinina en la EP podría estar también relacionada con la compensación del nivel reducido del HVA o-metoxicacetol natural disponible.

7. Perspectiva para el tratamiento de pacientes humanos

La apocinina es un profármaco oral potencialmente atractivo debido a su baja toxicidad general y al hecho de que su acción antioxidante específica es provocada después de la activación metabólica por las células fagocíticas que liberan MPO. Los datos de seguridad de la apocinina son escasos, pero los disponibles muestran una baja toxicidad y una gran estabilidad (revisados en parte en ). La DL50 tras una dosis oral en ratones se ha estimado en 9 g/kg. En ratas, alrededor del 80% de la apocinina inyectada por vía intraperitoneal a 120 mg/kg se recuperó en forma inalterada en una muestra de orina recogida 20 horas después. Una dosis intravenosa de 420 mg/kg de apocinina en ratones causó signos mínimos de toxicidad.

Hasta donde sabemos, la apocinina no ha sido probada en pacientes humanos con enfermedades neurodegenerativas. Sin embargo, Peters et al. han evaluado el potencial terapéutico de la apocinina inhalada sobre la hiperreactividad bronquial inducida por el ozono a la metacolina en pacientes asmáticos como modelo de enfermedad pulmonar inflamatoria . Los autores pudieron excluir la eliminación del ozono por parte de la apocinina y concluyeron que el efecto era la mitigación de la producción de ROS por parte de los PMN y los eosinófilos que se habían infiltrado en el pulmón tras la exposición al ozono.

Los estudios con ratones analizados en esta revisión muestran que dosis bajas de apocinina administradas por vía oral alcanzan el parénquima del SNC en una concentración suficiente para inhibir el estallido oxidativo de la microglía e inhibir la neurodegeneración. Teniendo en cuenta la muy baja toxicidad sistémica y el modo de acción altamente específico de la apocinina, sería una perspectiva atractiva para probar el valor terapéutico en la enfermedad neurodegenerativa humana.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no existe ningún conflicto de intereses en relación con la publicación de este trabajo.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer al Sr. Henk van Westbroek (BPRC) la preparación del material gráfico.