Brainbow
Las técnicas Brainbow se basan en la recombinación Cre-Lox, en la que la proteína Cre recombinasa impulsa la inversión o escisión del ADN entre sitios loxP. El método Brainbow original incluye tanto Brainbow-1 como Brainbow-2, que utilizan diferentes formas de recombinación cre/lox. Brainbow-3, una versión modificada de Brainbow-1, se desarrolló en 2013. Para todos los subtipos de Brainbow, la expresión de una determinada XFP es un evento estocástico, o aleatorio.
Brainbow-1 utiliza construcciones de ADN con diferentes genes de proteínas fluorescentes (XFP) separadas por formas mutantes y canónicas de loxP. Esto crea un conjunto de posibilidades de escisión mutuamente excluyentes, ya que la recombinación mediada por cre sólo se produce entre sitios loxP idénticos. Después de que se produzca la recombinación, la proteína fluorescente que queda directamente después del promotor se expresa de forma única. Así, una construcción con cuatro XFPs separadas por tres sitios loxP diferentes, tres eventos de escisión y la construcción original puede producir cuatro proteínas fluorescentes diferentes.
Brainbow-2 utiliza la escisión e inversión de Cre para permitir múltiples posibilidades de expresión en una construcción dada. En un segmento de ADN con dos XFP orientadas de forma opuesta, Cre inducirá un evento de inversión aleatorio que deja una proteína fluorescente en la orientación adecuada para su expresión. Si dos de estas secuencias invertibles están alineadas, son posibles tres eventos de inversión diferentes. Cuando también se consideran los eventos de escisión, una de las cuatro proteínas fluorescentes se expresará para una combinación dada de escisiones e inversiones de Cre.
Brainbow-3 conserva el formato loxP de Brainbow-1, pero sustituye los genes RFP, YFP y CFP por mOrange2, EGFP y mKate2. Se eligieron mO2, EGFP y mK2 porque sus espectros de excitación y emisión fluorescentes se solapan mínimamente y porque comparten una mínima homología de secuencia, lo que permite el diseño de anticuerpos selectivos que pueden utilizarse para detectarlos en protocolos inmunohistoquímicos. Brainbow-3 también aborda el problema del llenado desigual de las neuronas con XFPs mediante el uso de derivados farnesilados de las XFPs, que tienen un tráfico más uniforme hacia las membranas neuronales.
Brainbow se implementa in vivo mediante el cruce de dos cepas de organismos transgénicos: una que expresa la proteína Cre y otra que ha sido transfectada con varias versiones de una construcción loxP/XFP. El uso de múltiples copias del transgén permite que las XFP se combinen de forma que puedan dar uno de los aproximadamente 100 colores diferentes. Así, cada neurona está etiquetada con un tono diferente en función de su expresión combinatoria y estocástica de proteínas fluorescentes.
Para dilucidar los patrones de expresión diferencial de las XFP en una forma visible, se obtienen imágenes de cortes de cerebro con microscopía confocal. Cuando se expone a un fotón con su longitud de onda de excitación particular, cada fluoróforo emite una señal que se recoge en un canal rojo, verde o azul, y la combinación de luz resultante se analiza con un software de análisis de datos. La superposición de neuronas coloreadas diferencialmente permite desentrañar visualmente complicados circuitos neuronales.
Hasta la fecha, Brainbow se ha probado predominantemente en ratones; sin embargo, la técnica básica descrita también se ha modificado para su uso en estudios más recientes desde la aparición del método original introducido en 2007.
MiceEdit
El cerebro del ratón tiene 75.000.000 de neuronas y es más similar a un cerebro humano que el de la drosophila y otros organismos comúnmente utilizados para modelar esta técnica, como C. elegans. Los ratones fueron los primeros organismos en los que se empleó con éxito el método Brainbow de neuroimagen. Livet et al. (2007) desarrollaron dos versiones de ratones Brainbow utilizando Brainbow-1 y Brainbow-2, que se describen más arriba. Al utilizar estos métodos para crear un mapa completo y rastrear los axones de un músculo de ratón, es necesario recoger decenas de miles de imágenes y compilarlas en pilas para crear un esquema completo. Entonces es posible rastrear cada axón motor y sus contactos sinápticos para construir un conectoma completo del músculo.
Más ejemplos de neuronas examinadas mediante la técnica Brainbow en ratones transgénicos se localizan en el nervio motor que inerva los músculos del oído, en los tractos axónicos del tronco cerebral y en el giro dentado del hipocampo.
DrosophilaEditar
La complejidad del cerebro de Drosophila, que consta de unas 100.000 neuronas, lo convierte en un candidato excelente para aplicar técnicas de neurofisiología y neurociencia como Brainbow. De hecho, Stefanie Hampel et al. (2011) combinaron Brainbow junto con herramientas de orientación genética para identificar neuronas individuales dentro del cerebro de Drosophila y varios linajes neuronales. Una de las herramientas de orientación genética fue un sistema de expresión binaria GAL4/UAS que controla la expresión de UAS-Brainbow y dirige la expresión a pequeños grupos de neuronas. La utilización de métodos «Flip Out» aumentó la resolución celular de la construcción reportera. La expresión de las proteínas fluorescentes, al igual que con el Brainbow original, dependía de la recombinación Cre correspondiente a los sitios lox coincidentes. Hampel et al. (2011) también desarrollaron su propia variación de Brainbow (dBrainbow), basada en el etiquetado de epítopos con anticuerpos en lugar de la fluorescencia endógena. Dos copias de su construcción producen seis colores brillantes y separables. Esto, junto con las simplificaciones en la asignación de colores, les permitió observar las trayectorias de cada neurona a grandes distancias. En concreto, rastrearon las neuronas motoras desde el lóbulo antenal hasta las uniones neuromusculares, lo que les permitió identificar las dianas musculares específicas de las neuronas individuales.
En definitiva, esta técnica proporciona la capacidad de cartografiar eficazmente los circuitos neuronales de Drosophila para que los investigadores puedan descubrir más información sobre la estructura del cerebro de este invertebrado y cómo se relaciona con su consiguiente comportamiento.