Efectos de las estatinas sobre la angiogénesis y la vasculogénesis | Revista Española de Cardiología

INTRODUCCIÓN

Las estatinas inhiben la actividad de la 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A (HMG-CoA) reductasa, una enzima que cataliza la síntesis de mevalonato, el paso limitante en la biosíntesis del colesterol.1 La reducción resultante del colesterol intracelular conduce a un aumento compensatorio de la captación de colesterol por los receptores de lipoproteínas de baja densidad (LDL) y a una disminución del colesterol plasmático. El descubrimiento de las estatinas y su aplicación en sujetos con concentraciones elevadas de colesterol ha permitido mejorar en gran medida la prevención primaria y secundaria de la enfermedad arterial coronaria.2,3 Recientemente, la eficacia de las estatinas en la prevención primaria y secundaria de la enfermedad arterial coronaria se ha observado también en sujetos con niveles más bajos de colesterol.4-6 Además de reducir el colesterol LDL (C-LDL), las estatinas tienen una serie de efectos pleiotrópicos sobre varios componentes de la aterosclerosis, como la función endotelial, la migración celular, la inflamación y la tendencia trombótica de la placa.7-12 En animales normocolesterolémicos se ha demostrado que las estatinas tienen un efecto protector frente a las lesiones por isquemia-reperfusión del músculo cardíaco, probablemente a través de mecanismos relacionados con la producción de óxido nítrico (NO) por parte del endotelio.13

La proteína quinasa de serina/treonina Akt o proteína quinasa B (PKB) es un regulador intracelular multifuncional de la supervivencia, el crecimiento y el metabolismo celular 14 (Figura 1). En relación con sus funciones cardiovasculares, Akt/PKB actúa en la vía intracelular estimulada por el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)14,15 y la angiopoyetina,16-18 promoviendo la supervivencia celular y asegurando un adecuado desarrollo vascular.19 La activación constitutiva de la señalización de Akt protege a los cardiomiocitos contra la apoptosis en las lesiones por isquemia-reperfusión.20 Además de su efecto citoprotector, Akt actúa como activador de la producción de NO por parte del endotelio en respuesta al VEGF y al estrés de cizallamiento a través de su capacidad para fosforilar la óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) en las serinas 1179 o 1177,21,22 controlando así el tono vasomotor.23 Por otra parte, Akt es esencial en la migración de las células endoteliales al foco productor de VEGF.24 Por lo tanto, la capacidad de Akt para mediar en la supervivencia celular, la producción de NO y la migración inducida por VEGF sugiere que la proteína quinasa Akt puede mediar en la respuesta endotelial a los estímulos angiogénicos.

Fig. 1. Estatinas, señalización Akt y angiogénesis/vasculogénesis. La angiopoyetina 1 (Ang-1), el VEGF y el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), cuando se unen a sus receptores de membrana, inducen la conversión del fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2) en fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato (PIP3) por la fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K). La formación de PIP3 es necesaria para la fosforilación de la proteína quinasa Akt por la quinasa PDK-1. El tratamiento con estatinas aumenta la fosforilación de Akt, mientras que la wortmanina (un inhibidor de PI3K) la impide. El mevalonato, producto de la HMG-CoA reductasa, también inhibe la PI3K y la consiguiente fosforilación de Akt. Por lo tanto, las estatinas, al inhibir la HMG-CoA reductasa y la producción de mevalonato, aumentan la fosforilación de Akt y, al mismo tiempo, la fosforilación y activación de la óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS), la síntesis de óxido nítrico (NO) y una serie de efectos fisiológicos inducidos en la angiogénesis y la vasculogénesis. La Akt también previene la apoptosis de las células endoteliales.

Recientemente se ha demostrado que las estatinas también estimulan la vía de señalización intracelular de la proteína quinasa Akt/PKB25-27 en las células endoteliales25 y en las células progenitoras endoteliales (EPC) de la médula ósea,26,27 induciendo así tanto la angiogénesis25 como la vasculogénesis.26 Los efectos de las estatinas en la cinética de las EPC también han sido demostrados en humanos por Vasa et al.28 Este artículo revisa el efecto de las estatinas en la inducción de la angiogénesis25 y la vasculogénesis26 a través de mecanismos relacionados con la activación de Akt.25-27

ANGIOGÉNESIS Y VASCULOGÉNESIS

La angiogénesis y la vasculogénesis son responsables del desarrollo del sistema vascular en el embrión.29-32 La vasculogénesis es el proceso de formación de vasos sanguíneos a partir de células progenitoras endoteliales (angioblastos) que migran y se fusionan con otras células progenitoras endoteliales y se diferencian en células endoteliales mientras forman nuevos vasos sanguíneos. Por el contrario, la angiogénesis es el proceso de extensión de los vasos sanguíneos que se han formado mediante el brote de nuevos capilares a través de la migración y proliferación de células endoteliales previamente diferenciadas (Figura 2).

Fig. 2. Representación esquemática de la angiogénesis y la vasculogénesis. (A) La vasculogénesis es la agregación de angioblastos o células progenitoras endoteliales para formar vasos sanguíneos. Los angioblastos se unen in situ o migran para formar vasos sanguíneos en lugares distantes. (B) La angiogénesis es la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos preexistentes mediante la proliferación y migración de células endoteliales diferenciadas. (C) La angiogénesis y la vasculogénesis también pueden producirse simultáneamente. (Tomado de Cleaver et al.29)

Inicialmente se pensaba que el proceso vasculogénico estaba restringido al desarrollo embrionario, mientras que la angiogénesis (que también se produce en el embrión) era el único proceso implicado en la neovascularización en los adultos. Sin embargo, recientemente se ha revisado el paradigma de la neovascularización postnatal y se ha descubierto que las células progenitoras endoteliales que circulan en la sangre periférica,33 se incorporan a los focos de neovascularización en animales adultos,34 aumentan en número en respuesta a la isquemia tisular,35 y promueven el desarrollo de vasos sanguíneos colaterales tras su expansión in vitro y posterior trasplante.36 Estos estudios han establecido que tanto la angiogénesis como la vasculogénesis son responsables de la neovascularización en adultos.

Un tercer mecanismo que probablemente contribuye al desarrollo de vasos colaterales es el aumento del tamaño y el calibre de las conexiones colaterales arteriolares preexistentes, un proceso denominado arteriogénesis.37 La presencia y el número de estos vasos colaterales nativos varían ampliamente entre individuos y especies. Cuando un vaso se ocluye, se produce un aumento de la velocidad del flujo sanguíneo a través de los vasos colaterales preexistentes y un aumento de la tensión de cizallamiento luminal, factores que contribuyen a la maduración de los vasos colaterales, sobre todo de los de tamaño intermedio.

Métodos de estudio in vitro

El desarrollo de técnicas de cultivo de células endoteliales ha permitido conocer los procesos implicados en la angiogénesis.38 Las células endoteliales en cultivo conservan la capacidad de responder a factores que estimulan o inhiben la angiogénesis, así como la capacidad de formar tubos endoteliales in vitro. Los ensayos de proliferación celular permiten analizar el efecto de una determinada sustancia sobre la proliferación de las células endoteliales. La migración de las células endoteliales hacia una solución que contiene una determinada sustancia, separada por una membrana permeable, puede examinarse en una cámara Boyden. Los mecanismos de formación del endotelio tubular y el efecto de una determinada sustancia sobre los túbulos pueden estudiarse mediante ensayos bidimensionales o tridimensionales. Con estas técnicas se analizan los procesos de formación del lumen endotelial y la influencia de la matriz extracelular en el desarrollo capilar.38 Por último, los cultivos de células endoteliales permiten estudiar las vías moleculares implicadas en los procesos de angiogénesis.

Recientemente, mediante el uso de técnicas de selección celular y medios de cultivo especiales, las técnicas desarrolladas para estudiar las células endoteliales diferenciadas se han utilizado para estudiar las células progenitoras endoteliales.33-36

Métodos de estudio in vivo

Aunque las técnicas in vitro permiten realizar un análisis preliminar de la angiogénesis y la vasculogénesis, son muchos los factores que pueden influir o modular estos procesos in vivo.38 Para estudiar los mecanismos de formación de vasos sanguíneos in vivo, se han desarrollado diferentes sistemas biológicos para cuantificar o demostrar el efecto de una determinada sustancia: modelos de córnea de ratón, membrana corioalantoidea de embrión de pollo o implantes esponjosos.38 Estos sistemas requieren el sacrificio del animal, por lo que sólo captan el efecto en un momento concreto. Para estudiar la evolución temporal de los acontecimientos en un solo tejido, se han desarrollado técnicas de microscopía intravital para la piel del lomo o el cráneo del ratón.39 Por último, el desarrollo de las técnicas de ingeniería genética ha permitido estudiar el efecto de la supresión (knock-out) o la adición (knock-in) de un gen en los procesos de vasculogénesis y angiogénesis.

El estudio de la vasculogénesis postnatal y del efecto de ciertas sustancias en los procesos de vasculogénesis ha sido posible gracias al uso de técnicas de citometría de flujo, de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), de técnicas especiales de cultivo de células progenitoras endoteliales (EPC) a partir de sangre periférica y de modelos de trasplante de médula ósea murina.33-36 La FACS se utiliza para detectar y cuantificar las EPC en sangre periférica utilizando anticuerpos contra los antígenos de superficie de estas células. La influencia de los fármacos o de los factores de crecimiento sobre el número de estas células en la sangre periférica puede analizarse de este modo. Las técnicas especiales de selección y cultivo de células desarrolladas por nuestro grupo también han permitido detectar y cuantificar las EPC. En el modelo murino de trasplante de médula ósea, se trasplantan células de médula ósea de un ratón donante a un ratón receptor con un gen que codifica la elaboración de una sustancia que permite detectarla posteriormente (Figura 3). En nuestro caso el gen codificaba la elaboración de beta-galactosidasa por parte de las células endoteliales. La expresión selectiva se consigue porque este gen está regulado por un promotor específico de las células endoteliales, Tie-2, en el ratón donante. Por lo tanto, sólo las células endoteliales de la médula ósea del animal donante expresarán la beta-galactosidasa que puede detectarse en el animal receptor. Si los experimentos biológicos descritos anteriormente se realizan después del trasplante de médula ósea en el receptor animal, podemos analizar la influencia de una determinada sustancia en la vasculogénesis cuantificando el número de células progenitoras endoteliales derivadas de la médula ósea.

Fig. 3. Modelo murino de trasplante de médula ósea para el estudio de la vasculogénesis. Los donantes de médula ósea utilizados son ratones transgénicos que expresan constitutivamente el gen LacZ (que codifica la beta-galactosidasa) regulado por un promotor endotelial específico, Tie-2. La médula ósea se extrae y se trasplanta a un ratón receptor cuya médula ósea ha sido irradiada subletalmente. Tras un periodo de 4 semanas para lograr la reconstitución de la médula ósea trasplantada, se realizan una o varias intervenciones en el ratón receptor (el caso mostrado es un modelo de córnea) para estimular la neovascularización. Tras estas intervenciones, se sacrifican los animales y se realiza un estudio histológico para detectar la expresión de beta-galactosidasa. Con la tinción X-GAL, las células que expresan beta-galactosidasa adquieren un color azulado. El uso de un promotor específico para las células endoteliales permite identificar las células azules que se han incorporado a los focos de neovascularización como células de linaje endotelial.

EFECTO DE LAS ESTATINAS EN LA INDUCCIÓN DE LA ANGIOGÉNESIS Y LA VASCULOGÉNESIS

Investigaciones realizadas en nuestro laboratorio y en otros han demostrado que las estatinas estimulan la vía de señalización intracelular de la proteína quinasa Akt/PKB,25-27 que promueve tanto la angiogénesis25 como la vasculogénesis.26 Además, Vasa et al también han podido demostrar en humanos los efectos de las estatinas en la cinética de las EPC.28

Efectos in vitro de las estatinas

Las estatinas activan rápidamente la proteína quinasa Akt/PKB en las células endoteliales25 y en las EPC,26,27 aumentando así la fosforilación de la eNOS y la consiguiente producción de NO. La activación de Akt por las estatinas promueve la proliferación, la migración y la supervivencia celular de las células endoteliales y las EPC, así como la formación de la estructura vascular. Además, la inhibición de Akt mediante el uso de adenovirus que codifican formas dominantes negativas de Akt provoca la inhibición de los efectos inducidos por las estatinas. El potencial de las estatinas en los procesos de regeneración tisular se demostró anteriormente en los osteoblastos. En estas células, las estatinas aumentaron la proliferación y el nivel de actividad, incrementando en consecuencia la formación de hueso.40

Aunque los mecanismos de activación de Akt por las estatinas no se conocen con exactitud, es probable que la señalización de la fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K) esté implicada, ya que este proceso es bloqueado por la wortmanina y el LY294002, dos inhibidores de la enzima (Figura 1). Además, es necesaria la inhibición de la HMG-CoA reductasa, ya que la activación de Akt por simvastatina fue inhibida por la adición de mevalonato a la incubación (Figura 1). El mevalonato es necesario, no sólo para la biosíntesis del colesterol, sino también en la producción de ubiquinona, dolicoles e isoprenoides, que son esenciales en varios procesos celulares. Aunque las estatinas estabilizan el ARN mensajero (ARNm) de la eNOS al modificar la síntesis de isoprenoides,41 no observamos cambios en los valores de la proteína sintasa eNOS. En este sentido, es importante destacar que el aumento de la concentración de ARNm fue más tardío (24 h) que la activación de la fosforilación de la eNOS por Akt (15 min). Este menor tiempo de activación es coherente con los cambios inducidos por las estatinas en la producción de NO y en la vasodilatación observada en los anillos aórticos ex vivo.42

Efectos in vivo de las estatinas

Las estatinas y la activación de la señalización intracelular de Akt promueven la angiogénesis en modelos de isquemia periférica desarrollados en conejos normocolesterolémicos.25 En los animales que recibieron estatinas se observaron mayores presiones de perfusión, un mayor número de vasos colaterales y una mayor densidad capilar (figura 4). Por otra parte, las estatinas aumentan el número de células progenitoras endoteliales en sangre periférica tanto en ratones26,27 como en humanos.28 Además, las estatinas aumentan la neovascularización corneal en ratones normocolesterolémicos, en parte debido a la vasculogénesis a partir de las EPC obtenidas de la médula ósea (Figuras 3 y 5).26 Utilizando el modelo murino de trasplante de médula ósea, se pudo demostrar un mayor número de EPC procedentes de la médula ósea en las córneas de los ratones tratados con estatinas. Por lo tanto, las estatinas tienen un efecto importante en la cinética de las EPC, como se había demostrado anteriormente con el VEGF o el factor estimulante de colonias de granulocitos y monocitos (GM-CSF),35 y la movilización de estas células inducida por las estatinas podría aumentar la neovascularización postnatal.

Figura 4. Aumento de la neovascularización inducido por estatinas en la pata de un conejo en respuesta a la resección unilateral de la arteria femoral. a) Se disecan la arteria femoral y sus ramas. La transferencia genética al endotelio se realiza mediante la infusión de adenovirus que codifican la beta-galactosidasa (Ad-βgal) o Akt (Ad-myrAkt) en la arteria femoral distal y la incubación durante 15 min mientras se pinza temporalmente la vena femoral. b) Al tercer día se extrae el músculo gastrocnemio y se realiza la tinción X-GAL para determinar la distribución transgénica en preparaciones histológicas teñidas con hematoxilina-eosina. c) Se realiza una angiografía a través de la ilíaca interna para analizar la formación de vasos colaterales en los diferentes grupos de tratamiento. En las angiografías realizadas a los 40 días, se aprecia un aumento en la formación de vasos colaterales en los animales que recibieron 0,1 mg/kg de simvastatina por inyección intraperitoneal en comparación con los animales intervenidos a los que sólo se les inyectó solución salina. Se realizó un análisis cuantitativo de los vasos colaterales en el grupo de control, en el grupo tratado con simvastatina y en el grupo de animales que recibió una inyección intramuscular de Ad-VEGF. La puntuación angiográfica se analizó en los grupos experimentales que recibieron una infusión de solución salina, Ad-βgal y Ad-myrAkt 31 días después de la cirugía. d) La tinción para fosfatasa alcalina en el músculo aductor de la pierna isquémica reveló una mayor densidad capilar en el grupo de animales tratados con simvastatina con respecto al grupo control 40 días después de la cirugía. Los datos de cada experimento se presentan como media±SD (n=6 conejos en cada uno de los grupos de tratamiento, *P25)