Biorreactores en miniatura: prácticas actuales y oportunidades de futuro

Introducción

La llegada de la biología molecular y la tecnología de manipulación genética en el último cuarto de siglo ha tenido un efecto espectacular en las industrias farmacéutica y sanitaria, ya que un gran número de las numerosas aplicaciones de esta tecnología se basan en la capacidad de crear líneas celulares recombinantes para el beneficio terapéutico humano . Además del desarrollo de estos organismos modificados genéticamente, sigue siendo necesario mejorar la productividad de los tipos silvestres, acelerar el cribado de los microbios recién descubiertos y continuar la progresión de las tareas relacionadas, como la mejora del medio de crecimiento y la optimización del proceso. Tradicionalmente, el desarrollo de procesos de cultivo celular ha exigido el cribado de un gran número de líneas celulares en cultivos de frascos agitados y, a partir de ahí, el ensayo posterior de los candidatos exitosos en biorreactores de sobremesa antes de los estudios a escala piloto. La necesidad de llevar a cabo un gran número de cultivos de desarrollo ha dado lugar al avance y al despliegue cada vez más generalizado de sistemas de biorreactores a pequeña escala que ofrecen una solución miniaturizada y de alta tecnología para el desarrollo de procesos.

Los principales tipos celulares utilizados para producir productos terapéuticos son las células bacterianas y las de mamífero, cada una de las cuales posee ventajas y limitaciones únicas que influyen en el tipo de biorreactor utilizado para el desarrollo de procesos. Las células bacterianas suelen ser robustas y no son susceptibles de sufrir daños por cizallamiento, lo que significa que pueden emplearse sistemas de impulsores radiales de alto cizallamiento (por ejemplo, turbinas Rushton) y altas velocidades de agitación. Esto dota a los biorreactores de una gran capacidad de transferencia de masa, lo que permite realizar cultivos de células microbianas de rápida metabolización y alta densidad celular, y aumentar la cantidad de producto que pueden obtener estos bioprocesos. Aunque las células de mamífero no tienen una pared celular protectora y, por tanto, son más sensibles al cizallamiento y requieren una manipulación más suave que sus homólogas bacterianas, la mayoría de las líneas celulares utilizadas comercialmente pueden cultivarse en biorreactores de tanque agitado, aunque con modificaciones de diseño. Por ejemplo, pueden utilizarse impulsores axiales de bajo cizallamiento de tipo marino en lugar de turbinas Rushton para hacer circular suavemente las células y los nutrientes en un entorno libre de deflectores; y pueden añadirse protectores de cizallamiento como suero o Pluronic F-68 a los medios de cultivo celular .

Además del desarrollo de fármacos terapéuticos, los MBR pueden utilizarse para el desarrollo de medios de crecimiento; la mejora de las cepas a través de la ingeniería metabólica o la evolución dirigida; y la llamada bioprospección de productos naturales, todos ellos procesos que conllevan una gran carga de biorreactores que puede aliviarse con el uso de dispositivos en miniatura de HT. En particular, los MBR pueden reducir la intensidad de la mano de obra y el coste de los materiales del gran número de cultivos celulares necesarios en el desarrollo de bioprocesos, aumentando el nivel de paralelismo y el rendimiento alcanzable, por lo que son de creciente interés. Es importante que, cuando se utilicen estos dispositivos para el desarrollo de procesos, se pueda confiar en que imitan con exactitud los biorreactores a escala de laboratorio y piloto, de modo que se pueda esperar que la cinética de crecimiento y la expresión del producto -optimizada a escala en miniatura- se amplíen cuantitativamente.

Aunque indudablemente son más capaces de operar en HT que los biorreactores convencionales a escala de laboratorio, los MBRs suelen estar menos instrumentados y también tienen una oportunidad limitada para el muestreo fuera de línea debido a los pequeños volúmenes utilizados (que van desde aproximadamente 0,1 ml a unos 100 ml); esto significa que actualmente hay un compromiso entre el contenido de la información en términos de calidad y cantidad de datos disponibles del biorreactor obtenidos por la medición en línea y fuera de línea y el rendimiento experimental, ilustrado en la Figura 1. Dado que ningún dispositivo ha resuelto todavía todos los retos de la miniaturización, es decir, la imitación exacta de las condiciones del proceso a gran escala y, sin embargo, la conservación de toda la funcionalidad de los biorreactores convencionales, la intención de los autores es revisar los desarrollos actuales y, a continuación, indicar hacia dónde es probable que progrese la tecnología en el futuro, de modo que se puedan ampliar las ventajas actuales de la HT y se reduzca la brecha de información que existe actualmente entre las plataformas de biorreactores en miniatura y a escala de laboratorio. En esta revisión se han agrupado los distintos MBR descritos en función de su método de agitación (es decir, agitación, agitación o inyección de gas) con referencia al tipo de biorreactor convencional que imitan o del que derivan; las especificaciones y características clave de los dispositivos de cultivo celular en miniatura prototipo y comercializados capaces de funcionar en paralelo se resumen en la Tabla 1.

Sistemas de biorreactores agitados en miniatura

Los sistemas agitados se han utilizado en el bioprocesamiento desde los primeros intentos de hacer crecer cultivos microbianos productores de antibióticos en la década de 1940. Todavía se utilizan ampliamente en la industria y el mundo académico como herramienta para el descubrimiento de fármacos, la optimización de medios, cepas y productos, y el desarrollo de procesos. Comprenden muchos diseños y volúmenes diferentes, que van desde los frascos agitadores de cientos de mililitros hasta las placas de microtitulación (MTP) de unos pocos microlitros de volumen.

Frascos agitadores

Durante los últimos cincuenta años, los científicos han utilizado el cultivo de células en frascos agitadores como medio para el desarrollo de procesos a pequeña escala, con volúmenes que van desde unos 10 ml hasta 500 ml . Los matraces agitados se presentan en una variedad de formas, pueden ser de vidrio o de plástico y algunos tienen deflectores para facilitar la aireación y la mezcla. Pueden agitarse mediante agitación orbital o lineal y pueden alojarse en una cabina de temperatura controlada. Entre los factores que afectan a los cultivos en frascos agitados se encuentran el tamaño del recipiente, el volumen de llenado, el material de construcción, la geometría de los deflectores, la frecuencia de agitación y el tipo de tapón utilizado para sellar el recipiente. Büchs afirma que se calcula que los frascos agitadores se utilizan en más del 90% de los experimentos de cultivo en la industria y el mundo académico, cultivando una amplia gama de microorganismos, como bacterias, hongos y levaduras, así como células de mamíferos. Es fácil ver por qué se utilizan tanto: son una forma barata y eficaz de realizar de forma reproducible muchos tipos de cultivos celulares de relevancia industrial para el desarrollo de procesos. Además, son fáciles de manejar y prácticamente insensibles a las complicaciones mecánicas. Durante la mayor parte del largo periodo en que se han utilizado, apenas se han realizado modificaciones significativas en la tecnología, sin control en línea de los cultivos y con adiciones y muestreos manuales. Sólo recientemente se han introducido los frascos agitadores instrumentados, diseñados para medir y controlar potencialmente los niveles de pH y DOT en línea. El pH y el oxígeno disuelto pueden medirse utilizando un colorante de óxido de rutenio que emite una fluorescencia cuantificable en presencia de iones de hidrógeno u oxígeno, respectivamente, cuando se excita con una lámpara LED. Este colorante puede incorporarse a un parche y adherirse al interior de un matraz o recubrirse en la punta de una sonda de fibra óptica y sumergirse en el cultivo de interés. Otros parámetros que ahora pueden medirse en línea son la tasa de transferencia de oxígeno (OTR) y la tasa de evolución del dióxido de carbono (CER), a partir de las cuales puede obtenerse el cociente respiratorio (RQ). La monitorización de estos parámetros en línea permitiría llevar a cabo estrategias de cultivo celular más sofisticadas, como la alimentación de sustrato basada en los cambios del pH del caldo de cultivo debido al metabolismo celular. Además, Akgün et al. han desarrollado recientemente un novedoso sistema de matraces agitados que es capaz de funcionar de forma continua y, por lo tanto, aumenta el alcance del desarrollo de bioprocesos paralelos utilizando sistemas agitados.

Sin embargo, una de las principales limitaciones de los matraces agitados es su dependencia de la aireación superficial, lo que conduce a una transferencia de oxígeno reducida en relación con los reactores de tanque agitado (STR). Wittmann et al. informaron de valores de coeficiente de transferencia de masa volumétrica global (kLa) de hasta 150 h-1 en matraces de agitación. Se han registrado valores de kLa de 151 h-1 (600 ml, 200 rpm) a 277 h-1 (100 ml, 200 rpm) en un novedoso sistema de matraces de agitación en forma de caja desarrollado por Kato y Tanaka, que son lo suficientemente altos como para realizar la mayoría de los cultivos celulares por lotes sin inhibir el crecimiento microbiano. Estos investigadores incorporaron membranas permeables al gas en las esquinas superiores de sus prototipos de matraces, lo que permitió un flujo de gas más eficaz en el recipiente durante la agitación, superando el problema encontrado en los matraces de agitación convencionales de introducir más aire en el sistema de forma estéril. Para los cultivos en los que la demanda de oxígeno es elevada, la introducción de deflectores puede aumentar la OTR a frecuencias de agitación más bajas; sin embargo, las velocidades elevadas pueden dar lugar a un exceso de salpicaduras que puede provocar la obstrucción del tapón permeable al gas (a menudo hecho de lana de algodón) en la parte superior del matraz por saturación de líquido. Se ha demostrado que una obstrucción de este tipo reduce gravemente la capacidad de transferencia de oxígeno del sistema, lo que podría causar problemas si se cultivara un aerobio de respuesta rápida. La falta de oxígeno podría ralentizar la tasa de crecimiento, alterar las tasas de formación de la producción y/o generar subproductos tóxicos no deseados, por ejemplo, la formación de acetato por parte de Escherichia coli.

Las placas de microtitulación

Las placas de microtitulación (también denominadas placas de micropocillos) se introdujeron por primera vez en 1951 como plataforma para pruebas de diagnóstico y todavía se utilizan ampliamente en las ciencias de la vida. En ellas se realizan pruebas de diagnóstico como los ensayos inmunoenzimáticos que aprovechan la posibilidad de realizar muchas reacciones idénticas en paralelo y a muy pequeña escala. Esta ventaja ha hecho que las PTM se utilicen como biorreactores agitados en miniatura en la fase de cribado del desarrollo de procesos para la evaluación de líneas celulares. Las placas suelen ser de plástico, aunque existen versiones de vidrio y metal. La mezcla puede lograrse mediante la aspiración con pipeta o con barras agitadoras agitadas magnéticamente; sin embargo, el método más común es la agitación orbital de toda la placa sobre un bloque calentado capaz de controlar la temperatura del cultivo. El número de pocillos que contienen las MTPs suele ser de 6, 12, 24, 96 y 384, con hasta 1536 y 3456 pocillos ahora disponibles para el cribado de ultra alto rendimiento (UHTS) . Los pocillos pueden ser rectangulares o cilíndricos, y las geometrías cuadradas favorecen la mezcla y la transferencia de oxígeno imitando la acción de los deflectores. Las placas de fondo cuadrado actúan de forma similar, limitando el vórtice del líquido dentro del pozo y aumentando así la turbulencia del sistema. Debido al aumento de la superficie causada por una mayor disipación del líquido por los lados de cada micropozo y a la mayor fuerza motriz para el oxígeno causada por una mejor mezcla, la OTR es proporcional a la amplitud y la frecuencia de la agitación, por lo que aumentar estos parámetros puede ser beneficioso . Además, Hermann et al. han informado de que la OTR es inversamente proporcional al volumen de llenado, especialmente a frecuencias de agitación más altas. Sin embargo, hay un punto más allá del cual cualquier aumento de la agitación da lugar a un derrame del líquido del proceso (a menos que el pozo esté tapado, lo que tiene sus propios problemas, con la reducción de la transferencia de oxígeno al pozo). Al igual que con los matraces agitados, la capacidad de transferencia de oxígeno relativamente baja de los MTP (valores de kLa de hasta 200 h-1 en placas de 96 pocillos) se deriva del hecho de que son sistemas agitados y dependen de la aireación de la superficie para la transferencia de masa. Por el contrario, Kensey et al. informaron de valores de kLa utilizando el método de oxidación con sulfito de hasta 1600 h-1 en una MTP de 48 pocillos y geometría estándar con lanzamiento orbital de 3 mm a 1400 rpm utilizando un volumen de llenado de 300 μl, lo que es comparable con las RTS convencionales. Mediante el uso de una constante de proporcionalidad calculada, este equipo pudo relacionar la capacidad de transferencia de oxígeno obtenida mediante un método químico con los medios biológicos.

También hay métodos disponibles para determinar kLa a pequeña escala que proporcionan datos directamente comparables con los valores obtenidos en condiciones de proceso. Por ejemplo, Duetz et al. y Doig et al. estimaron kLa por balance de masas en condiciones de limitación de oxígeno a partir del crecimiento lineal de Pseudomonas putida en un MTP y de Bacillus subtilis en un prototipo de reactor de columna de burbujas en miniatura (MBCR), respectivamente. Además, el método de desgasificación dinámica suele ser preferible al método de oxidación con sulfito para la determinación de los valores de kLa, ya que suele realizarse en agua . En consecuencia, este sistema es coalescente y, aunque no es idéntico al medio biológico, es más representativo de las condiciones de cultivo celular que las condiciones totalmente no coalescentes del método del sulfito sódico. Sin embargo, esta técnica es difícil de utilizar en los PTM, ya que a menudo hay que detener la agitación antes de la medición del DOT para obtener lecturas precisas, alterando así el entorno de transferencia de masa en un momento crítico. Debido a los problemas asociados con el uso de métodos establecidos para la determinación de kLa en MTPs, hemos desarrollado recientemente un nuevo método que se basa en la bio-oxidación del catecol por la enzima catecol-2,3-dioxigenasa . Este método ha proporcionado valores de kLa similares a los del método de desgasificación dinámica y, puesto que es rápido y no requiere ninguna suposición sobre la cinética, creemos que este método es muy adecuado para la evaluación de kLa en MTPs y otros dispositivos a pequeña escala.

Los MTPs también sufren hasta cierto punto de la misma característica que los hace atractivos como dispositivo de alto rendimiento – volúmenes pequeños – porque la evaporación puede eliminar una proporción significativa del fluido en el pozo . Se pueden colocar membranas transpirables en la parte superior de las placas para limitar esta evaporación, pero entonces se reduce la capacidad de transferencia de oxígeno. Zimmermann et al. informaron sobre una membrana que lograba un grado moderado de retención de agua y transferencia de oxígeno; sin embargo, los valores de kLa se redujeron en un factor de cinco, agravando aún más el problema de la baja capacidad de transferencia de oxígeno inherente a los sistemas agitados. Aunque la evaporación es un problema potencial en todos los MBR, los MTP parecen ser más susceptibles a ello debido a que suelen utilizar los volúmenes de proceso más pequeños. Los MTPs de 3456 pocillos ofrecen el mayor rendimiento de cualquier dispositivo de cultivo celular en miniatura disponible, y se ha demostrado que pueden sostener cuantitativamente el crecimiento de células de Ovario de Hámster Chino (CHO), aunque un volumen de proceso tan minúsculo (1 – 2,2 μl) significa que este dispositivo probablemente no sería capaz de imitar los mecanismos por los que funcionan los recipientes agitados más grandes; por ejemplo, los efectos de la tensión superficial se extenderían por todo el pocillo, limitando severamente la capacidad de mezcla. Además, no sería posible retirar el medio para el muestreo fuera de línea.

Aunque los MTP se utilizan ampliamente en la investigación de descubrimientos, han sufrido una falta de instrumentación similar a la de los frascos agitadores, lo que limita la gama de datos que pueden recogerse. Sin embargo, recientemente se han desarrollado técnicas para medir el pH y el DOT en estos sistemas. Por ejemplo, Lye y sus colegas han estudiado el efecto del control del pH sobre el rendimiento de la biomasa y la cinética de crecimiento de una bacteria filamentosa en un MTP . A pesar de algunas de las limitaciones inherentes a los MTP a la hora de realizar cultivos celulares, se ha avanzado en la caracterización del mezclado, la transferencia de masa y la instrumentación de estos recipientes, lo que significa que las ventajas únicas de estos dispositivos en términos de potencial de automatización y capacidad intrínseca de HT están conduciendo a su creciente uso como MBR en fase inicial.

Tubos de centrifugado

El desarrollo de procesos de cultivo de células de mamíferos a pequeña escala en su fase inicial se ha llevado a cabo tradicionalmente en matraces T y biorreactores a pequeña escala (a menudo matraces de centrifugado, normalmente de 500 ml de volumen) . Aunque en un principio se trataba de dispositivos poco definidos, se ha trabajado para caracterizar el entorno de ingeniería de los matraces de centrifugado, lo que ha facilitado su uso como recipientes de reducción de escala. Sin embargo, el hecho es que su volumen relativamente grande los hace inviables como tecnología de TH, lo que significa que existe una necesidad real de biorreactores en miniatura que se utilicen junto con células de mamífero para cultivos celulares paralelos. Recientemente se han desarrollado y utilizado tubos de centrifugado como herramienta de desarrollo de procesos a pequeña escala para el cultivo de células de mamífero. Los tubos de centrifugado descritos por primera vez por De Jesus et al. parecen ofrecer varias ventajas sobre los matraces de centrifugado, como un menor volumen de proceso. Desde entonces han sido comercializados por ExcellGene SA (Valais, Suiza) con el nombre de TubeSpin Satellites. Estos recipientes de cultivo consisten en tubos de centrifugación de 50 ml modificados y montados en un agitador orbital giratorio colocado en una incubadora. Los volúmenes de cultivo son de 5 ml a 35 ml por reactor y el análisis fuera de línea se lleva a cabo utilizando tubos enteros sobre una base de sacrificio. Este sistema no cuenta con la instrumentación necesaria para llevar a cabo cultivos de células de mamíferos totalmente caracterizados; sin embargo, es una herramienta útil para la optimización de los medios y la mejora de la productividad y da al desarrollo de los cultivos celulares un aspecto de alto rendimiento, ya que los desarrolladores de este sistema informan de la capacidad de procesar 1000 cultivos diferentes por semana. El volumen relativamente grande y las bajas tasas de evaporación que se encuentran en este dispositivo son activos cuando se trata de células de mamíferos de crecimiento lento, donde los cultivos pueden ser de muchos días de duración, sin embargo, hay que señalar que no se ha llevado a cabo ninguna caracterización de ingeniería de la mezcla y la transferencia de masa en este sistema y, por lo tanto, los tubos de centrifugado se utilizan en gran medida para aplicaciones de cribado.

Sistemas de biorreactores agitados en miniatura

Los biorreactores agitados en miniatura (MSBRs) basados en STRs convencionales han sido desarrollados como una alternativa a los sistemas MBR agitados para el desarrollo de procesos en etapas tempranas y la caracterización celular. Por lo general, estos dispositivos se asemejan mucho a los biorreactores a escala de laboratorio y, por tanto, permiten un mayor potencial de seguimiento y control que otras plataformas de biorreactores en miniatura. Suelen tener un volumen de proceso intermedio entre los PTM y los frascos agitadores, y los materiales de construcción varían mucho: se utilizan plexiglás, pirex, polimetilmetacrilato (PMMA) y acero inoxidable. La figura 2 ilustra nuestro prototipo de MSBR de 18 ml de volumen de trabajo, construido en acero inoxidable y Pyrex y equipado con sondas ópticas para medir el pH y el DOT en línea. Este recipiente ha sido caracterizado en términos de eficiencia de mezcla y capacidad de transferencia de oxígeno. Se ha demostrado que es capaz de imitar los STR convencionales en cultivos celulares de reología, sensibilidad al cizallamiento y demanda de oxígeno variables (es decir, la bacteria filamentosa Saccharopolyspora erythraea que produce eritromicina y la E. coli recombinante que produce ADN plasmídico y un fragmento de anticuerpo, respectivamente). El dispositivo pudo cultivar con éxito una serie de organismos gracias a sus valores de kLa relativamente elevados (480 h-1 a 7000 rpm utilizando el método de expulsión dinámica de gases) y a los breves tiempos de mezcla (4,8 s a 7000 rpm, más del doble de rápido que un recipiente de 7 L a igualdad de potencia específica). Las altas tasas de transferencia de oxígeno favorecieron el crecimiento de organismos de respiración rápida (E. coli), mientras que el mezclado eficaz permitió que el recipiente mantuviera condiciones homogéneas cuando se trataba de caldos de fermentación viscosos, que suelen encontrarse cuando se cultivan organismos filamentosos. La velocidad de agitación también podía controlarse muy estrechamente, lo que ayudaba a evitar daños a los organismos miceliales sensibles al cizallamiento por un aporte excesivo de energía. Además, se ha medido el consumo de energía gaseada del recipiente, lo que ha permitido calcular el número de potencia del impulsor en una amplia gama de condiciones de funcionamiento y, por lo tanto, ha permitido escalar de forma fiable los cultivos celulares sobre la base de una potencia específica igual. Aunque este MSBR es un prototipo, sería posible multiplexar dicho dispositivo para obtener un mayor rendimiento.

Al proporcionar agitación y airear activamente el recipiente, se han reportado tasas de transferencia de masa cercanas a un STR convencional a escala de laboratorio para otros MSBR en la literatura. Por ejemplo, Lamping et al. informaron de valores de kLa de 360 h-1 a 1 VVM y 3000 rpm utilizando el método de expulsión dinámica de gases en un prototipo de MSBR de diseño similar al mostrado en la Figura 2. Además, el mismo equipo modeló con éxito la transferencia de oxígeno en un prototipo de biorreactor en miniatura utilizando un análisis de dinámica de fluidos computacional (CFD), que se basó en los parámetros de ingeniería relevantes del campo de velocidad, el tamaño de las burbujas, la retención de gas y las tasas de disipación de energía dentro del MSBR.

Puskeiler et al. informaron recientemente de valores de kLa superiores a 700 h-1 (12 ml de volumen) y tan altos como 1600 h-1 (8 ml de volumen) para un MSBR agitado a 2300 rpm. Este sistema utiliza un novedoso impulsor inductor de gas que da lugar a una capacidad de transferencia de oxígeno muy elevada. En ese estudio se empleó el método de desgasificación dinámica para medir kLa, aunque se utilizaron condiciones no coalescentes, lo que dificulta la comparación directa con los valores de los medios de cultivo celular o los fluidos coalescentes. En el mismo artículo se describió la capacidad del sistema para mantener cultivos celulares por lotes alimentados, lo que ilustra el potencial de las tecnologías de biorreactores en miniatura para apoyar estas estrategias de importancia industrial. Además, se demostró la viabilidad de la supervisión y el control en línea. El dispositivo descrito en ese informe, diseñado en asociación con H+P Labortechnik AG (Oberschleissheim, Alemania), es una unidad integrada («bloque de biorreactor») capaz de soportar hasta 48 cultivos celulares simultáneamente. Un sistema integrado de manipulación de líquidos permite medir el pH en línea con una frecuencia de una hora, dispensando muestras de 20 μl en MTPs disponibles en el mercado que contienen parches de pH adheridos. Ocho minutos después, el mismo sistema de muestreo de líquidos ajustaba el pH utilizando NaOH 4 M. Aunque el uso de la manipulación automatizada de líquidos para controlar el pH es una solución limpia, los autores reconocen que puede ser poco práctica si se utiliza con organismos sensibles que requieren un ajuste del pH más sensible. Sin embargo, el informe afirma que se está desarrollando un sistema de control mejorado con socios industriales para proporcionar un control más frecuente que puede aumentar el número de fermentaciones simultáneas que se pueden controlar eficazmente. La DOT se midió en el sistema utilizando un prototipo de bloque sensor con sondas ópticas, aunque sólo se monitorizaron simultáneamente 8 reactores de los 48 recipientes de cultivo . Este dispositivo también puede integrarse con equipos robóticos estándar para realizar tareas de manipulación de líquidos como la inoculación, la alimentación y el muestreo.

Usando un enfoque diferente Fluorometrix Corporation (Stow, Massachusetts, EE.UU.) ha desarrollado una construcción MSBR de múltiples recipientes llamada Cellstation®. Este MBR utiliza tecnología óptica para permitir la monitorización en línea in situ de hasta 12 cultivos paralelos para el pH, el DOT y la densidad óptica (OD) y la agitación es proporcionada por impulsores de doble paleta. Cada recipiente tiene un volumen de trabajo de hasta 35 ml y está unido a un carrusel que gira permitiendo que todos los recipientes sean muestreados y monitoreados secuencialmente. El sistema de sensores ópticos se ha validado mostrando la consistencia de los sensores de pH y OD durante un periodo de 70 horas en un proceso de cultivo de células de mamíferos . Además, el grupo de investigación de Rao en la Universidad de Maryland, que mantiene estrechos vínculos con la empresa, ha publicado recientemente detalles de dos prototipos de sistemas MSBR de 24 pocillos que mejoran aún más el rendimiento de esta tecnología .

Paralelamente a estos desarrollos de MSBR, Dasgip AG (Jülich, Alemania) ha introducido el Stirrer-Pro Flask, que forma parte de su serie de cultivo celular Fedbatch-Pro®, que comprende hasta 16 recipientes de cultivo (volumen de trabajo de 200-275 ml) y ofrece una capacidad de transferencia de oxígeno por agitación y una capacidad de alimentación por lotes. La adición de sustrato puede vincularse a los puntos de activación del DOT o del pH, lo que permite una capacidad de alimentación por lotes totalmente automatizada. La combinación de agitación mecánica (entre 10 y 1.000 rpm) y de inyección de gas indica que este sistema es capaz de soportar cultivos bacterianos de crecimiento rápido hasta una alta densidad celular y, por tanto, sería útil en el desarrollo de tales bioprocesos. Sin embargo, el volumen de trabajo utilizado es relativamente grande en comparación con la mayoría de los otros sistemas discutidos y la configuración es complicada por la presencia de un gran número de tubos y cables para las adiciones y mediciones. También se ha desarrollado una variante de este sistema que contiene hasta 16 frascos agitados equipados con sondas de pH que permiten la alimentación intermitente y el control del pH en paralelo.

Como alternativa más pequeña a los RBM a escala de laboratorio capaces de funcionar en paralelo, como el sistema Sixfors® desarrollado por Infors AG (Bottmingen, Suiza), los investigadores del University College London, en asociación con el negocio de biorreactores BioXplore del Grupo HEL (Barnet, Reino Unido), han desarrollado y caracterizado un sistema RBM de 4 a 16 cámaras con un control totalmente integrado y automatizado del DOT y el pH. Aunque cada recipiente tiene un volumen de trabajo máximo de 100 ml, por lo que se sitúa en el extremo superior de la tecnología MSBR, el desarrollo de un software independiente para supervisar estos biorreactores es un paso para dotar a los MBR del mismo grado de control y automatización que existe en los biorreactores convencionales.

Reactores de columna de burbujas en miniatura

Las columnas de burbujas utilizan la aspersión de gas en lugar de la agitación como medio para promover la mezcla y la transferencia de masa de oxígeno para el cultivo de células. Como alternativa a los dispositivos de agitación o agitado hemos desarrollado un reactor de columna de burbujas en miniatura (MBCR) que se basa en un MTP con membranas porosas (fritas) que actúan como toda la base de cada pozo individual . El aire permea la frita y fluye hacia arriba a través de cada pozo, proporcionando oxígeno a cada cultivo en crecimiento. Siempre que cada frita esté fabricada con una alta especificación y tenga un grado idéntico de porosidad, el caudal que llega a cada columna es igual y puede calcularse. Esto evita que la variación de la tasa de flujo de aire afecte artificialmente a los resultados.

Doig et al. detallan la construcción y caracterización de un prototipo de MBCR de 12 pocillos que es capaz de soportar el cultivo aeróbico de cultivos de Bacillus subtilis con cada columna que tiene un volumen de trabajo de 2 ml. Se informaron valores de kLa de hasta 220 h-1 utilizando el método de expulsión dinámica de gases a una velocidad de gas superficial de 0,02 ms-1. Una de las ventajas de este tipo de dispositivo es que, a diferencia de un MTP, la aireación se realiza mediante un chorro directo. Esto tiene el efecto de aumentar la capacidad de transferencia de masa de oxígeno del sistema en relación con un MTP, ya que el rociado aumenta la superficie disponible para la transferencia de masa de gas-líquido en relación con la aireación superficial solamente. Aunque algunos datos de kLa para MTP detallados en esta revisión son sustancialmente más altos que los valores de MBCR medidos, debe señalarse que muchos de los valores de MTP se derivaron bajo condiciones bastante artificiales diseñadas para maximizar la transferencia de oxígeno, mientras que los valores de kLa para el MBCR mostrados anteriormente serían reproducibles en condiciones de cultivo celular.

Además de una gran superficie disponible para la transferencia de oxígeno, la falta de agitación en las MBCR significa que la entrada de energía, y por lo tanto la transferencia de oxígeno es más fácil de modelar que en las STRs ya que hay menos parámetros a considerar, siendo la velocidad del gas superficial y la distribución del tamaño de las burbujas parámetros clave en la ampliación/reducción de las columnas de burbujas . Además, el dispositivo es estacionario, en contraposición a la agitación, lo que permite una instrumentación más sencilla, ya que la agitación de la mayoría de los sistemas MTP tiene que detenerse antes de que pueda tener lugar la medición en un lector de placas. La simplicidad mecánica, junto con la potencialmente alta transferencia de oxígeno y la facilidad de muestreo, hace que los MBCR sean adecuados para el cultivo celular en paralelo. Esto podría ser con el propósito de mejorar el medio o la cepa, y el desarrollo de procesos en etapas tempranas, entre otros. Los MBCR también podrían utilizarse para imitar y predecir el rendimiento de los reactores a gran escala. En este sentido, hemos demostrado recientemente una buena correlación de la tasa de transferencia de oxígeno con el consumo volumétrico de energía (P/V) para columnas de burbujas a escala miniatura (2 ml) y de laboratorio (100 ml) utilizando difusores de gas con el mismo tamaño de poro que permite la predicción de kLa en función de P/V . En el mismo trabajo también mostramos un rendimiento de cultivo celular comparable utilizando el MBCR en relación con un STR a escala de laboratorio basado en valores iguales de kLa. Estos resultados indican el potencial del MBCR como dispositivo a escala. Este prototipo de dispositivo MBCR no estaba instrumentado, aunque en trabajos posteriores hemos equipado este dispositivo con parches de fluorescencia óptica y lo hemos utilizado para medir el DOT durante los cultivos celulares. La temperatura pudo controlarse conectando el dispositivo a un baño de agua y haciendo circular agua a temperatura controlada a través del espacio cerrado entre las columnas (véase la figura 3). Otros han desarrollado anteriormente MBCR similares; sin embargo, estos recipientes utilizan volúmenes de unos 200 ml y, por lo tanto, son dos órdenes de magnitud mayores que el dispositivo descrito por Doig et al. , lo que limita el grado de funcionamiento en paralelo que se puede conseguir.

Otros dispositivos en miniatura

Utilizando el concepto de placa sensorial integrada, MicroReactor Technologies (Mountain View, CA, EE.UU.) ha desarrollado un sistema híbrido de cultivo celular basado en un MTP de 24 pocillos agitado y desviado con una configuración de pocillos que permite una transferencia de calor uniforme a través de la placa. El volumen de trabajo sugerido para cada pozo oscila entre 3 y 5 ml y el aire se introduce en la fase líquida por medio de un chorro de agua a través de los sinterizadores situados en la base de cada pozo, lo que aumenta la capacidad de transferencia de oxígeno en comparación con los sistemas agitados de diseño similar. Este dispositivo de cultivo, recientemente comercializado (con licencia en Europa por Applikon Biotechnology AB, Países Bajos), está instrumentado con sondas de fibra óptica para monitorizar en línea el DOT y el pH en todos los pocillos simultáneamente. El dispositivo también permite el control independiente de la temperatura, el DOT, el pH (a través de la inyección de gas) y el caudal de aire para los 24 pocillos. El dispositivo supera uno de los problemas fundamentales cuando se trata de dispositivos HT basados en MTP -a saber, cómo colocar la instrumentación en todos los pocillos contenidos en la placa- al fijar todos los parches de los sensores en la base de cada pocillo y, a continuación, colocar toda la placa en una plataforma de incubación con agitación que cuenta con circuitos de instrumentación integrados, lo que permite supervisar cada pocillo de forma independiente. Es probable que la principal aplicación sea para las primeras etapas del desarrollo del proceso (por ejemplo, la selección de la cepa y la optimización del medio). Todavía no hay datos disponibles públicamente sobre la caracterización de ingeniería de la mezcla y la transferencia de oxígeno y la comparación del rendimiento del cultivo con los datos de los biorreactores a escala de laboratorio.

Ha habido desarrollos recientes con el objetivo de reducir la escala de los MBR a volúmenes de proceso de menos de un mililitro. Aunque estos sistemas en miniatura ofrecen el mayor alcance para la aplicación de la TH, hay un límite práctico para lo pequeños que pueden llegar a ser los volúmenes de cultivo. Los dispositivos que utilizan un volumen de proceso demasiado pequeño pueden encontrar inviable la realización de cultivos con suficiente control y muestreo. Aunque la DO, la DOT y el pH pueden ser monitorizados en línea, otros parámetros críticos como la concentración de sustrato y el rendimiento del producto no suelen serlo; sin embargo, puede ser posible sortear este problema para ciertos procesos incorporando marcadores como la proteína verde fluorescente en el producto . La evaporación puede convertirse en un problema importante en volúmenes de cultivo tan extremadamente pequeños si se trabaja con procesos largos de cultivo de bacterias y células de mamíferos; además, dado el volumen extremadamente pequeño del proceso, sería técnicamente difícil controlar con precisión el pH mediante la adición de líquidos. No obstante, la escala de funcionamiento representa un avance radical en el diseño de los MBR y aumenta significativamente su uso potencial para el cultivo celular paralelo de HT.

En este sentido, el grupo de investigación de Jensen en el MIT ha desarrollado un prototipo de MBR submilimétrico que ha sido modificado y ampliado a un sistema multiplexado capaz de realizar ocho cultivos microcelulares instrumentados con volúmenes de trabajo de 150 μl . Utilizando métodos de microfabricación estándar, los pozos de cultivo de PMMA y poli(dimetilsiloxano) (PDMS) se inmovilizan en una base de aluminio que contiene todos los elementos del sensor y la transferencia de oxígeno se habilita mediante la difusión a través de una membrana permeable al gas y agitadores magnéticos capaces de controlar la agitación individualmente a cada reactor respectivamente. El DOT, el pH y la DO pueden controlarse en línea mediante sondas ópticas. El grupo informó de que el dispositivo puede mantener los cultivos por lotes de E. coli, aunque la DOT cayó al 0% después de 2-3 horas, posiblemente como resultado de la limitación de oxígeno . Esto es probable si se tiene en cuenta que el valor máximo de kLa medido en este MBR fue sólo de 75 h-1. No obstante, los autores demostraron que el comportamiento del crecimiento era comparable con el obtenido utilizando una serie de dispositivos de cultivo celular más grandes . El mismo grupo de investigación también detalla el análisis de expresión génica por microarrays de ADN de E. coli cultivada en un MBR de 50 μl . Este trabajo marca un verdadero avance en el desarrollo de MBR, ya que no sólo muestra una prueba de principio, sino que también permite el análisis altamente paralelo de la expresión génica y podría ser utilizado para mejorar la comprensión de la fisiología celular durante el cultivo utilizando un enfoque a nivel de sistemas . Maharbiz et al. informaron del desarrollo de un dispositivo basado en una matriz que combina reactores de micropocillos con tecnología de microfabricación de silicio y que es capaz de soportar el cultivo de E. coli en ocho pocillos de 250 μl simultáneamente. De forma similar al reactor del MIT (descrito anteriormente), los pocillos estaban situados en una placa base que contenía sensores para medir el pH y el OD (no se midió el DOT, pero los autores afirman que esto sería factible). El oxígeno se generó electroquímicamente en cada cultivo y la agitación fue proporcionada por una perla de acero inoxidable que mezcló el cultivo, dispersando el oxígeno y rompiendo la espuma superficial. Sin embargo, este equipo de investigación no proporcionó datos comparativos a escala de banco con los que determinar si la ampliación sería factible a partir de un dispositivo de este tipo.

Otro sistema comercial para el funcionamiento de HT ha sido desarrollado por Bioprocessors Corp. (Woburn, MA, USA). Este dispositivo de cultivo celular (llamado SimCell®) es capaz de operar y controlar de forma independiente hasta 1500 cultivos, permitiendo así el uso de métodos de diseño experimental factorial completo para la optimización del proceso. Este dispositivo «reactor-en-un-chip» se basa en un diseño microfluídico con una membrana permeable al gas que permite la transferencia de oxígeno y la mezcla se realiza mediante la rotación de los chips de la matriz de microbiorreactores en incubadoras de ambiente controlado que utilizan aire humidificado para minimizar la evaporación. Este sistema puede ser altamente automatizado y está integrado con un robot para transferir las placas desde la incubadora a una estación de detección para medir el pH, el DOT y la densidad celular, y una estación de fluidos donde se pueden hacer adiciones de medios para el funcionamiento por lotes alimentados y ácido/base para el control del pH. Los volúmenes de cada reactor oscilan entre unos 300 μl y unos 700 μl, dependiendo de la aplicación (células microbianas o de mamíferos), y cada reactor puede funcionar en modo batch, fed-batch o perfusión. Se ha demostrado que el dispositivo admite el cultivo de E. coli y de levaduras, con una cinética de crecimiento comparable a la obtenida con los STR convencionales. La empresa también ha descrito el crecimiento de células CHO sin limitación de oxígeno a alta densidad celular y ha utilizado simulaciones de dinámica de fluidos computacional (CFD) para mostrar cómo se ha recreado el entorno físico que se observa en los biorreactores de cuchillas inclinadas a gran escala. kLa en el sistema se ha modelado mediante CFD y se ha estimado entre 60 y 500 h-1, valores similares a los encontrados en los matraces agitados y en las RTS subóptimas .

MBRs como herramienta de reducción de escala

Hay que tener en cuenta que no todos los sistemas de cultivo celular en miniatura están diseñados para la ampliación/reducción de escala de los bioprocesos existentes; se ha mencionado en esta revisión cómo estos dispositivos pueden utilizarse para muchas aplicaciones, como la evaluación de organismos recombinantes/salvajes en fase inicial, la mejora de cepas y el desarrollo de medios de crecimiento. Sin embargo, los sistemas en miniatura utilizados en las etapas posteriores del desarrollo del proceso, por ejemplo, para la optimización de las condiciones de funcionamiento y de cultivo, deben ser escalables. Por esta razón, es vital que se exploren los métodos de «regla general» bien establecidos que se utilizan con frecuencia en la industria para escalar de los procesos de mesa a los recipientes de producción para ver si se pueden utilizar para escalar de los MBR. Estos métodos probados incluyen el escalado sobre la base de la potencia gaseada por unidad de volumen; la velocidad de la punta del agitador; el DOT constante; la capacidad de transferencia de masa de oxígeno (kLa); o el tiempo de mezcla. Sin embargo, no existe un enfoque único que sirva para todos los casos, por lo que debe subrayarse que no existe una base única de equivalencia que pueda aplicarse universalmente a todos los RBM. Ninguno de los sistemas detallados en esta revisión podría utilizar todas las metodologías establecidas de ampliación/reducción descritas anteriormente. Por ejemplo, es difícil conseguir un valor de DOT constante en los sistemas agitados en comparación con los RBM convencionales, ya que la falta de agitación mecánica (y de aspersión, en el caso de los sistemas basados en MTP) significa que el control de los niveles de DOT por encima de un nivel crítico en estos dispositivos es técnicamente muy difícil. Esta característica particular no es en sí misma un problema siempre y cuando las células cultivadas sean de crecimiento suficientemente lento (ya sea de forma natural o mediante el uso de un medio de crecimiento débil y/o operando a una temperatura no propicia para la tasa de crecimiento máxima), pero sí restringe el uso de tales sistemas para realizar muchos procesos de alta densidad celular que implican microorganismos de crecimiento rápido con alta demanda de oxígeno.

Una indicación de qué criterio de reducción de escala debe utilizarse para un bioproceso concreto (y por tanto una indicación de qué plataforma de miniaturización es preferible para ese proceso) puede obtenerse examinando las características celulares y las condiciones de proceso del bioproceso en cuestión. Para un organismo de crecimiento rápido, como E. coli o Bacillus subtilis, la transferencia de oxígeno suele ser un factor limitante, mientras que el estrés por cizallamiento no suele ser un problema importante; por lo tanto, la reducción de escala de un cultivo celular de este tipo podría diseñarse sobre la base de una entrada de potencia específica igual, o sobre la base de una kLa igual. Sin embargo, uno de los requisitos para elegir igual kLa es poder estimar con precisión la entrada de energía en el biorreactor en miniatura. El trabajo realizado en el UCL en un MBR de 10 ml confirma el trabajo anterior de Bujalski et al. que mostró que el número de potencia del impulsor disminuye de forma concomitante con el diámetro del recipiente. Por lo tanto, es importante no utilizar los números de potencia de los impulsores a escala convencional para la estimación de la potencia de entrada en los MBR, ya que esto podría conducir a la limitación de oxígeno de los microbios de respuesta rápida al sobrestimar la potencia transferida al sistema.

Un desafío particular es el crecimiento de los organismos filamentosos debido a su compleja morfología. Los caldos de fermentación que contienen dichos organismos tienen una viscosidad relativamente alta y requieren un aporte extra de energía para mantener un mezclado y una transferencia de masa adecuados. Además, los organismos filamentosos son mucho más grandes que las bacterias unicelulares y pueden ser más susceptibles de sufrir daños por cizallamiento. Por ejemplo, Heydarian et al. informaron de que la longitud media de las hifas de la bacteria Saccharopolyspora erythraea, productora de eritromicina, superaba la microescala de turbulencia de Kolmogorov en un biorreactor estándar de 7 L en una amplia gama de condiciones de funcionamiento. En el caso de S. erythraea se ha demostrado que si los micelios están excesivamente cizallados, dando lugar a una longitud de hifas demasiado corta, la formación del producto eritromicina puede verse afectada . Por esta razón, puede ser aconsejable elegir la velocidad de la punta como base para la reducción de la escala cuando se utilizan organismos filamentosos. Aunque no se conocen bien los mecanismos que rigen la formación de gránulos en los cultivos filamentosos, Vecht et al. han informado de una correlación entre la disminución de la OTR y una reducción del tamaño medio de los gránulos en Streptomyces tendae . Llegaron a la conclusión de que la formación de gránulos en ese organismo se debe principalmente a las interacciones hidrofóbicas controladas por el DOT. Dado el efecto perjudicial que la formación de pellets puede tener en la producción de metabolitos secundarios en muchos organismos filamentosos -debido a la inhibición de la captación de oxígeno en el centro del pellet que aumenta con el diámetro del mismo-, está claro que para la reducción de escala de los procesos de cultivo de células filamentosas, los MBR deben mantener los niveles de oxígeno disuelto que se encuentran en el proceso a gran escala en el que se basa la reducción de escala para mantener el rendimiento del producto. Es difícil utilizar una kLa igual para la reducción de escala, ya que suele calcularse en sistemas modelo que se parecen poco a los caldos de fermentación reales. Además, la kLa se ve afectada por los cambios en la coalescencia y reología del caldo de cultivo a lo largo de un proceso de cultivo, cambios que son muy difíciles de medir y tener en cuenta. La clave a la hora de elegir una base para la reducción de escala de los biorreactores es no exponer las células a tensiones superiores a las que se producen a gran escala.

De los dispositivos en miniatura analizados en esta revisión, está claro que algunos tratan de replicar los biorreactores a gran escala en sus geometrías. Por ejemplo, la mayoría de los MSBR y MBCR son facsímiles geométricos de los biorreactores a gran escala. Mantener la similitud geométrica tiene ventajas para la comparación efectiva de escalas, ya que permite que algunos supuestos clave sigan siendo válidos; por ejemplo, mantener una relación de aspecto igual ayuda a predecir la presión hidrostática y, por tanto, la solubilidad del oxígeno a diferentes escalas de funcionamiento. Esto supone una ventaja para estos dispositivos, ya que sus mecanismos para lograr la transferencia y la mezcla de oxígeno y para calcular la entrada de energía pueden basarse en los mismos principios establecidos a gran escala. La dinámica de los fluidos será similar, aunque es importante señalar que algunos números adimensionales que describen la dinámica de los fluidos, por ejemplo el número de Reynolds en los recipientes agitados, parecen tener menos influencia a escalas tan pequeñas. Más fundamentalmente, se plantea la cuestión de la eficacia de los MBR cuando alcanzan un tamaño tan pequeño que sus propiedades de flujo y los mecanismos de transferencia de masa y mezcla son diferentes a los que se encuentran en los biorreactores a gran escala que intentan imitar. Las PTM son especialmente vulnerables en este sentido, ya que su falta de agitación mecánica significa que los efectos de la tensión superficial son más importantes que en los MSBR, donde los impulsores pueden disminuir este efecto y ayudar a mantener una mezcla eficaz de los fluidos. Además, existe el peligro cuando se utilizan condiciones extremas con los MBR (en términos de frecuencia de agitación y volumen de llenado) de que todo el líquido del proceso forme una fina película a lo largo de la superficie interior del pozo, limitando así gravemente la mezcla y exacerbando el efecto perjudicial de la tensión superficial. Los diferentes regímenes de flujo en los MBR causados por diferentes métodos de agitación pueden tener un impacto en la capacidad de estos sistemas para realizar cultivos celulares de forma reproducible; si las condiciones son diferentes a pequeña y gran escala en términos de mezcla y transferencia de masa gas-líquido esto podría conducir a problemas, por ejemplo, la selección de clones no adecuados para la producción o diferencias en la calidad del producto, especialmente para las proteínas recombinantes. Por otro lado, el trabajo de Micheletti et al. indica que la traslación a escala de los sistemas agitados a los sistemas con agitación es factible si se eligen cuidadosamente los criterios de escalado. Utilizando una correlación recientemente introducida para las predicciones de kLa en MTPs, fueron capaces de escalar con éxito el cultivo de E. coli que sobreexpresa una enzima transketolasa de un sistema de micropocillos (1 mL de volumen) a un STR de 1,4 L sobre la base de una kLa constante. El mismo grupo también proporciona datos iniciales sobre la ampliación satisfactoria de un proceso de cultivo de células de mamífero utilizando una tasa media de disipación de energía constante.

Automatización de las RBM

La automatización de las RBM es la clave para ampliar la capacidad de la TH. Varios de los sistemas en miniatura desarrollados recientemente utilizan un MTP modificado como punto de partida (por ejemplo, el MicroReactor® de Applikon). Actualmente, estos sistemas parecen ser muy prometedores debido a su facilidad de integración con las plataformas de automatización robótica existentes. Los MTP en los que se basan estos sistemas tienen una huella estándar, son mecánicamente sencillos y la propia estandarización de su diseño los hace ideales para incorporarlos a plataformas robóticas automatizadas que realmente lleven estas tecnologías al ámbito de la HT, confiriéndoles la capacidad de realizar cientos de cultivos celulares en paralelo, utilizando una huella no mucho mayor que la de un biorreactor convencional a escala piloto. La alternativa es desarrollar un sistema de biorreactores en miniatura que se pueda automatizar. Las tecnologías que el grupo de Weuster-Botz ha desarrollado en colaboración con H + P Labortechnik y Bioprocessors Corp. son ejemplos de este enfoque. Dichos dispositivos ofrecen un grado de capacidad de HT, así como una sofisticada robótica incorporada en el caso del sistema SimCell® de Bioprocessors Corp.

Los dispositivos robóticos utilizados junto con los MBR suelen contar con cabezales de pipeteado múltiples montados en brazos que son capaces de moverse en tres dimensiones por toda el área de trabajo. Los cabezales de pipeteado también pueden hacer frente a diferentes geometrías de RBM y los brazos robóticos separados pueden recoger y colocar equipos auxiliares en cualquier lugar del espacio de trabajo. Esta capacidad de recogida y colocación significa que un solo robot puede inocular, controlar el pH, tomar muestras y hacer adiciones a un MBR, ofreciendo una solución verdaderamente integrada. Además, los robots pueden conectar plataformas de cultivo celular con instrumentos analíticos (por ejemplo, sistemas HPLC) y realizar ensayos complejos como ELISA para productos de anticuerpos utilizando muestras en tiempo real, ensayos que aprovechan la capacidad del robot para realizar miles de operaciones de manipulación de líquidos en un corto período de tiempo. Las condiciones de cultivo celular aséptico pueden mantenerse alojando el robot dentro de una cabina de bioseguridad construida a medida.