Asociación de los genotipos del VPH con las verrugas anogenitales externas: un estudio transversal
Diseño del estudio y participantes
Se realizó un estudio transversal que utiliza una muestra no probabilística. Los pacientes que asisten a las clínicas de dermatología en el Área de Distrito de Salud de Farwania fueron reclutados en el estudio consecutivamente desde noviembre de 2016 hasta mayo de 2017. A los pacientes inmunocompetentes con diagnóstico clínico previo de verrugas anogenitales externas programados para tratamiento con crioterapia o láser se les pidió que firmaran el formulario de consentimiento tras una explicación verbal del dermatólogo solicitando su participación. En el momento de la toma de muestras, las muestras de verrugas se recogieron en un medio de transporte universal (HealthLink Inc., Copan Italia S.p.A., Italia), y se almacenaron a – 80 °C. Se obtuvo la aprobación ética del Comité Ético del Centro de Ciencias de la Salud (Número: VDR/EC/2310) y del Ministerio de Sanidad.
Se tomó información demográfica y clínica de cada paciente, incluyendo: edad (años), sexo (hombre, mujer), nacionalidad (kuwaití, no kuwaití), número de verrugas (una, entre dos y cuatro, y al menos cinco), duración de la presencia de verrugas (< un mes, entre uno y seis meses, entre siete y 12 meses, y más de 12 meses), tamaño de cada verruga (en centímetros) (< una, uno, entre uno y dos, más de dos), compañeros tiene verrugas (sí, no), y si las verrugas fueron objeto de tratamiento previo (sí, no). Ninguno de los participantes recibió la vacunación contra el VPH, porque la vacunación contra el VPH aún no se ha implementado en Kuwait, aunque su implementación se está discutiendo actualmente en el Ministerio de Salud.
Extracción de ADN y controles
Las muestras de tejido recibidas se almacenaron a – 80 °C. Debido al gran número de muestras recibidas, todas las verrugas por paciente se picaron juntas y se sometieron a un solo aislamiento de ADN. El tejido se picó con tijeras y pinzas estériles en una placa de Petri y se pesaron unos 25 mg de tejido. El tejido se lavó en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se transfirió a tubos Eppendorf de 1,5 ml. El ADN genómico se extrajo de las muestras de tejido utilizando un kit QIAmp DNA Mini (Qiagen, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Los vectores del VPH tipo 2, VPH tipo 1 y VPH tipo 16 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, EE.UU.) se utilizaron como controles en los experimentos de PCR.
PCR en tiempo real
El ensayo de PCR en tiempo real se llevó a cabo para detectar el ADN del VPH en las verrugas genitales. Se combinaron cinco microlitros (5-μl) del ADN extraído con 12,5-μl de la mezcla maestra 2X Syber Green (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) que contenía ROX como referencia pasiva, y 10 pmol de cebadores directos e inversos (10-uM, descritos a continuación). Todos los conjuntos de cebadores fueron sintetizados por Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, Estados Unidos. La mezcla se completó hasta un volumen de 25-μl con agua libre de nucleasas (Ambion, Austin, TX, EE.UU.). Para reducir el número de resultados falsos positivos o negativos, las muestras se analizaron por duplicado en una placa de reacción de 96 pocillos ópticos (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Se incluyeron controles positivos y negativos en cada lote de amplificación. Para cuantificar el VPH en las muestras, se realizó una dilución en serie de cinco a diez veces del ADN de control positivo conocido junto con las muestras. La amplificación por PCR en tiempo real se llevó a cabo en el ABI 7500 real-time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
El ensayo de PCR en tiempo real se llevó a cabo en tres placas diferentes. La primera placa se utilizó para determinar la integridad del ADN diana mediante el ensayo de PCR de β-globina, amplificando un fragmento diana de 268 pb, tal y como describieron previamente Lum y Le Marchand en 1998 . La secuencia de nucleótidos de los cebadores de β-globina es la siguiente: Cebador de β-globina hacia delante: 5′-TGGTTTCTGATAGGCACTGACT-3′. Cebador de PCR inversa de β-globina: 5′-AACAGCATCAGGAGTGACAGAT-3′.La amplificación de la PCR se inició a 95 °C durante diez minutos y se completó con 45 ciclos de amplificación (desnaturalización a 95 °C durante 15 s, recocido a 55 °C durante 45 s y extensión a 65 °C durante un minuto).
La segunda placa se utilizó para detectar la presencia de la infección por el VPH utilizando cebadores MY11/GP6 del ORF del VPH L1 . Las secuencias de nucleótidos de los cebadores MY11/GP6 son las siguientes: Cebador MY11 hacia delante: 5′- GCM CAG GGW CAC AAY AAT GG -3′ y cebador GP6 hacia atrás: 5′- GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC-3′. El tamaño esperado del fragmento amplificado es de 185 pb. La amplificación por PCR se inició a 95 °C durante diez minutos y se completó con 45 ciclos de amplificación (desnaturalización a 95 °C durante 15 s, recocido a 45 °C durante 45 s y extensión a 65 °C durante un minuto).
La tercera placa se utilizó para detectar la presencia de infección por VPH utilizando los cebadores HVP2/B5 del ORF del VPH L1 . Las secuencias de nucleótidos de los cebadores HVP2/B5 son las siguientes Cebador HVP2 hacia delante: 5′- TCN MGN GGN CAN CCN YTN GG -3′; Cebador B5 hacia atrás: 5′- AYN CCR TTR TGN CCY TG -3′. El tamaño esperado del fragmento amplificado es de 650 pb. La amplificación por PCR se inició a 95 °C durante diez minutos y se completó con 45 ciclos de amplificación (desnaturalización a 95 °C durante 15 s, recocido a 50 °C durante 45 s y extensión a 65 °C durante un minuto).
Se registraron los espectros de fluorescencia durante la fase de elongación de cada ciclo de PCR. Se utilizó el software de detección de secuencias (SDS v1.7) de la PCR en tiempo real ABI 7500 para generar la curva de amplificación de cada reacción. Se generó una curva de disociación después de cada reacción para diferenciar entre amplicones específicos y no específicos. Sobre la base de la curva de amplificación, se seleccionaron para el análisis todas las muestras con amplificación del VPH a partir de cualquier ciclo y hasta el número de ciclo 40 (con una línea de corte de 0,2). Sólo se consideraron positivas para el ADN del VPH las muestras con una curva de disociación entre 70 °C y 80 °C y con un valor de derivación entre 0,100-0,500.
Secuenciación de Sanger
El ADN del VPH en las verrugas se amplificó mediante PCR anidada antes de la secuenciación, utilizando la AmpliTaq Gold Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) Se utilizaron los cebadores HVP2/B5 en la primera PCR, y los cebadores CN1F/CN1R, CN2F/CN2R, CN3F/CN3R y C4F/C4R en la segunda PCR. La primera amplificación por PCR se inició a 95 °C durante diez minutos y se completó con 35 ciclos de amplificación (desnaturalización a 95 °C durante 15 s, recocido a 50 °C durante 45 s y extensión a 68 °C durante un minuto). La segunda amplificación de la PCR se llevó a cabo utilizando 3 μl del primer producto de la PCR, y las mismas condiciones de ciclado. Los genotipos de VPH de amplio espectro que se espera detectar en las verrugas cutáneas utilizando los cebadores HVP2/B5 y CN1F/CN1R, CN2F/CN2R, CN3F/CN3R y C4F/C4R incluyen tipos de VPH de los géneros alfa (VPH 2, 3, 7, 10, 27, 28, 29, 40, 43, 57, 77, 91 y 94), gamma (VPH 4, 65, 95, 48, 50, 60 y 88), mu (VPH 1 y 63) y nu (VPH 41) .
Los productos de la PCR se purificaron utilizando un kit de purificación de la PCR (NucleoSpin Extract II PCR Purification Kit, Macherey-Nagel GmbH & Co.KG, Düren, Alemania) según las instrucciones del fabricante. A continuación, se sometieron a una reacción de secuenciación Sanger utilizando la mezcla de secuenciación cíclica BigDye terminator v3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.), y los cebadores de PCR anidados descritos anteriormente. Se realizaron purificaciones de PCR posteriores a la secuenciación para eliminar los desoxi-terminadores de tinte fluorescente no unidos utilizando el kit de purificación BigDye XTerminator™ (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Las muestras se desnaturalizaron durante 2 minutos a 95 °C e inmediatamente se enfriaron en hielo y se cargaron en un analizador genético ABI 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Las muestras se electroforizaron en una matriz capilar de 50 cm utilizando el polímero POP 6 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) como medio de separación.
Las muestras se analizaron utilizando el software Sequencing Analysis v 3.7 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). La alineación de la secuencia del VPH se realizó con las secuencias presentadas en la base de datos GenBank utilizando el software BLASTn (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) y la base de datos del VPH de Biología Teórica y Biofísica del Laboratorio Nacional de Datos de Los Álamos (https://pave.niaid.nih.gov/).
Cuando las secuencias obtenidas eran de baja calidad debido al bajo rendimiento del producto de la PCR, los productos de la PCR se clonaron en el vector pGEM-T Easy (Promega, Madison, WI) tras la purificación con el kit Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega), y la secuenciación de los insertos se realizó utilizando cebadores M13 forward y reverse.
Análisis estadístico
Los datos del diagnóstico clínico, los datos demográficos y el análisis virológico se tabularon y analizaron utilizando el software estadístico SPSS ‘Statistical Package for Social Sciences, SPSS version 25.0’ (IBM Corp, Armonk, NY, USA). Se calcularon las estadísticas descriptivas: frecuencias/porcentajes, medidas de centro y dispersión. Para comprobar la igualdad de medias, se utilizó la prueba t de dos muestras para todas las variables continuas cuando se mantenía la normalidad; en caso contrario, se utilizó la prueba U de Mann Whitney. Para comparar las medias de tres grupos, se utilizó el análisis de la varianza o la prueba de Kruskal-Wallis en función de que se cumplieran los supuestos. Para comprobar las asociaciones entre dos variables categóricas se utilizó la prueba de chi cuadrado de Pearson para la independencia o la prueba exacta de Fisher cuando se cumplían los supuestos. Para modelizar un resultado binario con un conjunto de covariables, se aplicó la regresión logística y se estimaron las odds ratio crudas y ajustadas y sus intervalos de confianza del 95%. Todas las pruebas fueron de dos colas y un valor P inferior al 5% se consideró estadísticamente significativo.