Cinco métodos principales para el etiquetado de anticuerpos primarios

En cualquier aplicación que utilice anticuerpos para la detección de señales (por ejemplo, Western blotting, ELISA, inmunohistoquímica o FACS), existen dos enfoques para el etiquetado de anticuerpos: etiquetado directo e indirecto. El Western blot estándar utiliza el etiquetado indirecto porque se utiliza un anticuerpo primario para detectar el antígeno diana, seguido de un anticuerpo secundario al que se une una molécula de detección.

En algunas situaciones, puede ser mejor saltarse el anticuerpo secundario y todos los pasos asociados y etiquetar directamente su anticuerpo primario. Los casos que piden a gritos el etiquetado directo del anticuerpo primario incluyen:

• Hay una unión inespecífica del anticuerpo secundario
• Está utilizando anticuerpos primarios noanticuerpos primarios de organismos estándar – en este caso puede ser difícil encontrar buenos anticuerpos secundarios
• Cuando se hace un multiplexado con anticuerpos que provienen de la misma especie
• Cuando se necesita acortar el tiempo experimental eliminando la incubación del anticuerpo secundario y los pasos de lavado asociados

Parámetros de anticuerpos

Se puede etiquetar el anticuerpo elegido no sólo con colorantes fluorescentes sino también con proteínas fluorescentes enzimas y partículas coloreadas. Todos ellos suelen estar unidos a través de un grupo terminal de lisina, por lo que debe evitar los tampones que contengan aminas (por ejemplo, Tris) y las moléculas a lo largo de todos los pasos. De lo contrario, ¡se etiquetarán sobre todo las moléculas de los tampones! También debe evitar el conservante común de los tampones, la azida sódica, ya que interferirá con la reacción de marcaje.

El anticuerpo para el marcaje debe estar a una concentración no inferior a 0,5 mg/ml y >90% de pureza. Cuanto menos proteínas y moléculas que contengan grupos aminos interfieran en su preparación de anticuerpos, más eficiente será la reacción de marcaje. Pero incluso si su anticuerpo está nadando en glicina y BSA, siempre puede eliminar las sustancias interferentes mediante diálisis. También puede mejorar la pureza de su anticuerpo haciéndolo pasar por una columna de proteína A o incluso puede preparar su propia columna de purificación por afinidad con un antígeno adecuado.

Métodos principales de etiquetado de anticuerpos en la empresa

Método del éster de NHS (succinimidilo)

Este método es útil para la conjugación de anticuerpos con colorantes fluorescentes ampliamente disponibles, como los derivados de la rodamina. Normalmente se realiza en un tampón de fosfato con posterior separación en columna del colorante no marcado. El principal inconveniente es que los ésteres son inestables porque son sensibles a la humedad. El anticuerpo marcado debe utilizarse inmediatamente después de finalizar la reacción.

Método del isotiocianato

Puede utilizar este método para hacer isotiocianato de fluoresceína (FITC), que es muy popular en la preparación de proteínas fluorescentes y anticuerpos. Si has trabajado con microscopía fluorescente, has tratado con FITC. También existen análogos de isotiocianato de diferentes colorantes estándar.

El isotiocianato es más estable que el NHS, pero es más difícil de fabricar y su reacción de etiquetado será probablemente menos eficiente con este método. Al igual que con el NHS, el exceso de colorante debe eliminarse después de la reacción mediante cromatografía.

Método de la carbodiimida

Los compuestos derivados de la carbodiimida convierten los grupos carboxilo de las proteínas en intermediarios reactivos que pueden reaccionar con las lisinas. La alta reactividad de las carbodiimidas significa que pueden utilizarse para marcar anticuerpos con materiales relativamente inertes como partículas magnéticas o de oro. La carbodiimida más utilizada es la EDC. A veces se añade NHS a la reacción para ayudar a la formación de intermedios relativamente estables.

El método es sencillo, pero al igual que el NHS, el EDC es higroscópico, por lo que tendrá que utilizar su anticuerpo inmediatamente después del etiquetado.

Método de las dos etiquetas

Aquí, usted etiqueta su anticuerpo con otra proteína que sirve de catalizador, por ejemplo HRP o fosfatasa alcalina. Como ambas moléculas contienen numerosos grupos aminos, la reticulación directa (como con el método NHS) daría lugar a polímeros de la misma molécula. Por lo tanto, se realizaría la reticulación en dos pasos separados. Se reticula el anticuerpo con la molécula X y el catalizador con la molécula Y. Hay que elegir cuidadosamente X e Y porque deben interactuar para formar el conjugado. Por ejemplo, podría elegir la maleimida como X y un tiol como Y.

Aunque el conjugado resultante será más estable que el que se obtiene con el método NHS, este método requerirá tres veces más trabajo; pasos separados de etiquetado y purificación para el anticuerpo, el catalizador y la reacción de conjugación. La buena noticia es que se puede comprar la molécula catalítica preetiquetada y luego etiquetar el anticuerpo en consecuencia.

Método del periodato

Este método es útil para la generación de conjugados específicos HRP-anticuerpo. El periodato activa la HRP creando moléculas de aldehído que interactúan con los residuos de lisina. La propia HRP tiene sólo unos pocos residuos de lisina, por lo que la polimerización de la enzima no es una preocupación significativa. Los enlaces entre la HRP y el anticuerpo son reversibles a menos que se estabilicen mediante la adición de cianohidruro de sodio.

Este fue mi repaso de los principales métodos caseros de etiquetado de anticuerpos. Hay un montón de kits comerciales en el mercado con la química subyacente similar que puede hacer su vida mucho más fácil. Si su laboratorio tiene el dinero.

¿Tiene otro método de etiquetado de anticuerpos que le gustaría compartir con nosotros? Ponte en contacto escribiendo en la sección de comentarios.

Literatura:

Meyer JP, Adumeau P, Lewis JS, Zeglis BM. Química y radioquímica del clic: Los primeros 10 años. Bioconjug Chem. (2016) 27(12):2791-2807. doi: 10.1021/acs.bioconjchem.6b00561. Epub 2016 Nov 22.