Beta-Ensayo de galactosidasa (A mejor Miller)

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Antecedentes

β-La galactosidasa está codificada por el gen lacZ del operón lac en E. coli. Es una proteína grande (120 kDa, 1024 aminoácidos) que forma un tetrámero. La función de la enzima en la célula es escindir la lactosa en glucosa y galactosa para que puedan ser utilizadas como fuentes de carbono/energía. El compuesto sintético o-nitrofenil-β-D-galactósido (ONPG) también se reconoce como sustrato y se escinde para producir galactosa y o-nitrofenol, que tiene un color amarillo. Cuando el ONPG está en exceso sobre la enzima en una reacción, la producción de o-nitrofenol por unidad de tiempo es proporcional a la concentración de β-Galactosidasa; por lo tanto, la producción de color amarillo puede utilizarse para determinar la concentración de enzima.

Entonces, ¿por qué nos importa? Normalmente, los experimentos se diseñan de forma que la concentración de β-Galactosidasa en la célula sea una lectura de algún aspecto de un sistema que se está estudiando. Por ejemplo, un investigador puede fusionar un promotor con el gen lacZ y utilizar los niveles de β-Gal como indicador de la actividad del promotor en diversas condiciones. En 1972, Jeffrey Miller publicó «Experiments in Molecular Genetics», que contenía un protocolo para determinar la cantidad de β-Gal con ONPG. Debido a esto, los ensayos ONPG/β-Gal se denominan ensayos «Miller», y una cantidad estandarizada de actividad β-Gal es una «Unidad Miller».

1 Unidad Miller = \displaystyle{ 1000 * \frac{(Abs_{420} – (1,75*Abs_{550}))}{ t * v * Abs_{600}}. }

donde:

• Abs420 es la absorbancia del o-nitrofenol amarillo,
• Abs550 es la dispersión de los restos celulares, que, multiplicada por 175 se aproxima a la dispersión observada a 420 nm,
• t = tiempo de reacción en minutos,
• v = volumen de cultivo ensayado en mililitros,
• Abs600† refleja la densidad celular.

†Tenga en cuenta que este valor es diferente para cada espectrofotómetro que se utilice y que debe calibrarse chapando diluciones de cultivos de Abs600 conocidos para determinar las unidades formadoras de colonias por Abs600.

En su libro, el Dr. Miller explica que esta fórmula produce aproximadamente 1 unidad Miller para E. coli no inducida (baja producción de β-Gal) y aproximadamente 1000 unidades para un cultivo totalmente inducido (crecido con lactosa o IPTG).

En mi experiencia, los cultivos de MG1655 inducidos con 1 mM de IPTG en fase logarítmica tienen 1500-1800 unidades Miller. La razón de la diferencia no se conoce, pero sospecho que se debe a las diferencias en la densidad de Abs600/células entre el espectrofotómetro del Dr. Miller y el que yo utilizo y al hecho de que yo hago mis ensayos Miller a 30 °C (por comodidad) mientras que el Dr. Miller realizó sus ensayos a 28 °C. He realizado fusiones de promotores que generan ~40.000 unidades Miller; sin embargo, como se discutirá más adelante, esto es demasiado alto para el ensayo y por ello se modificó el protocolo para reducir este valor.

Protocolo

El protocolo que utilizo se deriva de un trabajo de Zhang y Bremer (JBC 270, 1995, ¡Texto completo gratuito!) en el que el protocolo original de Miller se simplificó en gran medida para permitir la medición de más muestras con menos manipulación.

En resumen, el protocolo consiste en medir la densidad celular de un cultivo de bacterias (Abs600), y luego extraer una alícuota de las células de la cubeta y mezclarlas con una solución de «permeabilización» que contiene detergente que interrumpe las membranas celulares (pero deja intacta la β-Gal). Esto mata a las células y detiene la traducción. Tras la incubación, se añade una solución de «sustrato» ONPG y se deja que se desarrolle el color amarillo. A continuación, se añade una solución de «parada» y se mide la absorbancia del o-nitrofenol.

1. Haga crecer los cultivos en las condiciones que desee probar.
2. Durante el crecimiento, mida previamente alícuotas de 80 μL de solución de permeabilización en tubos de microfuga de 1.5 mL y ciérrelos.
3. Medir Abs600 y ¡GRABARLO!
4. Retirar una alícuota de 20 μL del cultivo y añadirla a los 80 μL de solución de permeabilización.

La muestra es ahora estable durante varias horas. Esto le permite realizar experimentos de curso temporal.

1. Después de tomar la última muestra, traslade las muestras y la solución de sustrato a la sala caliente de 30 °C durante 20-30 minutos.
2. Agregue 600 μL de solución de sustrato a cada tubo y anote el tiempo de adición.
3. Después de que se haya desarrollado suficiente color, agregue 700 μL de solución de parada, mezcle bien y anote el tiempo de parada.
4. Después de detener la última muestra (algunas pueden tardar más que otras, pero generalmente se terminan en 30-90 minutos), transfiera los tubos a una microfuga y centrifugue durante 5-10 minutos a máxima velocidad.
5. Retire cuidadosamente los tubos de la centrifugadora y transfiera la solución de la parte superior de los tubos a su(s) cubeta(s). Intente evitar que haya material particulado en la cubeta para que la dispersión no influya en la lectura.
6. Registre el Abs420. Este debe ser menor que 1 y mayor que 0,05. Si está un poco fuera de este intervalo, no se preocupe.

Calcule las unidades Miller como:

displaystyle{ 1000 * \frac{(Abs_{420})}((Abs_{600} \text{ de cultivo muestreado})*(\text{volumen})*(\text{tiempo de reacción})}. }

Comentarios sobre el ensayo

• Reshma 11:28, 15 octubre 2007 (CDT): Miller recomienda un cultivo con OD600 = 0,28 a 0,70. Sin embargo, afirma que también se pueden utilizar cultivos de una noche pero que las células de crecimiento exponencial dan ensayos más precisos.

• ¿Cuándo se hace la reacción? Nunca encontré una buena respuesta para esto en la literatura. Si dejé una reacción ir a la terminación, medí un Abs420 de ~2-3. Por supuesto, esto está fuera del rango fiable del espectrofotómetro, pero da una indicación de hasta dónde puede llegar la reacción. Obtuve datos reproducibles cuando el color amarillo era apenas detectable antes de añadir la solución de parada hasta aproximadamente el color del caldo LB antes de parar. Recuerda que necesitas el sustrato para saturar la enzima durante el transcurso de la reacción, así que no dejes que llegue demasiado lejos. Yo hago rutinariamente tres mediciones separadas para cada cultivo y las promedió.
  • Reshma 11:28, 15 octubre 2007 (CDT): Miller recomienda que la lectura de OD420nm debería ser idealmente de 0,6-0,9 .

• Con frecuencia, la gente utiliza cubetas de plástico desechables para medir tanto la turbidez del cultivo como el o-nitropenol amarillo. Según mi experiencia, las cubetas desechables tienen una óptica HORRIBLE: sí, son claras, pero la trayectoria de la luz está patéticamente distorsionada (basta con mirar a través de una a un objeto lejano). Esto no es un gran problema si se utiliza la misma cubeta para el blanco y la muestra y se orienta de la misma manera en el espectrofotómetro. El problema surge cuando se miden muchas muestras diferentes en cubetas distintas. Los valores pueden variar MUCHO incluso para el mismo cultivo medido en diferentes cubetas. Recomiendo utilizar una cubeta de vidrio o cuarzo de alta calidad, o medir las muestras en un lector de placas utilizando placas de 96 pocillos de fondo plano. He comprobado que mi error al pipetear 150 μL de cultivo para las mediciones de Abs600 fue MUCHO menor que al utilizar cubetas desechables. Por supuesto, la turbidez medida debe ser calibrada a células/mL como con una cubeta de 1cm.

• Al girar las muestras y remover cuidadosamente la una muestra del sobrenadante, usted evita tener que medir la dispersión a 550nm y adivinar lo que sería a 420nm.

• Si su reacción tiene demasiado β-Gal, el tubo se volverá amarillo en pocos minutos (o incluso segundos). Esto es demasiado rápido. Una de las mayores contribuciones al error será su estimación del tiempo de reacción. Si las condiciones de la reacción se fijan de manera que dure aproximadamente una hora, los errores de tiempo se vuelven insignificantes. Si necesita ralentizar la reacción, puede utilizar menos células y aumentar la cantidad de tampón de permeabilización para que el volumen siga siendo de 100 μL. Alternativamente, puede rediseñar el sitio de unión al ribosoma de su construcción β-Gal para debilitarlo. Descubrí que si mis células producían 40.000 unidades Miller de β-Gal, estaban muy enfermas por el estrés de traducción. En este caso era mejor debilitar la traducción del ARNm de β-Gal.
  • Hago estas reacciones como hago la cinética de las enzimas. Empiezo las muestras con 10 segundos de diferencia (con la cuenta atrás del tiempo) por lo que es posible obtener tiempos de reacción precisos incluso si sólo dejas que tus reacciones duren unos minutos. Obtengo resultados muy reproducibles con tiempos de reacción de 1,5-30 minutos. Una vez que tengas una idea de cuánto tiempo necesitarán tus reacciones, es fácil agrupar las muestras que necesitarán el mismo tiempo de reacción. Hacer cada muestra por triplicado le dará cierta seguridad de que su tiempo es reproducible.–Kathleen 16:43, 14 de diciembre de 2005 (EST)

• Aquí hay un ejemplo de algunos datos reales que obtuve usando este ensayo. Fue un experimento de curso de tiempo. En cada momento, extraje 1 mL de cada uno de mis cultivos, medí la DO600, tomé tres alícuotas de 20 µL directamente de la cubeta y añadí cada una a 80 µL de solución de permeabilización. Realicé el ensayo exactamente como se ha descrito anteriormente, y todas las muestras se mantuvieron a temperatura ambiente hasta que se terminó el curso temporal. La DO600 de estos cultivos varió de 0,4 a 4 (en mi especificación) en el curso de este experimento y los tiempos de reacción para los ensayos de β-Gal variaron de 2 a 25 minutos. Los tres ensayos individuales de β-Gal para cada punto de tiempo para cada cultura (símbolos rojos o negros) se trazan en el gráfico para ilustrar la reproducibilidad del ensayo dentro de cada experimento.–Kathleen

Recetas

Solución de permeabilización

Se necesitan 80 μL por muestra.

• 100 mM de fosfato sódico dibásico (Na2HPO4)
  • (El protocolo de Zhang tiene 200 mM de fosfato sódico. Nunca pude ponerlo en solución con los otros componentes, sin importar lo que intentara, así que lo reduje a 100 mM. Incluso he utilizado 50 mM sin ningún cambio detectable.)
• 20 mM de KCl
• 2 mM de MgSO4
• 0,8 mg/mL de CTAB (bromuro de hexadeciltrimetilamonio)
• 0.4 mg/mL de desoxicolato de sodio
• 5,4 μL/mL de beta-mercaptoetanol

Solución de sustrato

Se necesitan 600 μL por muestra.

• 60 mM de Na2HPO4
• 40 mM de NaH2PO4
• 1 mg/mL de o-nitrofenil-β-D-Galactósido (ONPG)
• 2.7 μL/mL de β-mercaptoetanol

(El protocolo de Zhang también tiene 20 μg/mL de CTAB y 10 μg/mL de desoxicolato. Yo los dejo fuera pensando que todavía hay mucho de la solución de permeabilización y, si no están muertos todavía, no lo estarán.)

Solución de parada

Se necesitan 700 μL por muestra.

• 1 M de carbonato de sodio (Na2CO3)

El alto pH de la solución de parada desnaturaliza la β-Gal y duplica aproximadamente el color amarillo de la reacción.