Descubrimiento, actividad y caracterización de una polisacárido oxigenasa lítica AA10 del simbionte del gusano de mar Teredinibacter turnerae

Expresión y caracterización enzimática de la AA10 LPMO de T. turnerae

La gamma-proteobacteria T. turnerae es el único endosimbionte encontrado dentro de las branquias de los gusanos de mar que ha sido aislado con éxito, cultivado y mapeado su genoma. Mediante la anotación automatizada y las búsquedas manuales de BLAST en el proteoma predicho de T. turnerae, identificamos un gen (secuencia de referencia del NCBI: WP_019602454.1) que codifica un LPMO AA10 (en adelante TtAA10A). La secuencia de la proteína predicha presenta un péptido señal N-terminal, el dominio LPMO y una región enlazadora rica en serina seguida de un dominio del módulo de unión a carbohidratos (CBM) 10 (Fig. 1a). Se han encontrado AA10s con dominios CBM2, CBM3, CBM5, CBM10, CBM12, CBM18 y CBM73 anexos (comunicación personal de Bernard Henrissat) y se sabe que son activos en celulosa o quitina. Se cree que los dominios CBM10 se unen a la celulosa y, por lo tanto, pueden proporcionar un reconocimiento de la celulosa que probablemente no esté asociado a un evento catalítico . Aunque es diferente de los CBMs que se encuentran comúnmente unidos a las proteínas AA10 , su presencia en la estructura del dominio del gen TtAA10A da una indicación de que esta proteína puede ser principalmente activa en polisacáridos basados en glucosa.

Después de múltiples intentos de expresar el gen con varias etiquetas de afinidad y solubilidad y diferentes señales de secreción, se obtuvo finalmente una proteína suficiente para el análisis a través de la producción de un dominio catalítico LPMO marcado con strep C-terminal (de His25 a Gly228) en E. coli (Fig. 1b). La proteína etiquetada purificada se cargó con un exceso de cobre, se desalquiló mediante cromatografía de exclusión de tamaño, se analizó su pureza mediante SDS-PAGE (Fig. 1c) y la identificación de la proteína basada en la espectrometría de masas (no mostrada), y se utilizó para los experimentos posteriores.

La TtAA10A recombinante (dominios catalíticos, 25-228, solamente) muestra las características de una AA10 correctamente plegada. El análisis de desplazamiento térmico (Thermofluor) de la TtAA10A purificada y cargada de Cu indica una temperatura de fusión (Tm) de 50,4 °C. La eliminación del cobre con 10 mM de EDTA reduce la Tm a 42,5 °C, lo que sugiere un efecto estabilizador de la proteína por parte del cofactor metálico, tal y como se ha informado en la literatura anterior para otros LPMOs (por ejemplo , Fig. 1d). También observamos una variabilidad en las preparaciones de proteínas, con algunas preparaciones que contenían un solo Cu (centro activo), mientras que otras contenían dos átomos de Cu, descritos a continuación.

Se llevaron a cabo ensayos de actividad, tanto en muestras de uno como de dos sitios de Cu, en una gama de sustratos de polisacáridos comerciales (Avicel, β-chitina de pluma de calamar, α-chitina de cáscara de camarón, celohexaosa, almidón de maíz, paquima, xilano de haya, glucomanano, xiloglucano, liquenano, galactano, galactomanano y manano) en presencia del cofactor reductor, el ácido gálico. Las muestras se analizaron después de 24 horas mediante MALDI-TOF MS y las masas de los picos de los productos de reacción se compararon con los datos publicados anteriormente, revelando un patrón de oxidación mixto C1-C4, exclusivamente en la celulosa, y dependiente de la presencia del donante de electrones (Fig. 2a, b). No se detectaron productos en ninguno de los controles negativos (archivo adicional 1: Figura S1). El análisis MALDI-TOF MS del extracto crudo de los ensayos de actividad realizados con TtAA10A cargado de Cu en presencia de 10 mM de EDTA no detectó la liberación de productos (datos no mostrados), indicando que, como se esperaba, el cobre es esencial para la actividad.

Se realizaron experimentos de sinergia coincubando la TtAA10A y las glucósido hidrolasas comerciales (GH6 y GH9) en presencia de Avicel y ácido gálico, y se cuantificaron los mono y oligosacáridos resultantes mediante cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento (HPAEC). Mientras que las reacciones que contenían LPMO o GH por sí solas liberaban cantidades insignificantes de azúcares libres, las reacciones de coincubación mostraron un fuerte efecto sinérgico, potenciado por la presencia del donante de electrones (Fig. 2c, d, Archivo adicional 2: Figura S2). Cabe destacar que las dos GHs comerciales (GH6 y GH9) analizadas durante estos experimentos pertenecen a familias que fueron identificadas como las más abundantes en el proteoma digestivo de los gusanos de mar, lo que refuerza la relevancia biológica de los ensayos de actividad mencionados en el contexto de la digestión de la madera en el medio de los gusanos de mar.

Espectroscopia de resonancia paramagnética de electrones

Nuestra primera evidencia de que algunas preparaciones de proteínas contenían dos sitios de Cu provino de los análisis de EPR. El espectro CW-EPR de banda X en solución congelada (165 K) de la TtAA10A saturada de Cu (Fig. 3) mostraba dos conjuntos de picos hiperfinos en la región paralela del espectro, lo que indicaba la presencia de dos geometrías de coordinación de cobre distintas, derivadas bien de diferentes entornos de coordinación dentro de un mismo sitio (por ejemplo, diferencias en los estados de protonación de los ligandos) o de un segundo sitio de unión de cobre distinto. De hecho, se pudo obtener una simulación precisa de la región paralela del espectro con dos especies diferentes, cada una de las cuales ofrecía un conjunto diferente de parámetros del Hamiltoniano de espín, gz = 2,267 y |Az| = 425 MHz (especie 1), y gz = 2,314 y |Az| = 465 MHz (especie 2), Tabla 1, con una relación entre las especies 1 y 2 de aproximadamente 3:2. El valor de gz de la especie 2 es alto en comparación con lo que cabría esperar para la típica coordinación de cobre AA10 LPMO en el sitio activo (la espectroscopia de LPMOs se ha revisado recientemente en la Ref. ), sobre la base de lo cual asignamos la especie 1 a un cobre unido al sitio activo de la abrazadera de histidina canónica. Sus valores de Hamiltoniano de espín son típicos de una geometría de coordinación de Cu axial que contiene una mezcla de ligandos N y O-donantes . (Nótese que la especie 2 no puede ser de una especie de cobre libre en solución ya que todas las especies de moléculas pequeñas se eliminan durante la preparación de la proteína; por lo tanto, todas las señales de cobre en la EPR surgen del cobre unido a la proteína.)

Para determinar si las dos señales procedían de un único sitio de unión de cobre con diferentes geometrías de coordinación, o de dos sitios de cobre distintos, se realizó un experimento de valoración CW-EPR en banda X. La proteína se trató previamente con EDTA (10 veces la concentración de proteína) para eliminar el cobre y luego se cambió el tampón para eliminar el EDTA. Se analizó esta muestra de proteína sin cobre y, como se esperaba, no mostró ninguna señal basada en el cobre. La adición de 0,2 equivalentes de cobre (en comparación con la concentración de proteína) mostró una única señal en la región paralela, asignada al ion cobre (II) dentro del sitio activo de la abrazadera de histidina (especie 1). Nuevas adiciones de cobre aumentaron esta señal de cobre de la abrazadera de histidina, con un crecimiento concomitante de la señal para la especie 2, ya evidente después de 0,4 equivalentes de cobre (archivo adicional 3: Figura S3). Estos experimentos de valoración se realizaron a un pH fijo y muestran que las dos especies en el espectro EPR de la TtAA10A saturada de cobre representan dos sitios diferentes de unión al Cu con afinidades de unión al cobre ligeramente diferentes, donde la especie 1 es el sitio de mayor afinidad. Además, la muestra de TtAA10A con 0,4 equivalentes de Cu se dejó a 4 °C durante 48 horas y se volvió a examinar su espectro EPR. Esta muestra no mostró ninguna diferencia en la proporción de especies de cobre, lo que demuestra que los diferentes sitios de unión no surgieron debido a grandes diferencias en la cinética de unión del cobre.

Notablemente, en varias preparaciones que produjimos, se aisló una muestra de TtAA10A que exhibió sólo una única señal de cobre en el espectro EPR. Las razones de esta diferencia en la estequiometría del cobre de la proteína aislada no están claras, ya que estas muestras se prepararon ostensiblemente utilizando condiciones idénticas a las que permitieron obtener TtAA10A con dos señales de Cu distintas en el espectro EPR de banda X (especie 1 y especie 2). No pudimos detectar ninguna diferencia en la actividad de estas preparaciones con ocupación única de cobre en relación con las muestras anteriores, pero pudimos aprovechar estas muestras para medir los espectros CW-EPR en banda X y en banda Q para el Cu del centro activo de TtAA10A (Fig. 4) con sólo la férula de histidina ocupada, a juzgar por la referencia a los espectros anteriores. Esta muestra, por lo tanto, nos permitió realizar un ajuste simultáneo de los espectros de la banda X y de la banda Q para obtener parámetros hamiltonianos de espín más precisos para el ion de cobre en el centro activo de la abrazadera de histidina (especie 1). Estos valores se recogen en la Tabla 2. La adición de PASC a TtAA10A no causó ningún cambio en los espectros EPR (datos no mostrados).

Estructura 3D de TtAA10A

Para obtener más información sobre la base molecular de las propiedades bioquímicas de TtAA10A, y para sondear esta estructura dual de Cu, potencialmente inusual, determinamos la estructura cristalina de la proteína expresada recombinantemente con una resolución de 1,4 Å (archivo adicional 4: Tabla S1). La estructura general reveló un pliegue central similar al de la inmunoglobulina, decorado por bucles y un haz helicoidal, como se observa típicamente en las enzimas de esta familia (Fig. 5). De hecho, las comparaciones estructurales utilizando el servidor DALI revelan las coincidencias estructurales más cercanas con Cellvibrio japonicus AA10A (PDB ID 5fjq) y Serratia marcescens CBP21 (PDB ID 2bem) con RMSDs de 2,4 Å y 2,3 Å sobre 180 y 170 posiciones Cα, respectivamente, lo que representa sólo un 30% de identidad a nivel de secuencia. Dada la elevada actividad de la TtAA10A sobre la celulosa, puede resultar algo sorprendente que las dos coincidencias estructurales más cercanas a esta enzima sean AA10s activas en la quitina. Sin embargo, la tercera coincidencia estructural más cercana fue la AA10 de Streptomyces coelicolor (ScAA10, PDB ID 4oy7), que es una AA10 específica de la celulosa y que da una RMSD de 2,5 Å sobre 160 átomos Cα. TtAA10A y ScAA10 comparten sólo el 26% de identidad de secuencia a pesar de que son activos en el mismo sustrato, lo que pone de manifiesto aún más la dificultad de relacionar la especificidad de sustrato de LPMO basándose sólo en la secuencia y la estructura general (se discute más en el contexto de AA9 en la Ref. ).

Como para todos los LPMOs estudiados hasta ahora (según su actividad), el sitio activo de TtAA10A está formado por el motivo de «abrazadera de histidina» que se encuentra en el centro de una superficie casi plana (Fig. 5a, b). Se modeló un único ion de cobre en esta posición coordinado en una geometría típica en forma de T por el amino terminal y la cadena lateral de His 1 y el imidazol de la cadena lateral de His 107. En las posiciones axiales alrededor del ion cobre del sitio activo, TtAA10A tiene Phe 195 y Gly 105. Estas posiciones suelen estar ocupadas por una fenilalanina/tirosina y una cadena lateral de alanina, respectivamente, en otros AA10. Esta última se ha implicado en la creación de un entorno estérico que impulsa la formación de la geometría de coordinación del sitio activo distorsionada que se observa en las AA10 específicas de quitina en su estado de oxidación de Cu(II). En este caso, la sustitución de Ala por Gly permite que el cobre del sitio activo adopte una geometría de coordinación ligeramente más axial, más cercana a la típica de las AA9 y las AA10 activas por celulosa, y consistente con los parámetros del Hamiltoniano de espín de la especie 1 en nuestro análisis EPR descrito anteriormente, Fig. 4. Las estructuras cristalinas de los LPMO a menudo se ven afectadas por la foto-reducción como resultado del daño de la radiación, de modo que la geometría en reposo del sitio activo no puede observarse directamente en las estructuras cristalinas (los ejemplos incluyen ). El análisis de la esfera que rodea al ión cobre en TtAA10A revela sólo una débil densidad para una molécula de agua a 2,6 Å del cobre y una densidad más fuerte para una segunda molécula de agua a 3,2 Å de distancia que se une por hidrógeno a Glu 53. Estas moléculas de agua están demasiado alejadas del cobre para ser consideradas como de coordinación directa. Por lo tanto, parece que el cobre en esta enzima también ha sufrido una foto-reducción al estado de oxidación Cu(I).

Nuestra estructura revela la posición del segundo sitio de unión del cobre que se observó en los espectros EPR. Este sitio se encuentra a 14,4 Å (Cu…Cu) del ion de cobre del corchete de histidina en un gran parche cargado negativamente en la superficie de la proteína (Fig. 5a, b; Archivo adicional 5: Figura S4). Este segundo ion de cobre está directamente coordinado por His 165, Glu 5, Asp 101, una molécula de agua e His 207* que es proporcionada por el Strep-tag de una molécula adyacente en el cristal. Debido a la observación de esta interacción, comprobamos el estado oligomérico de la proteína en solución utilizando SEC-MALLS (archivo adicional 6: Figura S5). Esto confirmó que la proteína es monomérica, lo que sugiere que la interacción cobre-His207* es un artefacto del cristal (aunque puede indicar una posible interacción proteína-proteína). Sin embargo, sumada a los datos de la EPR, la estructura sugiere que este segundo sitio está ocupado en solución, con His 207* probablemente sustituido por una molécula de agua. La alineación de secuencias múltiples de los 500 principales ortólogos de TtAA10A identificados a través de búsquedas en BlastP muestra que, mientras que un residuo ácido en la posición 5 no es infrecuente entre AA10s, los residuos 101 y 165 se conservan en gran medida sólo dentro de LPMOs de bacterias que están estrechamente relacionadas con Teredinibacter.

Ha habido un debate considerable sobre las posibles posiciones en las que los donantes de electrones, tanto de moléculas pequeñas como de proteínas, pueden unirse a las LPMOs para permitir la catálisis cuando la enzima está unida a la superficie del sustrato sólido (véase, por ejemplo ). De hecho, el examen de la estructura de la TtAA10A en busca de posibles vías de transferencia de carga utilizando el programa EHPath muestra que entre la histidina 1 y la tirosina 3 (con una separación de 10 Å) existe una clara y rápida vía de salto de agujeros con un tiempo medio de residencia de los mismos de sólo 20 ms. La tirosina 3 es adyacente (5,3 Å) al segundo sitio de Cu, proporcionando así una vía eficiente de transferencia de carga entre los dos sitios de cobre. Por lo tanto, dada la posible vía de transferencia de carga entre los dos sitios de cobre, investigamos si el segundo sitio metálico (en nuestro caso ocupado por el cobre, aunque no pudimos desplazar el Cu con sales de Fe, Ni, Zn y Mn) representa un sitio de unión para un socio redox proteínico (la unión de otra proteína a este sitio está insinuada por la asociación de la etiqueta Strep con una molécula vecina en la red cristalina), e intentamos extraer proteínas del secretoma previsto de T. turnerae que pudieran interactuar de forma estable con TtAA10A utilizando una columna de afinidad (StrepTrap HP) inmovilizada con TtAA10A. Estos experimentos (datos no mostrados) no condujeron al aislamiento de ningún candidato a activador basado en proteínas para TtAA10A, pero no se puede descartar que una enzima activadora pueda unirse transitoriamente en esta región para permitir la transferencia de electrones a la LPMO y, por tanto, el inicio de la catálisis. Sin embargo, hay que tener en cuenta que durante el refinamiento de la estructura, también identificamos un sitio de unión de sodio en la superficie de la proteína (archivo adicional 7: Figura S6). Si estos sitios de unión adicionales son el resultado de la mayor carga que esta proteína puede tener para ser estable en el entorno salino en el que reside T. turnerae sigue siendo una cuestión abierta. No obstante, estas características de la superficie de TtAA10A pueden ser de interés para los ingenieros de enzimas si los LPMOs deben ser estabilizados o adaptados a condiciones específicas para ser desplegados en biorreactores industriales.