El complejo adaptador AP-3 media la clasificación de los transportadores de aminoácidos básicos de la familia PQ de levadura y mamíferos hacia la membrana vacuolar/lisosomal.a la membrana vacuolar/lisosomal

La proteína Ypq1 puede llegar a la membrana vacuolar a través de la vía ALP o endosomal

Al haber informado recientemente de que una proteína de fusión Ypq1-GFP se localiza en la membrana vacuolar6, intentamos determinar por qué vía de tráfico llega Ypq1 a este compartimento. Las proteínas de la membrana vacuolar pueden llegar a la vacuola a través de dos vías diferentes: la vía de la ALP (fosfatasa alcalina) y la vía de la CPY (carboxipeptidasa Y), esta última implica el paso de las proteínas a través de los endosomas (Fig. 2A). Para comprobar si Ypq1 sigue la vía CPY, examinamos su distribución intracelular en un mutante pep12Δ que carece de un t-SNARE implicado en la fusión de vesículas con el endosoma tardío13. En este mutante, Ypq1-GFP se encontró exclusivamente en la membrana vacuolar (Fig. 2B). En un mutante vps27Δ que carece de un componente del complejo endosomal ESCRT-0, las proteínas de membrana que trafican a través de los endosomas suelen apilarse en compartimentos de clase E claramente visibles que corresponden a endosomas anormalmente agrandados, pero la proteína Ypq1-GFP se dirigió normalmente a la membrana vacuolar en este mutante (datos no mostrados). Estos resultados muestran que Ypq1 no requiere una vía CPY funcional para alcanzar la vacuola. A continuación, comprobamos si Ypq1 alcanza la membrana vacuolar a través de la vía ALP. Está bien documentado que esta vía requiere el complejo adaptador AP-3, que se supone que actúa en el Golgi trans para clasificar las proteínas de carga en vesículas que posteriormente se fusionan con los endosomas. Este complejo es un heterotetrámero que consta de dos subunidades grandes (β3a y δ), una subunidad mediana (μ3a) y una subunidad pequeña (σ3) y la ausencia de cualquiera de estas subunidades da lugar a un complejo AP-3 deficiente14. Por lo tanto, aislamos dos cepas deficientes en AP-3, apm3Δ (que carece de la subunidad μ3a) y apl5Δ (que carece de la subunidad δ). En estos mutantes, Ypq1-GFP se encontró en la membrana vacuolar, así como en pequeñas estructuras punteadas fácilmente marcadas con FM4-64 y no observadas en las células de tipo salvaje (Fig. 2B). En las células mutantes amp3Δ y apl5Δ que también expresaban un Sec7-mCherry funcional para etiquetar el Golgi, un alto porcentaje de estas estructuras punteadas estaban decoradas con Sec7-mCherry (Fig. 2C) (para una cuantificación de los patrones de sublocalización, véase la Fig. Suplementaria S1 en línea). Estos resultados indican que cuando la vía ALP es deficiente, Ypq1 tiende a acumularse en el Golgi mientras que una fracción significativa de la proteína alcanza la membrana vacuolar a través de otra vía. Para comprobar si esta última es la vía CPY, determinamos la localización de Ypq1-GFP en los mutantes dobles apm3Δ pep12Δ y apl5Δ pep12Δ (Fig. 2B). Curiosamente, la entrega de Ypq1-GFP a la vacuola se vio afectada en gran medida en estas cepas y la proteína se encontró mayormente dispersa en el citosol, así como en estructuras punteadas etiquetadas con el Sec7-mCherry (Fig. 2B,C) (para una cuantificación de los patrones de sublocalización, véase la Fig. Suplementaria S1 en línea). La vacuola en estos dobles mutantes pudo ser etiquetada normalmente con FM4-64. Estos resultados muestran que Ypq1 puede ser clasificado en la membrana vacuolar a través de las vías ALP y CPY. En las células de tipo salvaje, utiliza principalmente la vía ALP, pero cuando esta vía es deficiente, la proteína reside más tiempo en el Golgi, pero aún puede alcanzar eficazmente la membrana vacuolar a través de la vía CPY. Cuando tanto la vía ALP como la vía CPY son deficientes, una pequeña fracción de Ypq1-GFP es detectable en la membrana vacuolar, lo que sugiere que la proteína puede utilizar otra vía, pero una mucho menos eficiente para dirigir adecuadamente Ypq1 a la vacuola.

Un motivo ácido de dileucina promueve la clasificación de Ypq1 hacia la vía de la ALP

La clasificación de proteínas transmembrana dependiente de la AP-3 suele estar mediada por señales basadas en la tirosina (YXXØ) o en la dileucina (XXXL) (donde Ø es un residuo hidrofóbico voluminoso y X cualquier aminoácido)15. Ypq1 contiene una secuencia EQQPLL en su segundo gran bucle orientado al citosol. La dileucina de este motivo está precedida por una prolina, una característica observada en varias cargas que utilizan la vía ALP16. Se observó que un mutante de sustitución de dileucina por dialanina de Ypq1 (Ypq1LL>AA) se dirigía a la membrana vacuolar, pero también decoraba estructuras puntuales (Fig. 3A). Este fenotipo se asemeja al observado para Ypq1 de tipo salvaje en células deficientes en AP-3, lo que sugiere que Ypq1LL>AA llega a la vacuola a través de la vía alternativa CPY. En apoyo de este punto de vista, la Ypq1LL>AA producida en un mutante pep12Δ no se dirigió a la vacuola y se perdió en estructuras puntuales citosólicas como se observó para Ypq1 en los mutantes apm3Δ pep12Δ y apl5Δ pep12Δ (Fig. 3A). Estos resultados muestran que el motivo ácido de dileucina de Ypq1 es necesario para su clasificación dependiente de AP-3 hacia la vacuola, pero no para su entrega dependiente de Pep12 a la vacuola. Estas conclusiones son coherentes con los resultados de un estudio reciente publicado por S. Emr y sus colaboradores durante la preparación de este manuscrito17. A continuación, investigamos con más detalle cómo la variante Ypq1LL>AA llega a la vacuola. En primer lugar, contemplamos la posibilidad de que esta proteína mutante, debido a su incapacidad para utilizar la vía de la ALP, se perdiera primero en la membrana plasmática antes de someterse a una rápida endocitosis y posterior entrega dependiente de Pep12 a la membrana vacuolar. Este modelo no fue apoyado por nuestras observaciones: el Ypq1LL>AA no se acumuló en la superficie celular en un mutante end3Δ defectuoso en endocitosis, lo que indica que llega a la vacuola a través de la vía CPY (Fig. 3B). A continuación, planteamos la hipótesis de que la entrega de Ypq1LL>AA a la vacuola podría implicar su clasificación desde el Golgi a los endosomas gracias a adaptadores alternativos como el complejo AP-1 o las proteínas monoméricas GGA. Expresamos la proteína mutante Ypq1LL>AA en células gga1Δ gga2Δ, que carecen de los adaptadores redundantes Gga1 y Gga2, y en células amp1Δ, amp2Δ y apl4Δ, que carecen de subunidades del complejo AP-1. En cada uno de estos mutantes, se encontró que la proteína seguía llegando a la vacuola (Fig. 3B). Estas observaciones sugieren que estos adaptadores actúan de forma redundante para promover la clasificación de Ypq1LL>AA a la vacuola a través de la vía CPY o que hay otros adaptadores implicados.

Ypq2 e Ypq3 también trafican a la vacuola a través de la vía de la ALP, pero sufren destinos diferentes cuando la vía de la ALP no es funcional

Las proteínas Ypq2 e Ypq3, muy similares en secuencia a Ypq1, también se localizan en la membrana vacuolar6 y ambas también contienen una dileucina ácida en el segundo bucle citosólico. Los resultados de la Fig. 4A muestran que Ypq2 trafica normalmente a la vacuola en un mutante pep12Δ. Esto también es cierto en los mutantes apm3Δ y apl5Δ defectuosos en la vía de la ALP, en los que además se encontró que decoraba estructuras punteadas, un fenotipo no observado en las células de tipo salvaje. Una alta proporción de estas estructuras punteadas también estaban marcadas con Sec7-mCherry (Fig. 4B), lo que indica que Ypq2, al igual que Ypq1, tiende a acumularse en el Golgi cuando la vía ALP es deficiente. Tanto en los mutantes dobles apm3Δ pep12Δ como en los apl5Δ pep12Δ, Ypq2 se deslocalizó en gran medida en pequeñas estructuras citosólicas punteadas, muchas de las cuales estaban decoradas con Sec7-mCherry, aunque una fracción de la proteína parecía haber llegado correctamente a la vacuola (Fig. 4A,B) (para una cuantificación de los patrones de sublocalización, véase la Fig. S2 suplementaria en línea). Estos resultados indican que Ypq2 se comporta como Ypq1 en el sentido de que utiliza principalmente la vía ALP para alcanzar la vacuola. También muestran que cuando esta vía es defectuosa, Ypq2 reside durante más tiempo en el Golgi pero aún puede llegar a la membrana vacuolar, principalmente a través de la vía CPY.

Como la expresión de un gen YPQ3-GFP bajo el control del promotor natural de YPQ3 producía un nivel apenas detectable de Ypq3-GFP, expresamos el gen de fusión bajo el control de un promotor inducible por galactosa. Para reducir el riesgo de deslocalización debido a la sobreproducción de Ypq3-GFP, las células se cultivaron primero en rafinosa, luego se añadió galactosa durante 3 horas y, finalmente, se proporcionó glucosa durante dos horas para reprimir la transcripción del gen YPQ3-GFP. Esta Ypq3-GFP inducida transitoriamente, que se acumuló en la célula a un nivel cercano al nivel endógeno de Ypq1-GFP (véase la Fig. Suplementaria S3, en línea), se localizó en la membrana vacuolar (Fig. 5A), de acuerdo con nuestros resultados anteriores6. Esta localización vacuolar también se observó en el mutante pep12Δ. Sin embargo, en los mutantes apm3Δ y apl5Δ, Ypq3 se desvió principalmente hacia el lumen de la vacuola. Esta desviación dependía de Pep12, ya que Ypq3 no se dirigía a la vacuola en los mutantes dobles apm3Δ pep12Δ y apl5Δ pep12Δ (Fig. 5A) (para una cuantificación de los patrones de sublocalización, véase la Fig. S4 suplementaria en línea). Estos resultados sugieren que, al igual que Ypq1 e Ypq2, Ypq3 utiliza principalmente la vía ALP para alcanzar la membrana vacuolar. Cuando faltan componentes del complejo AP-3, Ypq3 es redirigido de forma dependiente de Pep12 a los endosomas, donde es clasificado en la vía de los cuerpos multivesiculares (MVB), lo que resulta en su entrega al lumen vacuolar. Esta interpretación se evaluó además aislando un mutante Ypq3LL>AA que no debería ser reconocido por el complejo adaptador AP-3. En las células de tipo salvaje, la variante Ypq3LL>AA se desvió claramente hacia el lumen vacuolar, pero en un mutante pep12Δ se redirigió a pequeñas estructuras puntuales citosólicas (Fig. 5B).

Consideramos que el diferente comportamiento de Ypq3 en comparación con Ypq1 e Ypq2 en las cepas deficientes en AP-3 podría deberse a que Ypq3-GFP se sintetizó en células que crecían en presencia de galactosa, o a que la transcripción del gen YPQ3-GFP se indujo utilizando el fuerte promotor GAL. Esto, sin embargo, parece poco probable porque las proteínas Ypq1-GFP e Ypq2-GFP inducidas transitoriamente en las cepas de tipo salvaje y mutante utilizando el mismo promotor GAL se localizaron en las células como cuando se expresaron bajo sus propios promotores génicos (véase la Fig. Suplementaria S5 en línea). Además, aunque la señal fluorescente era apenas detectable, obtuvimos pruebas de que la Ypq3-GFP expresada utilizando el promotor del gen natural YPQ3 marcaba la membrana de las vacuolas en la cepa de tipo salvaje, pero no en el mutante apl5Δ, un fenotipo claramente diferente de los obtenidos con la Ypq1-GFP y la Ypq2-GFP. En este mutante, la Ypq3-GFP estaba presente en estructuras punteadas que probablemente correspondían al Golgi, y su desviación hacia el lumen vacuolar no era claramente visible, probablemente porque la fluorescencia era demasiado débil (véase la Fig. Suplementaria S6 en línea).

En conclusión, como se ha mostrado anteriormente para Ypq1, las proteínas Ypq2 e Ypq3 utilizan principalmente la vía ALP para alcanzar la membrana vacuolar y se desvían hacia los endosomas cuando esta vía es defectuosa. Sin embargo, mientras que Ypq1 e Ypq2, al transitar por los endosomas, alcanzan la membrana vacuolar de forma eficiente, Ypq3 es más propensa a ser clasificada en la vía MVB, lo que lleva a que se dirija al lumen vacuolar.

PQLC2 producida en levadura utiliza la vía ALP y su motivo de dileucina para alcanzar la membrana vacuolar

En un estudio anterior, se descubrió que PQLC2 de rata se localizaba en los lisosomas de las células HeLa, pero su mutante PQLC2LL>AA, en el que la dileucina C-terminal se sustituye por una dialanina, mostraba una distribución más difusa a través de la célula y se desviaba parcialmente hacia la membrana plasmática6. Además, se encontró que la PQLC2 producida en la levadura se localiza en la membrana vacuolar, donde es funcional, ya que se encontró que complementa el fenotipo de crecimiento de un mutante ypq2Δ6. Los resultados de la Fig. 6A muestran que PQLC2 se dirigió correctamente a la vacuola de la levadura en un mutante pep12Δ, pero se desvió al lumen vacuolar en los mutantes apm3Δ y apl5Δ. Esta orientación al lumen vacuolar se vio afectada en los mutantes dobles apm3Δ pep12Δ y apl5Δ pep12Δ, en los que PQLC2 se distribuyó de forma difusa por el citosol (para una cuantificación de los patrones de sublocalización, véase la Fig. Suplementaria S7 en línea). También expresamos en cepas de levadura de tipo salvaje y mutante el mutante PQLC2LL>AA. En la levadura de tipo salvaje, PQLC2LL>AA se localizó en el lumen vacuolar, pero se encontró distribuido por todo el citosol en el mutante pep12Δ (Fig. 6B). La clasificación de las cargas en la vía de los cuerpos multivesiculares se ve afectada en un mutante vps27Δ que carece de un componente clave del complejo ESCRT-018. En el mutante vps27Δ, PQLC2LL>AA se apiló en un gran compartimento perivacuolar: el compartimento de clase E típicamente observado en esta categoría de mutantes (Fig. 6B). Estos resultados muestran que la PQLC2 producida en la levadura se comporta como la Ypq3 endógena: se clasifica hacia la vacuola a través de la vía ALP de una manera que depende del reconocimiento adecuado de su motivo de dileucina por el complejo adaptador AP-3. Cuando este reconocimiento se ve afectado porque el motivo de la dileucina está mutado o porque falta un componente del complejo AP-3, PQLC2 se desvía hacia los endosomas, donde se clasifica eficientemente en la vía MVB, alcanzando finalmente el lumen vacuolar.

El agotamiento de una subunidad AP-3 impide la entrega de PQLC2 a los lisosomas

PQLC2-GFP producida en células HeLa se coloca en gran medida con el marcador lisosomal LAMP1. La localización de PQLC2 en la membrana lisosomal se vio respaldada por el análisis de espectrometría de masas semicuantitativa de proteínas en preparaciones altamente enriquecidas en membranas lisosomales de células de hígado de rata6. Para determinar si el adaptador AP-3 contribuye a la clasificación de PQLC2 en los lisosomas, utilizamos un pequeño ARN de interferencia (siRNA) para inhibir la síntesis de la subunidad μ3A de AP-3 en células HeLa. El análisis de inmunoblot confirmó que las dos bandas típicas correspondientes a las subunidades μ3A19 eran apenas detectables en las células tratadas con μ3A-ARNsi, en contraste con las células de control (Fig. 7A). Esta depleción de μ3A perturbó fuertemente la localización de PQLC2-GFP (Fig. 7B): la proteína se localizó en gran medida en numerosas estructuras puntuales intracelulares no marcadas por el colorante Lyso Tracker que se acumulan en los lisosomas y también se encontró en la superficie de la célula, incluyendo las microvellosidades, lo que indica que parte de la proteína también se desvió a la membrana plasmática. Esto contrasta con la localización de PQLC2 en las células tratadas con un simulacro, donde la proteína estaba presente en estructuras punteadas también fuertemente marcadas por el colorante Lyso Tracker, como se esperaba. Estos resultados sugieren que el complejo AP-3 contribuye a la correcta localización de PQLC2 en los lisosomas. También investigamos la localización del mutante PQLC2LL>AA (Fig. 7C). En las células HeLa de control, PQLC2LL>AA se encontró distribuida en estructuras punteadas intracelulares no marcadas o muy poco marcadas por el colorante Lyso Tracker y también estaba claramente presente en la superficie celular, de acuerdo con observaciones anteriores6. Esta localización no estaba significativamente perturbada en las células tratadas con μ3A-siRNA, apoyando la opinión de que el papel del motivo dileucina de PQLC2 es mediar el tráfico intracelular a través del complejo AP-3. A continuación examinamos si PQLC2LL>AA se desvía hacia el lumen de los compartimentos endosómicos/lisosómicos, como cuando se produce en la levadura. Las células HeLa que expresan PQLC2-GFP fueron tratadas durante dos horas con vacuolina-1, un compuesto que induce la fusión homotípica de los compartimentos del sistema endosomal/lisosomal, dando lugar a la formación de grandes estructuras hinchadas (Fig. 8). PQLC2-EGFP se localizó, como era de esperar, en la membrana limitante de estos compartimentos endosómicos/lisosómicos agrandados. Lo mismo ocurrió en las células que produjeron PQLC2LL>AA, lo que sugiere que la proteína mutante no se clasifica eficazmente en la vía MVB. En conclusión, el complejo adaptador AP-3 parece desempeñar un papel importante en la orientación de PQLC2 hacia el lisosoma, probablemente a través del reconocimiento de su dileucina C-terminal. Cuando este reconocimiento está deteriorado, la proteína se desvía a la superficie celular y a la membrana limitante de los compartimentos internos.