Comprensión de la base estructural de la restricción del VIH-1 por el doble dominio APOBEC3G de longitud completa.dominio APOBEC3G

Características estructurales generales de la fl rA3G

Un obstáculo importante en los estudios estructurales de las proteínas APOBEC de doble dominio fl ha sido la escasa solubilidad-las formas de tipo salvaje se purifican a menudo como oligómeros no homogéneos o como grandes agregados a mayor concentración. Con el fin de obtener una fl A3G con buena solubilidad para la determinación estructural, examinamos homólogos de A3G de diferentes especies de primates y descubrimos que la A3G del mono rhesus (rA3G) tenía una solubilidad mejorada. Dos construcciones mutacionales de fl rA3G (denominadas FKL y E/Q) produjeron proteínas y cristales bien comportados en diferentes condiciones (Tabla Suplementaria 1) que difractaron a 2,47 y 2,40 Å, respectivamente, (Tablas Suplementarias 1 y 2, Fig. Suplementaria 1). Cambios adicionales en estas dos construcciones mejoraron la solubilidad y el rendimiento de rA3G, incluyendo la sustitución de un bucle 8 de 8 residuos de CD1 por el bucle 8 de 4 residuos de hA3G-CD2 (como en las construcciones E/Q y FLK, Tabla Suplementaria 1, Fig. 1), otras mutaciones F126Y en el bucle 7 de CD1, K180S/L184S en CD1 h6, y la supresión de 8 residuos del bucle 3 de CD2 (como en el constructo FKL, Tabla Suplementaria 1, Fig. Suplementaria 1B). Cabe destacar que el K128 de rA3G que actúa como barrera para la transmisión entre especies está mutado a un residuo de ácido aspártico (D128) como en A3G humano (hA3G)36. Las construcciones también contienen la mutación catalítica E259 a Q/A para evitar la potencial toxicidad durante la expresión de la proteína recombinante. Los residuos mutados y su ubicación en la estructura se muestran en la Fig. 1B suplementaria. En ambas estructuras, CD1 y CD2 se pliegan en dominios independientes conectados por un enlace corto de 5 residuos (residuos R194 a D198) (Fig. 1a, b). Las dos estructuras, a pesar de la similitud estructural general (Fig. 1a, b), muestran diferencias evidentes en las conformaciones de CD2 y en la orientación del empaquetamiento entre CD1 y CD2 (Fig. 1c, Fig. 2A suplementaria).

Tanto las estructuras rA3G FKL como E/Q tienen la misma estructura canónica CD1 y se superponen bien entre sí (Fig. Suplementaria 2B, rmsd de 0,445 Å). Las diferencias conformacionales mucho mayores en cada dominio CD2 dan lugar a una superposición rmsd de 0,862 Å. Al alinear las estructuras FKL y E/Q a través de su dominio CD1, el dominio CD2 de la estructura E/Q muestra una rotación de ~29° en comparación con el CD2 de la estructura FKL, haciendo que el dominio CD2 de E/Q se desplace ~15 Å hacia abajo y ~8 Å hacia CD1, y dando lugar a una interacción de empaquetamiento mucho más estrecha con CD1 (Figura suplementaria 2 A). La interfaz global de empaquetamiento CD1-CD2 tiene una superficie enterrada de ~623 Å2 para la estructura FKL y de ~700 Å2 para la estructura E/Q. El empaquetamiento más apretado de CD1-CD2 en la estructura E/Q sólo conduce a un área de superficie enterrada ligeramente mayor que la estructura FKL, probablemente debido al repliegue y a la densidad faltante de la interfaz que localiza elementos estructurales (h2-loop3) de su CD2.

Dos tipos de interacciones de los dominios CD1 y CD2

Mientras que la estructura FKL muestra un plegado canónico de su dominio CD2 (Fig. 2C suplementaria), la estructura E/Q muestra una alteración significativa en la conformación del CD2 (Fig. 2D suplementaria), con cambios importantes en la hélice 2 (h2), el bucle 3, el bucle 4 y el centro activo de Zn. La larga h2 del CD2 en la estructura FKL (Fig. 2C suplementaria) se ha convertido en una hélice corta de 310 (h2′) en la estructura E/Q (Fig. 2D suplementaria), dando lugar a un tramo desordenado de 14 residuos que abarca partes del bucle 3 y h2 (residuos A246 a E259) (Fig. 1A suplementaria). El cambio a una estructura corta de 310 h2 y bobina aleatoria extendida es necesario para evitar el choque en esta conformación de empaquetamiento apretado (Fig. 1e). Sin embargo, esto también altera la conformación del centro activo de Zn de CD2 dentro de las regiones de h2 y el bucle 3 que se desordenan, lo que resulta en la ausencia de coordinación de Zn (Supplementary Fig. 2D). La ausencia de coordinación de Zn sólo se observa en otra APOBEC, la estructura CD2 de APOBEC3F (A3F)46,47. Sin embargo, las estructuras A3F-CD2 que contienen Zn o están ausentes son esencialmente idénticas, que también se alinean bien con varias otras estructuras APOBEC (Fig. suplementaria 2E), mientras que la E/Q CD2 es única en sus bucles h2 3 y 4 replegados y en la conformación del centro de Zn (Fig. suplementaria 2E, F).

Aunque es posible que la pérdida de Zn y el replegado de CD2 en la estructura E/Q sean el resultado de las mutaciones en esta construcción, investigamos si la variante E/Q tiene una actividad de catálisis defectuosa. La reversión de la E259Q en el constructo E/Q a la E259 catalítica WT (constructo E/Q*) devolvió a la variante su plena actividad en el ensayo de desaminación utilizando lisados de expresión de células HEK293T (Fig. 3 suplementaria). Además, las E/Q* que llevan las mutaciones individuales F126Y, K180S/L184S, o CD2Δloop3 (como en la estructura FKL) son todas activas, aunque la actividad de la construcción FKL* (con E259A revertida a E259) con las mutaciones combinadas es menor que E/Q* y WT. Estos resultados sugieren que aunque la estructura E/Q cristalizada, que carece de Zn en el dominio CD2, representa un estado estructural A3G catalíticamente inactivo, la reversión del residuo catalítico a E259 puede restaurar completamente su actividad deaminasa comparable a la WT. Las mutaciones combinadas en FKL afectan parcialmente a su actividad catalítica.

Debido a la diferencia de ~29° en el ángulo relativo de rotación en el empaquetamiento entre cada dominio en las estructuras FKL y E/Q, las interacciones moleculares detalladas entre CD1 y CD2 difieren entre las dos estructuras. Los dominios CD1 y CD2 en la estructura FKL interactúan entre sí principalmente a través de h3, h4 y el bucle 7 de CD1 y h1, h2, β2 y el bucle 3 de CD2 (Fig. 1a, d). En la estructura E/Q, los dos dominios interactúan principalmente a través de h3, h4 y h6 de CD1 con h2′, β2, bucle 4 y bucle 10 de CD2 (Fig. 1b, e). Como resultado, alrededor del 40% de los residuos que interactúan entre CD1 y CD2 difieren en las dos estructuras (véase una lista completa de los residuos que interactúan en la Fig. 4 suplementaria), e incluso cuando los mismos residuos están participando en esta interacción, a menudo hacen diferentes contactos de unión debido al cambio en el ángulo de empaquetamiento entre los dos dominios. La capacidad de empaquetar los dominios CD1 y CD2 con diferentes ángulos e interacciones de residuos indica un cierto grado de plasticidad en la disposición de los dominios de fl A3G.

Dímero rA3G de longitud completa y características de la zona de dimerización

La construcción E/Q se cristalizó en diferentes condiciones de pH y sal (Tabla Suplementaria 1), pero mostró sistemáticamente la misma estructura y dimerización a través de las interacciones CD1-CD1 (Fig. 2a, b), principalmente a través del empaquetamiento directo de varios residuos en h6 (K180, L184, A187), bucle 1 (I26) y bucle 7 (F126, W127) de ambas subunidades (Fig. Suplementaria 5A, B). Curiosamente, estas interacciones son idénticas a las reportadas previamente para el dominio rA3G-CD1 solo18, a pesar de la inclusión de la mutación K128D que es crítica para convertir el rA3G de insensible al Vif del VIH-1 a sensible para su degradación. Vale la pena señalar que dicha dimerización de fl rA3G sólo conduce a un pequeño aumento de la dimensión mayor de 85 Å de un monómero a 95 Å de un dímero (Fig. 2a, b).

Un examen detallado de los residuos alineados a ambos lados de la zona de interfaz dimérica revela dos características destacadas. En primer lugar, un total de 18 residuos positivos/polares e hidrofóbicos están alineados alrededor de la unión del dímero rA3G de forma adecuada para la interacción con ácidos nucleicos monocatenarios como el ARN (recuadro B de la Fig. 2). Estos 18 residuos están organizados en dos conjuntos, con el primer conjunto en el sentido de las agujas del reloj empezando por el monómero superior (en verde), R24, H181, N177, N176, K180, y continuando con el monómero inferior (en azul claro) W127, Y125, Y124, y S28, y luego con el conjunto reflejado de estos mismos residuos. En segundo lugar, a través de la dimerización, el R24 y los residuos positivos cercanos K180 y H181 de cada monómero se posicionan estrechamente en el espacio, con una distancia de unos 7 Å entre los dos residuos R24. Esta disposición espacial aumenta significativamente los potenciales electrostáticos locales (PE) de alrededor de +1,9 kT/e como monómero a +8,3 kT/e como dímero (Fig. 2c y recuadro C, Fig. 2d y recuadro D). La presencia de residuos bien alineados adecuados para la unión de ácidos nucleicos monocatenarios, así como la PE positiva mejorada (PEP) alrededor de la unión de dímeros observada, implican fuertemente que esta zona puede unir ARN como dímero, y sugiere que la interrupción de esta interfaz de dimerización de A3G puede afectar a la unión de ARN a través de la interrupción de la PEP mejorada (Fig. 2c) a la PEP baja como en una forma monomérica (Fig. 2d).

El efecto de la mutación del dímero en la asociación del ARN y la multimerización

Nuestro estudio anterior sobre el dominio CD1 por sí solo sugirió que los residuos de la interfaz del dímero FWKL (F126, W127, K180, L184) pueden estar implicados tanto en la dimerización como en la unión al ARN, ya sea a través de la interacción directa con el ARN o indirectamente generando una superficie de unión al ARN a través de la dimerización18. La inspección de la estructura del dímero fl rA3G revela que, mientras que los residuos FWKLA (F126, W127, K180, L184, A187) participan directamente en las interacciones de dimerización (Fig. Suplementaria 5A), sólo W127 es accesible para el apilamiento pi o el enlace de hidrógeno con una base de ácido nucleico, lo que sugiere que es W127 el que tiene el doble papel crítico en la dimerización o/y la unión al ARN, lo que también ha sido sugerido por estudios mutacionales anteriores15,18,40,48.

El bucle 7 de rA3G está situado cerca de la interfaz de dimerización y contiene un conjunto de residuos hidrofóbicos (Y124, Y125 y F126) que se empaquetan con W127 y probablemente lo estabilizan (Fig. 5B suplementaria). Para determinar si la dimerización es necesaria para la asociación del ARN y para considerar también el posible papel dual de W127, diseñamos un conjunto de mutantes de interfaz de dímero de rA3G que dejaban el bucle 7 sin cambiar (Tabla Suplementaria 3, Fig. Suplementaria 5A, B). Como tal, sólo se mutaron los residuos de interfaz enterrados fuera del bucle 7, generando los mutantes rM10, rM11 y rM15 (Tabla Suplementaria 3). Como control, también incluimos un mutante rM9 con cambios tanto en el bucle 7 como en el h6 de la CD1 (F126A-W127A-A187Y) que se esperaba que diera lugar a un fenotipo similar al del mutante FWKL de la CD1 solo18, es decir, la interrupción tanto de la dimerización como de la asociación del ARN. También se incluyó un rA3G casi de tipo salvaje (WT) con un cambio de bucle que mejora la solubilidad en el bucle 8 de la CD1 y su correspondiente mutante catalíticamente inactivo (construcción E/Q) (Tabla suplementaria 3). Se examinó la asociación de ARN y el estado de oligomerización de estos mutantes tras la expresión recombinante en E. coli.

Tras la purificación en columna de afinidad a partir de los lisados celulares de E. coli, se analizó la asociación de ARN de la proteína de fusión sumo-rA3G mediante urea-PAGE desnaturalizante (Fig. 3a-c). Mientras que el WT y el mutante E/Q (carriles 7, 8 en la Fig. 3b, c) tenían una asociación de ARN similar, todos los mutantes de interfaz de dímero (rM10, rM11, rM15 en los carriles 2, 3, 5, respectivamente, en la Fig. 3b, c) tenían una asociación de ARN muy reducida (carril 7) antes o después del tratamiento con RNasa A, y rM10 (T183D-L184D-A187Y), rM15 (I26A-K180S-L184S-A187E) y el mutante de control rM9 mostraban un ARN poco detectable tras pasar por el mismo proceso de purificación (carriles 1, 2, 5). La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) reveló que rM10 y rM15, así como el mutante de control rM9, eluyeron predominantemente como monómero antes y después del tratamiento con RNasa A (Fig. 3d, e; Fig. Suplementaria 6A, B), confirmando la interrupción de la dimerización/multimerización. Por lo tanto, estos resultados sugieren que, en las condiciones experimentales, la mutación de residuos enterrados dentro de la interfaz no sólo interrumpe la dimerización, sino que también afecta a la asociación de ARN incluso cuando el bucle 7 no se modifica, probablemente debido a la pérdida de la PEP mejorada como resultado de la interrupción del dímero (Fig. 2c, d).

Debido a que no pudimos realizar el mismo tipo de ensayo bioquímico para evaluar mutantes similares en la A3G humana (hA3G) debido a su escasa solubilidad, generamos un mutante quimera rA3G-hA3G (quimera h6) en el que la CD1 h6 de la rA3G se sustituye por la CD1 h6 de la hA3G (véase la tabla suplementaria 3). Esta quimera h6 se comportó de forma similar a la rA3G WT durante la purificación en términos de dimerización/multimerización antes o después del tratamiento con RNasa A (Fig. Suplementaria 7A, B), así como de asociación de ARN, especialmente después del tratamiento con RNasa A (Fig. Suplementaria 7C, D). Cabe destacar que, como se muestra en la Fig. Suplementaria 7A, B, mientras que la proteína quimera H6 también se desplazó a las fracciones dímero (D) y monómero (M) después del tratamiento con RNasa A (gel SDS-PAGE en la Fig. Suplementaria 7D), su perfil SEC muestra picos más heterogéneos que el de rA3G WT, posiblemente porque la proteína quimérica tiene tres residuos (Y181, I183, I187) de hA3G que son más hidrofóbicos que los de rA3G (H181, T183, A187), y por tanto menos estables/solubles. Estos resultados sugieren la posibilidad de que CD1 h6 pueda ser intercambiable entre rA3G y hA3G, lo que lleva a la presencia de la misma zona PEP que tiene esencialmente el mismo conjunto de residuos de superficie en ambas proteínas.

Efecto de la mutación PEP en la asociación de ARN y la multimerización

A continuación, investigamos si la superficie PEP mejorada que se forma alrededor de la unión del dímero (Fig. 2. Inset b) es importante para la asociación de ARN. Se mutaron cuatro residuos positivos/polares centrados en R24 para generar rM12 (R24T-S28A-N176A-N177D, Tabla Suplementaria 3). También se incluyó un mutante que contenía sólo R24T. La asociación al ARN de rM12 se redujo en comparación con R24T y WT (carriles 4, 6, 7 en la Fig. 3b, c), lo que indica un papel de estos residuos dentro de la zona PEP en la mejora de la unión al ARN. Sin embargo, cuando se compara con rM9 (F126A/W127A/A187Y), rM12 todavía tenía una cantidad sustancial de asociación de ARN antes y después del tratamiento con RNasa A (carriles 1, 4 en la Fig. 3b, c), posiblemente debido a la interrupción parcial de la unión del ARN al área PEP pero no a otras áreas de rA3G. Inesperadamente, el análisis SEC reveló que rM12 tenía un pico monomérico importante incluso antes del tratamiento con RNasa A (Fig. 3d, e, Fig. Suplementaria 6A, B), indicando la interrupción de la dimerización/multimerización sin mutar directamente la interfaz de dimerización. Este efecto negativo de la mutación PEP sobre la asociación del ARN y la dimerización/multimerización fue confirmado además por otros dos mutantes rA3G que contenían mutaciones PEP, rM13 y rM14 (Tabla Suplementaria 3, Fig. Suplementaria 7). Estos dos mutantes mostraron diferentes niveles de interrupción de la asociación de ARN (Fig. Suplementaria 7A) y dimerización/multimerización incluso antes del tratamiento con RNasa A bajo la condición probada (perfiles SEC y geles en la Fig. Suplementaria 7C).

Interesantemente, aunque el mutante simple R24T y el WT mostraron cantidades similares de ARN asociado detectadas por los geles de ARN en la Fig. 3b, c, el análisis detallado de SDS-PAGE de sus fracciones de pico SEC antes del tratamiento con RNasa A reveló que la mayor parte de la proteína R24T se distribuyó en las fracciones repartidas alrededor de la ubicación del pico monomérico (M) (Fig. Suplementaria 6A), lo cual es contrario al WT que se distribuye mayormente en las fracciones de volumen vacío (V). Estos resultados indican un cambio en el comportamiento de asociación y multimerización del ARN con una única mutación R24T dentro de la zona PEP, lo que coincide con estudios anteriores de mutaciones R24A14,30,38,40. En conjunto, estos resultados demuestran que, en estas condiciones de ensayo, los residuos dentro de la zona PEP mejorada de la unión del dímero (R24/S28/N176/N177) desempeñan un papel importante en la mediación de la asociación del ARN, y la asociación del ARN a través de estos residuos se requiere a la inversa para estabilizar la dimerización y la posterior multimerización de orden superior.

Efecto de las mutaciones PEP/dímero en la unión in vitro de ARN/ADN

Las estructuras de fl rA3G revelan áreas adicionales con residuos cargados positivamente fuera del área PEP mejorada como se muestra en la Fig. 2c. Aunque estos residuos cargados positivamente fuera de la zona PEP pueden no desempeñar un papel importante en la formación de complejos A3G-ARN estables, como se observó a partir de lisados celulares de E. coli, aún pueden contribuir a la unión de los sustratos ssRNA y ssDNA definidos. Para comprobarlo, cada muestra de proteína purificada se sometió a un extenso tratamiento con RNasa para eliminar la mayor cantidad posible de ARN unido, y se comprobó la afinidad de unión hacia oligómeros de ARNs de 50 nt o de ARNs mediante un ensayo de desplazamiento de gel. Todos los mutantes mostraron unión a 50 nt de ARNs o ADNs, y las constantes de disociación estimadas (Kd, Tabla Suplementaria 3) indicaron que la mayoría de los mutantes tenían una unión reducida en comparación con WT y E/Q. Estos resultados indican que en este sistema reconstituido en el que estaban presentes altas concentraciones de proteínas y ácidos nucleicos, estos diversos mutantes de la interfaz del dímero de rA3G y del área PEP siguen siendo capaces de unirse al ARN y al ssADN a través de otros residuos fuera del área PEP en la unión del dímero.

En general, la reducción de la unión de estos mutantes es más grave para la unión del ssADN que para la del ARN. Curiosamente, el ensayo de deaminasa utilizando las proteínas purificadas de estos mutantes rA3G (rM9-rM12 y rM15) reveló que estos mutantes de la interfaz del dímero y los mutantes de unión al ARN mostraron todos una actividad de deaminasa reducida en comparación con el WT (Figura suplementaria 8). La menor unión al ssDNA de estos mutantes podría explicar, al menos parcialmente, los distintos niveles de reducción de la actividad desaminasa. Sin embargo, el grado de reducción de la unión al ssDNA no parece tener una correlación estricta con el nivel de interrupción de la actividad desaminasa. Por ejemplo, el rM12 mostró la menor unión al ssDNA (Tabla Suplementaria 3) pero no es el que tiene la menor actividad desaminasa (Fig. Suplementaria 8).

Efectos de las mutaciones de la interfaz PEP/dímero en la restricción del VIH

Se sabe que la mutación W127A en el A3G humano (hA3G) interrumpe el empaquetamiento del virión y, por tanto, la restricción del VIH, probablemente por la abolición de la unión al ARN mediada por este residuo. Sin embargo, los estudios que han inducido el empaquetamiento de mutantes hA3G W127 mediante una fusión de péptidos Vpr han identificado deficiencias en la restricción del VIH15. Para obtener más información sobre el mecanismo de restricción del VIH-1 por la hA3G, diseñamos mutantes adicionales de la hA3G guiados por la estructura de la rA3G y los datos mutacionales. La intención de estas mutaciones de hA3G (Tabla Suplementaria 4) era perturbar las interacciones intramoleculares CD1-CD2 (M2, M3, M4) (Fig. Suplementaria 9A, B), perturbar la unión del ARN alrededor de la unión del dímero mutando un número creciente de residuos polares/cargados (M12, M13, M14), o perturbar las interacciones proteína-dímero mutando un número creciente de residuos enterrados (M6, M10, M11) (Fig. Suplementaria 9C). 9C).

Como era de esperar, el WT hA3G no tenía actividad de restricción del VIH-1 en presencia de Vif, pero restringía completamente el VIH-1 en ausencia de Vif, y la construcción M1 resistente a Vif (D128K) restringía completamente la infección del VIH con o sin Vif (Fig. 4a-c). Por otro lado, el mutante M9 que contiene W127A (con las mutaciones F126A/W127A/I187Y, Fig. suplementaria 9C), que se sabe que interrumpe tanto la unión del ARN como la dimerización, no tenía actividad de restricción independientemente de la presencia de Vif (Fig. 4a-c). Esto es coherente con la literatura anterior que afirma que W127 es importante para la actividad de restricción del VIH debido a su capacidad de unión al ARN que es necesaria para el empaquetamiento del virión hA3G y la restricción independiente de la desaminación de la transcripción inversa14,15. De hecho, aunque su sensibilidad a la degradación por Vif parecía estar reducida (Fig. 10A suplementaria), se empaquetó entre 5 y 10 veces menos proteína mutante M9 en el virión en presencia o ausencia de Vif en comparación con la hA3G WT (Fig. 4a, b). Estos resultados de WT y de los mutantes de control M1 y M9 de hA3G demostraron una actividad completa o una falta de actividad en nuestro estudio.

Para los mutantes diseñados para afectar a las interacciones intramoleculares CD1-CD2, se mutaron múltiples residuos cerca o dentro de la interfaz interdominio en el lado CD2 para M2 y M3 y en el lado CD1 para M4 (Fig. suplementaria 9A, B). Tanto M2 como M3 tuvieron una actividad de restricción del VIH-1 significativamente menor en ausencia de Vif (Fig. 4c). M2 que lleva mutaciones en los bucles 1 y 3 de CD2 alrededor de la interfaz con CD1 mostró una pérdida completa de actividad catalítica (Fig. 4e), probablemente porque algunos de estos residuos mutados, como H216, son importantes para la interacción del sustrato ssDNA49. M3 con mutaciones en la interfaz de CD2 con CD1, a partir de los residuos de enlace R194/H195 (Fig. suplementaria 9A, B), tenía sólo un ~10% de actividad de desaminasa WT (Fig. 4e), posiblemente debido a la pérdida de la interacción adecuada de CD2 con CD1 para afectar a la unión coordinada del sustrato de ssDNA para una actividad catalítica eficiente. La M4 que portaba múltiples mutaciones alrededor de la interfaz interdominio en CD1 mostraba características similares a la WT, lo que indica que estas mutaciones no tienen un efecto evidente sobre la capacidad de restricción. Curiosamente, esta mutación tenía una actividad catalítica completa (Fig. 4e), lo que sugiere cierta plasticidad entre las interacciones de la interfaz CD1-CD2 para las funciones.

M12 y M13 se diseñaron para interrumpir sólo la unión del ARN a la zona PEP en la unión del dímero, y M14 contiene la mayoría de las mutaciones de M12 y M13 más cuatro residuos R/K adicionales (K52/K63/R69/K76) para eliminar la única superficie con carga positiva restante en A3G-CD1 (Fig. 9C suplementaria). Sorprendentemente, todos estos mutantes mostraron un ~70% de actividad de restricción del VIH-1 en ausencia de Vif (Fig. 4c). Aunque fue difícil cuantificar la sensibilidad a Vif debido al bajo nivel de expresión persistente de M12, M13 y M14 en el ensayo de sensibilidad a Vif (Fig. 10A suplementaria), los tres mutantes, al igual que el WT, no mostraron ninguna actividad de restricción del VIH en presencia de Vif (Fig. 4c), lo que sugiere que, de hecho, seguían siendo suficientemente sensibles a la degradación mediada por Vif. La razón por la que la actividad de restricción del VIH-1 de M12-14 fue de sólo el 70% no se debió a sus menores niveles de proteína en estado estacionario detectados en lisados de células HEK293T (Fig. 4a, b), ya que la transfección de menos plásmido de expresión de WT para lograr niveles de expresión celular similares a los de M12-M14 todavía dio lugar a una restricción del VIH-1 ~4 veces mayor que la de WT (Fig. 10B suplementaria). Esto es consistente con la actividad de restricción independiente de la desaminación, ya que estos tres mutantes tenían una actividad de desaminación interrumpida (Fig. 4d, e). Especialmente M14 tenía una pérdida completa de la actividad deaminasa (Fig. 4e). La tasa de mutación de fondo de M14, basada en los resultados de la secuenciación del ADN proviral, es consistente con esto (Tabla Suplementaria 5). Y, sin embargo, mostró una actividad de restricción del VIH-1 de ~70%. Estos resultados demuestran claramente que los residuos mutados en M12-14 para interrumpir la unión del ARN en el PEP y las zonas cercanas en CD1 mostraron sólo un defecto parcial en la restricción del VIH, lo que indica que conservaron cierto nivel de encapsulamiento del virión y de restricción del VIH-1, lo que contrasta con el papel de la unión del ARN mediada a través de mutaciones que contienen W127 en el mutante M9, que es crítica para el encapsulamiento del virión y la restricción del VIH (Fig. 4a-c).

Los mutantes que pretenden interrumpir sólo las interacciones proteína-dímero con un número creciente de mutaciones son de M6 a M11 (Tabla Suplementaria 4, Fig. Suplementaria 9C). M6 y M7 mostraron sólo una pérdida parcial de la actividad de restricción en ausencia de Vif, a pesar de la pérdida del 95% de la actividad catalítica para M7 debido a las tres mutaciones adicionales en CD2 (Fig. 4e). Por lo tanto, las mutaciones en M6 y M7 no son críticas para la restricción del VIH. M10 mostró un fenotipo más severo en la restricción del VIH-1 en ausencia de Vif a pesar de que retuvo cierta actividad catalítica (Fig. 4e), lo que sugiere que las mutaciones en M10 son importantes para el empaquetamiento del virión y la restricción del VIH. M11 es similar a M10 en la actividad desaminasa, pero con un fenotipo menos severo en términos de actividad de restricción e integración (Fig. 4c, d). Es posible que M11 retuviera más capacidad de unión al ARN que M10 (a partir de rM10-11 del análisis del mutante rA3G, Fig. 3a-e), dando lugar a un fenotipo menos severo. En conjunto, estos resultados mostraron que la mutación de residuos dentro de la interfaz proteína-dímero enterrada por sí sola seguía reteniendo la actividad de restricción del VIH a niveles reducidos (Fig. 4c), y la interrupción de la actividad de la deaminasa de estos mutantes (Fig. 4e) puede explicar parcialmente la reducción de la actividad de restricción del VIH. Esto también contrasta con el mutante M9, que no mostró ninguna actividad de restricción del VIH (Fig. 4a-c).