Efectos antiasmáticos de la decocción de Sanglong Pingchuan a través de la inducción de una respuesta inmunitaria Th1/Th2 equilibrada
- Abstracto
- 1. Introducción
- 2. Materiales y métodos
- 2.1. Materiales y reactivos vegetales
- 2.2. Preparación de SLPCD
- 2.3. Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) Análisis de SLPCD
- 2.4. Animales experimentales
- 2.6. Histopatología pulmonar
- 2.7. Recogida de líquido de lavado broncoalveolar (BALF) y citometría de flujo
- 2.8. Medición del anticuerpo IgE total en suero
- 2.9. Medición de citoquinas en el BALF
- 2.10. PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)
- 2.11. Análisis estadístico
- 3. Resultados
- 3.1. Perfil HPLC del SLPCD
- 3.2. El SLPCD atenuó la inflamación de las vías respiratorias en ratones asmáticos
- 3.4. SLPCD disminuyó los niveles de IgE total en suero de los ratones asmáticos
- 3.5. El SLPCD moduló los niveles de citoquinas en el BALF de ratones asmáticos
- 3.6. El SLPCD reguló los niveles de expresión del ARNm de las citocinas en los tejidos pulmonares de los ratones asmáticos
- 4. Discusión
- Divulgación
- Conflictos de intereses
- Contribuciones de los autores
- Agradecimientos
Abstracto
Objetivo. Investigar los efectos antiasmáticos de la decocción de Sanglong pingchuan (SLPCD) y explorar sus mecanismos de acción. Métodos. El suero, el líquido de lavado broncoalveolar (BALF) y los tejidos pulmonares de ratones con asma alérgica inducida por OVA se recogieron 24 h después de la última administración. Se observaron cambios patológicos en los pulmones mediante tinción con H&E. Las células inflamatorias en el BALF se contaron por citometría de flujo. Los niveles de IgE total en suero y de citoquinas en el BALF se determinaron mediante ELISA. Los niveles de expresión del ARNm de las citocinas en el pulmón se analizaron mediante qRT-PCR. Resultados. El SLPCD inhibió significativamente la inflamación de las vías respiratorias, redujo las células inflamatorias en el BALF, redujo los niveles de IgE total en el suero y de citoquinas Th2 (IL-10 e IL-13) en el BALF, y reguló a la baja los niveles de expresión del ARNm de las citoquinas Th2 (IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13) en el pulmón de ratones asmáticos. Sin embargo, el SLPCD elevó notablemente el nivel de la citoquina Th1 IFN-γ en el BALF y aumentó los niveles de expresión del ARNm de las citoquinas Th1 (IL-2 e IFN-γ) en el pulmón de los ratones asmáticos. Conclusión. El SLPCD podría atenuar la inflamación de las vías respiratorias y aliviar la patogénesis en ratones asmáticos mediante la inducción de una respuesta Th1/Th2 equilibrada y podría actuar como un fármaco eficaz para el tratamiento del asma.
1. Introducción
El asma es una enfermedad respiratoria compleja y crónica que se caracteriza por la hiperreactividad bronquial, la inflamación y remodelación de las vías respiratorias, la obstrucción del flujo de aire y la infiltración de diferentes tipos de células inflamatorias inducidas por citoquinas y otros mediadores . El asma está causada por factores ambientales como los alérgenos, los virus y las exposiciones laborales en individuos genéticamente predispuestos; sin embargo, su causa definitiva no está clara. La incidencia del asma ha aumentado significativamente en todo el mundo, especialmente en los niños pequeños, hasta convertirse en una de las enfermedades respiratorias más comunes. Se estima que 300 millones de individuos están afectados por el asma en diferentes países.
Actualmente, los corticosteroides son los fármacos más eficaces para el tratamiento del asma. Aunque estos fármacos pueden mejorar los síntomas del asma, no curan esta enfermedad . Estos agentes también tienen efectos secundarios graves, especialmente en los niños, como la supresión inmunitaria, las infecciones secundarias, la atrofia muscular, la osteopenia, la osteoporosis, las cataratas y el glaucoma. Por lo tanto, la búsqueda continua de fármacos nuevos, seguros y eficaces es de suma importancia.
Muchos medicamentos tradicionales chinos se han utilizado en el tratamiento del asma durante siglos y todavía se utilizan ampliamente en los países asiáticos . Recientemente, se ha informado sobre el mecanismo de acción de numerosas fórmulas herbarias utilizadas para el tratamiento del asma alérgica . También se han examinado varios productos naturales derivados de plantas con propiedades antiinflamatorias para su posible aplicación en el tratamiento del asma.
La decocción de Sanglong pingchuan (SLPCD) es un preparado hospitalario prescrito por el profesor Qing Chang, veterano médico nacional de medicina tradicional china heredado mentor del estudio, en el Hospital de Medicina Tradicional China de Shaoxing. SLPCD se deriva de Shegan Mahuang Tang por adición y sustracción. Shegan Mahuang Tang es una conocida medicina tradicional china de prescripción mencionada por primera vez en Jin Kui Yao Lve. Como formulación representativa de disipar el frío, aliviar el síndrome exterior, calentar el pulmón, eliminar la flema y aliviar el asma, Shegan Mahuang Tang se utiliza ampliamente para el tratamiento del asma, la bronquitis en los niños, el asma bronquial, la neumonía, la bronquitis aguda y crónica de los ancianos, el enfisema y la rinitis alérgica . La fórmula del SLPCD se compone de trece medicamentos chinos tradicionales que se enumeran en la Tabla 1. Un ensayo aleatorio demostró que el SLPCD es eficaz en el tratamiento del asma, especialmente en la reducción de la tasa de exacerbación. Sin embargo, la eficacia del SLPCD no se ha demostrado mediante experimentos controlados.
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El nombre de la planta se ha comprobado con http://www.theplantlist.org mencionando los datos de acceso a esa web.
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En el presente estudio, para proporcionar una base experimental para la aplicación clínica del SLPCD en el tratamiento del asma y para explorar sus mecanismos de acción, utilizando el modelo de ratón de asma alérgica inducida por OVA, se investigaron los efectos antiinflamatorios del SLPCD mediante el examen histológico, el recuento de células inmunitarias en el líquido de lavado broncoalveolar (BALF), la cuantificación de la IgE total en el suero, la citocina en el BALF y la expresión del ARNm de la citocina en los tejidos pulmonares.
2. Materiales y métodos
2.1. Materiales y reactivos vegetales
Cortex Mori (número de lote: 140901), Pheretima Aspergillum (número de lote: 150406), Herba Ephedrae procesada con miel (número de lote: 150302), Rhizoma Belamcandae (número de lote: 141213), Semen Armeniacae Amarum (número de lote: 150312), Fructus Perillae salteado (número de lote: 150115), Scorpio (número de lote: 150126), Semen Descurainiae (número de lote: 150208), Flos Farfarae frito con miel (número de lote: 150301), Herba Houttyniae (número de lote: 150327), Rhizoma Fagopyri Dibotrydis (número de lote: 150308), Radix Angelicae Sinensis (número de lote: 150213), y Radix et Rhizoma Glycyrrhizae (número de lote: 140917) se adquirieron en el Hospital de Medicina China de Shaoxing y fueron autentificados por el profesor Yonghai Jiang del Instituto de Control de Alimentos y Medicamentos de Shaoxing, Zhejiang, China. Los estándares de ácido clorogénico y rutina se adquirieron en el Instituto de Control de Alimentos y Medicamentos de Zhejiang, Hangzhou, China, y las purezas de ambos compuestos fueron superiores al 98%.
La ovoalbúmina (OVA) se adquirió en Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, EE.UU.; los kits ELISA de detección de IL-10, IL-13 e IFN-γ de ratón se adquirieron en Wuhan Boster Biological Technology Co. Ltd., Hubei, China; el kit ELISA de IgE de ratón fue de RayBiotech Inc, Norcross, GA, EE.UU., el suero fetal de ternera (FCS) fue de Gibco, Grand Island, NY, EE.UU. Los anticuerpos purificados contra CD16/CD32 de ratón (bloque de receptores Fc), Ly-6G-FITC (clon: RB6-8C5), antígeno F4/80 PE-Cy5 (clon: BM8), Ly-6C-APC (clon HK1.4), Fc epsilon Receptor 1 alfa (FceR1)-APC (clon: MAR-1), CD117 (c-Kit)-PE-Cy5 (c-Kit, clon: 2B8), y siglec-F-PE (clon: E50-2440) fueron adquiridos de eBioscience, Inc, San Diego, CA, Estados Unidos. El reactivo Trizol se compró a Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.; la transcriptasa inversa revert Aid™ M-MLV fue de Fermentas, Amherst, NY, EE.UU.; el inhibidor de ribonucleas y el oligo(dT)18 fueron de Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd., China; FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) fue de Roche Diagnostics, Indianápolis, IN, EE.UU. El gel de hidróxido de aluminio (Alum) se compró a China Animal Husbandry Industry Co., Ltd., Pekín, China; la dexametasona (Dex) era de Hubei Tianyao Pharmaceutical Co., Ltd., Xiangyang, China.
2.2. Preparación de SLPCD
Los medicamentos de prescripción de SLPCD (440 g) se maceraron en 8 alícuotas de agua destilada durante 30 min y luego se hirvieron en agua durante 1 h. Después de la primera decocción, los posos se hirvieron en 6 alícuotas de agua destilada durante otros 30 min. El sobrenadante obtenido de la doble decocción se filtró a través de una gasa estéril y se concentró mediante un rotavapor (Buchi, Suiza) a presión reducida a 65°C hasta alcanzar una concentración final de 1,1 g de droga bruta/ml. La decocción concentrada se almacenó a -20°C y posteriormente se diluyó con agua destilada hasta alcanzar varias concentraciones diferentes antes de su uso.
2.3. Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) Análisis de SLPCD
El análisis por HPLC se realizó utilizando una columna Diamon C18 (250 mm × 5 mm, 5 μm) y un detector Waters 2996 PDA en el instrumento HPLC Water 600E. La fase móvil fue una mezcla de acetonitrilo (A) y ácido fosfórico al 0,1% (B). Se realizó una elución en gradiente lineal como sigue: 0-8 min al 2% de A, 8-35 min al 6% de A, 35-40 min al 8% de A, 40-45 min al 13% de A, 45-70 min al 14% de A, 70-80 min al 17% de A y 80-90 min al 17-2% de A. El caudal fue de 1 ml/min y el volumen de inyección de 10 μl. La temperatura de la columna se mantuvo constantemente a 30 °C. El análisis por HPLC de los estándares (ácido clorogénico y rutina) y de las muestras se llevó a cabo bajo la condición experimental establecida como se ha mencionado anteriormente.
2.4. Animales experimentales
Ratones BALB/c hembra de 5 semanas de edad fueron adquiridos en el Centro de Animales Experimentales de Shanghái de la Academia China de Ciencias, Shanghái, China (certificado nº SCXK 2007-0005). Los ratones fueron aclimatados durante 1 semana antes de su utilización. Se les proporcionó ad libitum comida de laboratorio para roedores y agua del grifo y se les mantuvo en condiciones controladas con una temperatura de 24 ± 1°C, una humedad del 50 ± 10% y un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 horas. Todos los procedimientos se ajustaron estrictamente a la legislación de la República Popular China sobre el uso y el cuidado de los animales de laboratorio y a las directrices establecidas por el Instituto de Animales Experimentales de la Universidad de Zhejiang, y fueron aprobados por el comité universitario de experimentos con animales. Sensibilización, desafío y tratamiento de ratones
Los ratones BALB/c hembra se dividieron en seis grupos: grupo de control normal (NC), grupo de control modelo (MC), grupo de control positivo (tratado con Dex, 2 mg/kg) y grupos SLPCD (5,5, 11 y 22 g/kg). Cada grupo constaba de diez ratones. La inflamación de las vías respiratorias de los ratones fue inducida por OVA. Los animales fueron inmunizados por inyección intraperitoneal de una solución que contenía 50 μg de OVA y 200 μg de hidróxido de aluminio durante 3 días. Se administró una sensibilización de refuerzo el día 14. Una semana después de la última sensibilización, los ratones fueron expuestos a OVA aerosolizado al 2% utilizando el nebulizador PARI TurboBOY N (1205) (PARI GmbH, Alemania) durante 1 h al día durante 8 días. Cuatro días antes de ser desafiados, los ratones sensibilizados fueron administrados por vía oral con SLPCD en dosis de 5,5, 11 y 22 g/kg o inyectados por vía intraperitoneal con 2 mg/kg de dexametasona (Dex) cada día durante 12 días. Los grupos de control del modelo recibieron el mismo volumen de solución salina. El volumen de la dosis fue de 0,2 ml/10g de peso corporal. Diez ratones, como grupo de control normal, sólo fueron sensibilizados y desafiados con solución salina. Los procedimientos empleados para la sensibilización a OVA y los desafíos, así como el tratamiento con SLPCD, se mostraron en la Figura 1.
2.6. Histopatología pulmonar
Los tejidos pulmonares se recogieron 24 h después de la última administración y luego se fijaron con paraformaldehído al 4%, se incrustaron en parafina y se seccionaron a espesores de 5 μm. Una serie de microsecciones se tiñó con hematoxilina y eosina (H&E) para su evaluación histológica.
2.7. Recogida de líquido de lavado broncoalveolar (BALF) y citometría de flujo
El BALF se recogió mediante lavado del pulmón con solución amortiguadora de fosfatos (PBS) administrada a través de un catéter endotraqueal 24 h después de la última administración. El BALF se centrifugó durante 5 minutos y las células se lavaron con PBS frío que contenía un 2% de FCS. Las células se bloquearon con 0,5 μg de anticuerpo purificado anti-ratón CD16/CD32 (bloqueo FcR) durante 10 min en hielo para inhibir la tinción inespecífica y luego se tiñeron con la combinación de anticuerpos anti-ratón Ly-6G-FITC, antígeno F4/80-PE-Cy5 y Ly-6C-APC, o FceR1-APC, CD117-FITC y Siglec-F-PE a temperatura ambiente durante 30 min en la oscuridad. Las células teñidas se lavaron con PBS frío y se resuspendieron en PBS. Se analizaron cien mil células viables por tratamiento utilizando un citómetro de flujo BD FACScan con el software CellQuest.
2.8. Medición del anticuerpo IgE total en suero
El suero se recogió 24 h después de la última administración. El anticuerpo IgE total se detectó en muestras individuales de suero mediante el kit RayBio® mouse IgE ELISA. Las muestras de suero diluidas 1:1250 o el estándar de IgE se añadieron a placas de 96 pocillos recubiertas con anticuerpos específicos contra la IgE de ratón. Las placas se incubaron durante 2,5 h a temperatura ambiente y luego se lavaron cuatro veces. Se añadió el anticuerpo detector a cada pocillo. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h antes de añadir el ABC conjugado con peroxidasa de rábano. Tras la incubación durante 45 minutos, las placas se lavaron y se revelaron con TMB durante 30 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo añadiendo 20 μl de solución de parada. La absorbancia se midió en el lector de ELISA (BIO-RAD 680) a 450 nm.
2.9. Medición de citoquinas en el BALF
Las concentraciones de citoquinas Th2 (IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13) y Th1 (IFN-γ e IL-2) en el BALF se detectaron utilizando kits comerciales de ELISA como se ha hecho anteriormente.
2.10. PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)
Los niveles de expresión del ARNm de las citocinas Th2 (IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13) y Th1 (IFN-γ e IL-2) en los tejidos pulmonares se determinaron mediante qRT-PCR. El ARN total se aisló de tejidos pulmonares homogeneizados utilizando el reactivo Trizol de acuerdo con el protocolo del fabricante, y la transcripción inversa se llevó a cabo como anteriormente. A continuación, se llevó a cabo la amplificación en 20 μl de reacción utilizando FastStart Universal SYBR Green Master. La PCR en tiempo real se realizó con un sistema de PCR en tiempo real ABI 7400. Los cebadores para la qRT-PCR fueron sintetizados por Sangon Biotech (Shanghai) Co. (China), y las secuencias se enumeran en la Tabla 2. El ciclo de la qPCR se realizó de la siguiente manera: desnaturalización inicial a 95°C durante 10 minutos, seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 95°C durante 10 s y de recocido a 60°C durante 1 minuto. Se utilizó GAPDH como control endógeno. Se verificó la eficacia de la amplificación y la especificidad de cada conjunto de cebadores. Los niveles de expresión de los genes analizados en relación con GAPDH se determinaron utilizando el método y como inducción de pliegues .
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2.11. Análisis estadístico
Los datos se expresaron como media ± desviación estándar (SD) y se examinaron para su significación estadística de diferencia con ANOVA y una prueba post hoc de Tukey. -Los valores inferiores a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
3. Resultados
3.1. Perfil HPLC del SLPCD
El contenido de ácido clorogénico y rutina en el SLPCD se analizó mediante HPLC. En comparación con los compuestos de referencia estándar, se identificaron y determinaron el ácido clorogénico y la rutina (Figura 2). Las ecuaciones de regresión de la curva de calibración de los estándares fueron A = 3719,7C – 102166 (R2=0,9999) y A = 9137,3C – 408038 (R2=0,9996) para el ácido clorogénico y la rutina, respectivamente. Las concentraciones de ácido clorogénico y rutina en el SLPCD fueron de 1,4 mg/g y 0,15 mg/g, respectivamente.
(a)
(b)
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3.2. El SLPCD atenuó la inflamación de las vías respiratorias en ratones asmáticos
El efecto del SLPCD sobre la inflamación pulmonar en ratones asmáticos inducidos por OVA se observó mediante tinción con H&E, y los resultados se mostraron en la Figura 3. Los ratones del modelo de asma mostraron una mayor infiltración de células inflamatorias intersticiales, peribronquiolares y perivasculares en el pulmón en comparación con los ratones de control normales. Como control positivo, Dex alivió significativamente la infiltración de células inflamatorias pulmonares intersticiales, peribronquiolares y perivasculares en los ratones con asma. Los infiltrados inflamatorios en los pulmones de los ratones desafiados por OVA también fueron atenuados significativamente por SLPCD en comparación con el control modelo.
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
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(a)
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Para determinar los efectos del SLPCD en la infiltración de células inflamatorias en el pulmón de ratones asmáticos inducidos por OVA, se realizó el recuento de las células inflamatorias, incluidos los eosinófilos (Sigilec F+), los basófilos (CD117+), los neutrófilos (Ly-6C+y-6), los macrófagos (F4/), los monocitos (Ly6G-Ly6C+) y los mastocitos (FcER1+) en el BALF mediante citometría de flujo. Como se muestra en la Figura 4, el número de eosinófilos (1756 veces), macrófagos (114 veces), neutrófilos (110 veces), basófilos (91,7 veces), monocitos (45,8 veces) y mastocitos (6,9 veces) en el BALF de los ratones asmáticos fue notablemente elevado en comparación con los ratones de control normales. El Dex disminuyó significativamente el número de una variedad de células inflamatorias probadas en el BALF de los ratones asmáticos (), casi cerca de los niveles de los ratones normales. Los números de estas células inflamatorias en el BALF de los ratones asmáticos se redujeron significativamente de forma dependiente de la dosis por el SLPCD en comparación con el grupo de control del modelo (, , o ).
3.4. SLPCD disminuyó los niveles de IgE total en suero de los ratones asmáticos
Los efectos de SLPCD en los niveles de IgE total en suero de los ratones asmáticos se mostraron en la figura 5. Los niveles de anticuerpos IgE totales en suero de los ratones asmáticos fueron significativamente superiores a los de los ratones de control normales (). Como fármaco positivo, Dex disminuyó significativamente los niveles de anticuerpos IgE totales en suero en los ratones asmáticos inducidos por OVA (). Los niveles de anticuerpos IgE totales en el suero de los ratones asmáticos disminuyeron de forma significativa y dependiente de la dosis con el SLPCD en comparación con el grupo de control del modelo ().
3.5. El SLPCD moduló los niveles de citoquinas en el BALF de ratones asmáticos
Los niveles de citoquinas Th2 (IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13) y Th1 (IFN-γ e IL-2) en el BALF se midieron mediante ELISA. Como se muestra en la Figura 6, la provocación con OVA provocó un aumento significativo del nivel de IL-10 e IL-13 y una disminución del de IFN-γ en el BALF de los ratones asmáticos en comparación con el grupo de control normal ( o ). Sin embargo, el contenido de IL-4, IL-5 e IL-2 en el BALF de los ratones modelo de control resultó ser muy bajo y cercano al límite de detección. La administración de SLPCD en tres dosis y Dex disminuyó significativamente los niveles de IL-13 e IL-10, así como elevó notablemente el de IFN-γ en el BALF de los ratones asmáticos inducidos por OVA en comparación con los ratones modelo de control ( o ) (Figura 6).
3.6. El SLPCD reguló los niveles de expresión del ARNm de las citocinas en los tejidos pulmonares de los ratones asmáticos
Los efectos del SLPCD en la expresión del ARNm de las citocinas de tipo Th1 y Th2 en los tejidos pulmonares de los ratones asmáticos inducidos por OVA se detectaron mediante qRT-PCR, y los resultados se mostraron en la Tabla 3. En comparación con los ratones de control normales, los niveles de expresión de los ARNm de las citoquinas Th2 (IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13) se incrementaron notablemente y los de los ARNm de las citoquinas Th1 (IL-2 e IFN-γ) se redujeron significativamente en los tejidos pulmonares de los ratones asmáticos (P < 0,001). La administración de SLPCD en tres dosis y Dex dio lugar a una regulación a la baja significativa de los niveles de expresión de ARNm de las citocinas Th2 IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13 y a una regulación al alza de las citocinas Th1 IL-2 e IFN-γ en los tejidos pulmonares de los ratones asmáticos en comparación con los grupos del modelo asmático (P < 0,05, P < 0,01 o P < 0,001).
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Los tejidos pulmonares se recogieron 24 h después de la última administración y los niveles de expresión de ARNm de GAPDH y citoquinas se detectaron mediante qRT-PCR utilizando cebadores específicos. El gen de mantenimiento GAPDH se utilizó como control endógeno. Los valores se presentan como media ± DE (). Las diferencias significativas en comparación con el grupo de control del modelo asmático (MC) se designan como , , y . Dex: dexametasona (control positivo) y NC: grupo de control normal.
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4. Discusión
El asma se ha convertido en un problema de salud pública en todo el mundo, especialmente en los países desarrollados . Los glucocorticoides son la terapia de primera línea para el tratamiento y control del asma. Aunque estos fármacos podían mejorar los síntomas del asma, su uso persistente estaba estrictamente controlado debido a sus graves efectos secundarios . Por lo tanto, son necesarios nuevos enfoques terapéuticos para el asma. Muchas medicinas tradicionales chinas presentan diversas actividades biológicas, como efectos antibacterianos, antifúngicos, antiinflamatorios, antianafilácticos e inmunomoduladores, que tienen potencial para el tratamiento del asma. Se han descrito varios modelos de inflamación broncopulmonar alérgica en ratones de experimentación. El modelo de ratón de asma alérgica inducida por OVA reproduce muchas características del asma humana, que ha ganado una amplia aceptación . Por lo tanto, investigamos los efectos antiasmáticos del SLPCD y exploramos sus mecanismos moleculares utilizando este modelo.
El SLPCD está compuesto por 13 medicinas tradicionales chinas. Cortex Mori, Pheretima Aspergillum y Herba Ephedrae son los principales componentes que dispersan el pulmón y alivian el asma. El Semen Armeniacae Amarum, el Fructus Perillae cocido, el Semen Descurainiae y el Flos Farfarae frito con miel son componentes auxiliares que reducen la flema, alivian la tos y el asma. Los componentes coadyuvantes incluyen Rhizoma Belamcandae, Herba Houttyniae y Rhizoma Fagopyri Dibotrydis que despejan el mal de calor y expulsan los males superficiales, así como Scorpio y Radix Angelicae Sinensis que dispersan la estasis sanguínea, dragan los colaterales, espasmolizan y detienen el asma. El Radix et Rhizoma Glycyrrhizae armoniza todos los medicamentos. En conjunto, todos los componentes se complementan para lograr los resultados de dispersar el pulmón, descender el Qi y aliviar la tos y el asma. El control de calidad del SLPCD utilizado en este estudio se llevó a cabo mediante HPLC, y se identificaron dos sustancias químicas de referencia (ácido clorogénico y rutina) como principales componentes del índice (Figura 2).
El asma alérgica se define como una enfermedad inflamatoria aguda-crónica de las vías respiratorias con un reclutamiento eosinofílico característico, hiperplasia de células caliciformes, hipersecreción de moco, deposición de colágeno, hipertrofia de células musculares lisas y fibrosis subepitelial . En este estudio, se evaluaron los efectos del tratamiento con SLPCD sobre la inflamación pulmonar en ratones asmáticos desafiados por OVA mediante tinción con H&E. En los tejidos pulmonares de los ratones del modelo asmático se observó la típica acumulación alérgica y la infiltración de células inflamatorias. El tratamiento con SLPCD redujo los infiltrados inflamatorios en los tejidos pulmonares de los ratones asmáticos (Figura 3), lo que sugiere que el SLPCD alivió notablemente la inflamación de las vías respiratorias.
Las células inmunitarias inflamatorias desempeñan un papel clave en la patogénesis y la gravedad del asma . Las células inflamatorias reclutadas desde los ganglios linfáticos regionales hacia las vías respiratorias podrían segregar citocinas y quimiocinas, dando lugar a la hiperreactividad de las vías respiratorias . La reducción de las células inflamatorias en las vías respiratorias es una forma eficaz de tratar el asma. Para confirmar que el SLPCD puede inhibir la infiltración de células inflamatorias, contamos además eosinófilos, macrófagos, neutrófilos, basófilos, monocitos y mastocitos en el BALF. La inhalación de OVA condujo a aumentos significativos en los recuentos de estos seis tipos de células inflamatorias en el BALF (Figura 4). Los pliegues de aumento fueron 1756, 114, 110, 91,7, 45,8 y 6,9 pliegues para eosinófilos, macrófagos, neutrófilos, basófilos, monocitos y mastocitos, respectivamente, lo que indica un establecimiento satisfactorio de un modelo de asma exacerbada en este estudio. El tratamiento con SLPCD disminuyó de forma significativa y dependiente de la dosis el número de estas células inflamatorias, especialmente los eosinófilos, en el BALF en comparación con los ratones asmáticos (Figura 4). Estos resultados sugieren que el SLPCD redujo la infiltración de las células inflamatorias en el pulmón de los ratones asmáticos inducidos por OVA, siendo coherente con los resultados de la observación histopatológica.
Es bien sabido que la elevación de los niveles de anticuerpos IgE se correlacionó con la inflamación alérgica de las vías respiratorias y la hiperreactividad bronquial en los ratones modelo de asma. Coyle et al. informaron de que los anticuerpos anti-IgE atenuaban la inflamación eosinofílica de las vías respiratorias y la hiperreactividad bronquial en ratones asmáticos. La IgE inducida por alérgenos desencadenó que los eosinófilos, los basófilos y los mastocitos secretaran las citocinas IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13 . Por lo tanto, evaluamos los niveles de IgE total en suero y descubrimos que el SLPCD podía reducir significativamente los niveles de IgE total en suero en ratones asmáticos desafiados por OVA (Figura 5).
El desequilibrio de las células Th1/Th2 se considera la causa inmunológica del asma . En el asma, la actividad de las células Th1 se reduce, mientras que la actividad de las células Th2 se activa, lo que da lugar a un aumento de las citoquinas de tipo Th2 y a una disminución de las citoquinas Th1 . Las células Th2 migradas al pulmón secretan las citoquinas prototípicas de tipo Th2, IL-4, IL-5 e IL-13, lo que provoca hiperplasia de células caliciformes, broncoconstricción y eosinofilia en las vías respiratorias. In vitro, la IL-13 puede mediar la producción de IgE y puede desempeñar un papel clave en la patogénesis de las enfermedades alérgicas mediadas por IgE. La IL-13 también puede aumentar la supervivencia de los eosinófilos y contribuir a las actividades patológicas de estas células en el asma. Los ratones que sobreexpresan la IL-13 reproducen varias características del asma, como la eosinofilia pulmonar, la hiperplasia epitelial, la obstrucción de las vías respiratorias y la hiperrespuesta a los colinérgicos.
La supresión de la producción de citoquinas Th2 resultaría útil para la inmunoterapia con alérgenos . Por otra parte, las células activadas por Th1 pueden inhibir la inflamación de las vías respiratorias asmáticas . Las citoquinas Th1, como el IFN-γ, inhiben el reclutamiento de eosinófilos inducido por alérgenos y la liberación de IgE mediante la regulación a la baja de la expresión de GATA-3, IL-4 e IL-5 en los tejidos pulmonares del modelo de asma. En este estudio, estimamos el efecto del SLPCD sobre los niveles de citoquinas en el BALF de los ratones asmáticos. Los resultados mostraron que el SLPCD, en función de la dosis, no sólo redujo los niveles de IL-13 e IL-10, sino que también elevó el nivel de IFN-γ en el BALF de los ratones asmáticos (Figura 6). La acción inhibidora del tratamiento con SLPCD sobre la producción de citocinas Th2 fue coherente con su efecto sobre los niveles de IgE total en el suero.
Se informó de que la IL-5 desempeña un papel importante en la proliferación, la diferenciación, la maduración y la migración a sitios tisulares de los eosinófilos . Los niveles de expresión del ARNm de la IL-5 en biopsias bronquiales de asmáticos estaban regulados al alza en comparación con los controles no asmáticos. Los niveles de expresión del ARNm de la IL-5 se correlacionaron con la gravedad clínica del asma. La provocación alérgica acumulativa aumentó la expresión de ARNm de la IL-4 en las células del BALF y en las células T CD4+ y CD8+ periféricas. También se ha indicado que la IL-10 participa en el asma. La regulación al alza de los transcritos de IL-13 en las células del BAL de los pacientes con asma leve tras la provocación con dosis bajas de alérgenos es coherente con su mayor nivel de expresión de ARNm de IL-13 en la mucosa bronquial . Los efectos del tratamiento con SLPCD en el nivel de expresión del ARNm de las citocinas en los tejidos pulmonares de los ratones asmáticos se determinaron además mediante qRT-PCR. El tratamiento con SLPCD redujo significativamente los niveles de expresión del ARNm de las citoquinas Th2 (IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13) y aumentó los de las citoquinas Th1 (IL-2 e IFN-γ) en los pulmones de los ratones asmáticos. Estos resultados confirmaron además los efectos reguladores del tratamiento con SLPCD sobre las respuestas de las citoquinas Th1 y Th2 en los tejidos pulmonares de los ratones asmáticos.
En conclusión, el SLPCD podría inhibir significativamente la inflamación de las vías respiratorias, reducir las células inflamatorias en el BALF, disminuir los niveles totales de IgE en suero y modular el contenido de las citoquinas en el BALF y la expresión del ARNm de las citoquinas en el pulmón de los ratones asmáticos. Estos resultados sugieren que el SLPCD podría atenuar la inflamación de las vías respiratorias y aliviar la patogénesis en un modelo de ratón de asma a través de la inducción de una respuesta equilibrada Th1/Th2 y validar su uso clínico como un fármaco eficaz en el tratamiento del asma.
Divulgación
La dirección actual de Binnian Zhu es ACON Biotech (Hangzhou) Co, Hangzhou 310030, China.
Conflictos de intereses
Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.
Contribuciones de los autores
Binnian Zhu y Jun Dong contribuyeron a partes iguales a este trabajo de investigación.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por una subvención del Proyecto de Ciencia y Tecnología de Shaoxing (nº 2014B700722).