El translocador nuclear del receptor de hidrocarburos de arilo (ARNT/HIF-1β) está influenciado por la hipoxia y los hipoxia-miméticos

Abstract

Antecedentes: El Translocador Nuclear del Receptor de Hidrocarburos de Arilo (ARNT, HIF-1β) es un miembro de la familia de proteínas Basic-Helix-Loop-Helix PER/ARNT/SIM (bHLH/PAS) y un regulador transcripcional vital en relación con los procesos de desarrollo y adaptación fisiológica. Se discute la relación de ARNT con el cáncer y otras enfermedades. Se sabe que el ARNT se transloca al núcleo de la célula, donde tiene lugar la acumulación de la proteína. El ARNT es un socio de heterodimerización del receptor de hidrocarburos de arilo (AhR) activado por un ligando xenobiótico, las proteínas de mente única (SIM), el factor cardiovascular de hélice-bucle-hélice 1 y las proteínas del factor inducible por hipoxia (HIF-α). La ARNT es obligatoria para la unión de HIF-1, HIF-2 y HIF-3 al ADN. Mientras que la degradación de las subunidades HIF-α es suprimida por la hipoxia, el ARNT se considera generalmente como expresado constitutivamente en exceso dentro de la célula, y se piensa comúnmente que su estabilización es independiente del oxígeno. Sin embargo, aportamos pruebas de que la regulación de ARNT es mucho más compleja. El objetivo de nuestro estudio fue reevaluar la regulación de la expresión de ARNT. Métodos: Examinamos líneas celulares de diferente origen como MCF-7 y T47D (cáncer de mama humano), HeLa (carcinoma de cuello uterino humano), Hep3B y HepG2 (hepatoma humano), Kelly (neuroblastoma humano), REPC (riñón humano) y Cos7 (riñón primario de primates). Se utilizaron análisis de inmunoblot, densitometría, RT-PCR y transfección transitoria. Resultados y conclusiones: Nuestros resultados muestran que los niveles de proteína ARNT están influenciados por la hipoxia y los miméticos de la hipoxia como el cloruro de cobalto (II) (CoCl2) y la dimetiloxalilglicina (DMOG) de manera específica para cada línea celular. Demostramos que este efecto podría ser desencadenado por HIF-1α, que desempeña un papel importante en el proceso de estabilización de ARNT en hipoxia.

© 2013 S. Karger AG, Basel

Introducción

El Translocador Nuclear del Receptor de Hidrocarburos de Arilo (ARNT) es un miembro de la familia de proteínas Basic-Helix-Loop-Helix PER/ARNT/SIM (bHLH/PAS) y un regulador transcripcional crucial en lo que respecta a la organogénesis y el desarrollo neuronal, así como a los procesos de adaptación fisiológica a la hipoxia y los contaminantes . Además de ARNT (HIF-1β), existen otras dos isoformas ARNT2 y ARNT3 (BMAL1, MOP3, JAP3, ARNTL1) en varias especies. ARNT y ARNT2 comparten una identidad de aminoácidos >90%. ARNT tiene un patrón de expresión más ubicuo que ARNT2 en el tejido adulto. Estudios recientes informan de la vinculación de ARNT con varias disfunciones y enfermedades celulares, como el cáncer y la diabetes.

Como todas las moléculas bHLH, ARNT necesita dimerizarse para formar complejos de unión al ADN activos. Se sabe que ARNT forma heterodímeros con el receptor de hidrocarburos de arilo (AhR), activado por un ligando xenobiótico, con el que se inducen enzimas de metabolización, con las subunidades HIF-α (factores inducibles por hipoxia) bajo niveles bajos de oxígeno, con las proteínas SIM (Single Minded) para el desarrollo neuronal y con CHF1 (cardiovascular helix-loop-helix factor 1). Anteriormente demostramos que el ARNT probablemente se transloca al núcleo mediante la importación nuclear clásica mediada por las importinas α/β. A pesar de una exportación nuclear coexistente, ARNT se acumula principalmente en el núcleo.

En la hipoxia, las subunidades α de los factores inducibles por hipoxia (HIF-α) se estabilizan y forman heterodímeros con ARNT (HIF-1β) que regulan la respuesta celular a los bajos niveles de oxígeno. Actualmente se han identificado tres isoformas diferentes de subunidades HIF-α dependientes del oxígeno: HIF-1α, HIF-2α (EPAS1) y HIF-3α . En condiciones de normoxia, las proteínas HIF-α se someten a una hidroxilación por parte de las enzimas Prolyl-Hydroxylase-Domain 1-3 (PHD1-3). El HIF-α prolijamente hidroxilado sirve como motivo de reconocimiento para la poliubiquitinación por la proteína Von Hippel-Lindau (pVHL) y la posterior degradación proteasomal. Sin embargo, ARNT carece del dominio de degradación dependiente del oxígeno (ODDD) y se considera que se expresa constantemente en condiciones de normoxia. La opinión actual es que la hipoxia no tiene ningún efecto sobre los niveles de ARNT. Sin embargo, existen estudios dispersos que observan un aumento parcialmente concomitante de los niveles de proteína ARNT en la hipoxia. Aquí proporcionamos pruebas de que la expresión de ARNT está efectivamente influenciada y modulada dependiendo del tipo de célula evaluada. Esto sugiere que las células tumorales podrían perder la capacidad de regular el ARNT durante la tumorigénesis. Nuestros datos muestran que la regulación de la expresión de ARNT es mucho más compleja de lo que generalmente se piensa.

En nuestro estudio investigamos la expresión de ARNT bajo diferentes tipos de hipoxia, miméticos de hipoxia y Factores Inducibles de Hipoxia revelando patrones de expresión específicos de la línea celular y dependientes de los cofactores.

Materiales y métodos

Cultivo celular, inducción hipóxica y miméticos de hipoxia

Las líneas celulares MCF-7 (carcinoma ductal de mama humano), T47D (carcinoma ductal de mama humano), Hep3B (carcinoma hepatocelular humano), HeLa (adenocarcinoma de cuello uterino humano), HepG2 (carcinoma hepatocelular humano) y Cos-7 (células renales similares a los fibroblastos de primates) se incubaron en medio de cultivo DMEM (Gibco). Las líneas celulares REPC (riñón humano primario, ) y Kelly (neuroblastoma humano) se cultivaron en medio RPMI-1640 (Gibco). El medio de cultivo se complementó con un 10% de suero fetal de ternera (FCS, Gibco) y 100 UI/ml de penicilina / 100µg/ml de estreptomicina, respectivamente. Las células se cultivaron en una atmósfera humidificada a 37°C, 5% de CO2 y 20,9% de O2 (normoxia). Para los estudios de hipoxia, las células se colocaron en una atmósfera humidificada a 37°C, 5% de CO2, N2 equilibrado con 1% o 3% de O2. El cloruro de cobalto (II) (CoCl2) se utilizó en una dilución de 50 µM y la dimetiloxalilglicina (DMOG) se utilizó en una dilución de 1 mM como mimético de la hipoxia.

Transfección transitoria

Las líneas celulares MCF-7, T47D y Hep3B se transfectaron con siRNA utilizando el reactivo de transfección Lipofectamine™ RNAiMAX (Invitrogen). Las células se cultivaron hasta un 50% de confluencia en placas de cultivo de 6 pocillos antes de realizar la transfección siguiendo el protocolo del fabricante. Antes de la aplicación de la hipoxia se cambió el medio de cultivo y las células se incubaron otras 6 horas en condiciones de normoxia.

Análisis de inmunoblot y densitometría

Para el Western blotting se recogieron las células después del tratamiento, se lavaron con PBS helado, se extrajeron con tampón de lisis de urea y se sonicaron recogiendo lisados de células enteras. Las concentraciones de proteínas se determinaron mediante el ensayo de proteínas DC de Bio-Rad siguiendo el protocolo del fabricante. Los extractos de proteínas se electroforizaron por SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa por electroblotting semiseco. Las membranas se bloquearon con leche descremada al 5% en PBS. Los anticuerpos primarios (HIF-1α: BD transduction, 1:1000; ARNT: Novus 1:1000) se incubaron durante la noche, seguidos de los correspondientes anticuerpos secundarios HRP (DAKO 1:5000) añadidos durante 2 horas. Se utilizó ECL (GE Healthcare) como reactivo de detección. La cantidad de proteínas se comparó utilizando el Aida Image Analyser v.4.27 (Raytest) de acuerdo con los protocolos. El fondo de cada Western blot se restó del área de medición individual. La carga de Lamin A/C correspondiente se consideró del 100% y se calculó el valor proporcional.

Aislamiento de ARN y RT-PCR

Para medir los niveles cuantitativos específicos de ARNm, se aisló el ARN total de las células utilizando ABI Prism 6100 Nucleic Acid PrepStation (Applied Biosystems) siguiendo las instrucciones del fabricante. A continuación, se transcribieron 0,2 µg de ARN en sentido inverso utilizando Superscript III (Invitrogen). El ADNc generado se utilizó como plantilla en el análisis de PCR cuantitativa en tiempo real (RT-PCR). La RT-PCR se realizó utilizando el sistema de detección de secuencias ABI 7000 (Applied Biosystems), la mezcla maestra de PCR TaqMan Universal (Applied Biosystems) y KAPA SYBR FAST Universal (Peqlab). La amplificación se llevó a cabo utilizando los ensayos de expresión génica TaqMan (Hs01100353_m1, Applied Biosystems) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Se utilizaron cebadores específicos para el gen de mantenimiento L28 (sentido: 5`-ATGTCGTGGAACTGCT-3` y reverso: 3`-TTGTAGCGGAAGGAATTGCG-5`) para la normalización. Las condiciones de los ciclos fueron un paso inicial de activación de la polimerasa a 95 °C durante 10 minutos, seguido de 45 ciclos a 95 °C durante 15 s, 55 °C durante 30 s y a 72 °C durante 20 s. Las muestras se analizaron por cuadruplicado y las cantidades relativas de ARNm se calcularon mediante el método ∆∆CT.

Estadísticas

El análisis estadístico se realizó con el software GraphPad InStat. Se aplicó la prueba t no apareada. Los gráficos se muestran como medias ± desviación estándar (SD). Se realizaron ensayos de supervivencia con MTT (datos no mostrados) para asegurar que la supervivencia celular no difería entre las muestras.

Resultados

La expresión de ARNT se induce en hipoxia en células MCF-7, HeLa, Hep3B y REPC

Examinamos la cantidad de niveles de proteína ARNT cultivando células MCF-7 en condiciones de normoxia (21% de O2) durante 24 horas seguidas de 48 horas de normoxia (Nox) o 24 horas de normoxia y 24 horas de hipoxia 1% (Hox 1% 24h, 1% O2) o sólo 48 horas de hipoxia 1% (Hox 1% 48h, 1% O2). Los extractos de células enteras se analizaron mediante inmunotransferencia utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón anti-ARNT. Se observó la proteína HIF-1α para confirmar la inducción celular hipóxica. Como se muestra en la Fig. 1, los niveles de proteína ARNT se elevaron en respuesta a la hipoxia en las células MCF-7. 24 horas de incubación de hipoxia al 1% condujeron a un aumento significativo de ARNT en comparación con 48 horas de hipoxia al 1%.

Las células MCF-7 se incubaron hasta 96 horas en hipoxia del 1%, para revelar los efectos a largo plazo de la hipoxia. Las células MCF-7 mostraron un aumento de la concentración de ARNT después de 12 horas. En una mayor exposición a la hipoxia, las concentraciones de ARNT comenzaron a disminuir hasta alcanzar un valor de referencia (Fig. 2).

La inducción de ARNT debido a diferentes intensidades de hipoxia se midió cultivando células MCF-7 en hipoxia del 3% (3% O2) y en hipoxia del 1% (1% O2) durante 12 horas y 24 horas (Fig. 3a).

Para dilucidar las diferencias entre las distintas líneas celulares cultivamos células HeLa, Hep3B y REPC de forma similar a las células MCF-7 (Fig. 3b-d). En todos los tipos celulares tratados con hipoxia los niveles de proteína ARNT fueron elevados. La hipoxia del 1% condujo a un aumento más rápido de los niveles de proteína ARNT pero también a una normalización más temprana que la hipoxia del 3%. La hipoxia al 3% muestra una inducción máxima de ARNT después de 24 horas.

Diferentes líneas celulares muestran diversas reacciones a la hipoxia y a los miméticos de hipoxia en lo que respecta a los niveles de proteína ARNT

Para investigar una relación entre los niveles de ARNT y HIF-α, las células MCF-7, HeLa, Cos7, REPC, HepG2, Hep3B y Kelly fueron tratadas con los miméticos de hipoxia cloruro de cobalto(II) (CoCl2) y dimetiloxalilglicina (DMOG) (Fig. 4a-g).

Las células HepG2 y Kelly no respondieron a 24 horas de hipoxia con un aumento de los niveles de proteína ARNT. Las células HeLa mostraron una ligera inducción de ARNT en hipoxia y bajo tratamiento con miméticos de hipoxia, pero este efecto no fue estadísticamente significativo. Las células MCF-7 mostraron claramente un aumento de los niveles de proteína ARNT bajo 24 horas de hipoxia al 3% y un aumento de los niveles de proteína ARNT debido al tratamiento con CoCl2. Por otro lado, el tratamiento con DMOG no tuvo ningún impacto en los niveles de ARNT en las células MCF-7, aunque DMOG es un estabilizador de HIF muy potente. Las células Cos7 mostraron un fuerte efecto de inducción de ARNT a la hipoxia, así como a los miméticos de hipoxia CoCl2 y DMOG. Las células REPC mostraron una fuerte respuesta a la hipoxia, sin embargo la inducción de ARNT por CoCl2 fue relativamente pequeña. DMOG redujo los niveles de proteína ARNT en las células REPC. Las células HepG2 no reaccionaron con la inducción del nivel de proteína ARNT a la hipoxia ni a la DMOG. Sin embargo, las células HepG2 mostraron una inducción muy fuerte de ARNT por CoCl2. Las células Hep3B reaccionaron con un aumento de los niveles de proteína ARNT a todos los tratamientos. Las células Kelly no mostraron ninguna reacción en los niveles de proteína ARNT, ni a la hipoxia ni a los miméticos de la hipoxia.

Los cambios en los niveles de ARNT mRNA no se correlacionan con los niveles de proteína ARNT bajo la influencia de la hipoxia y de los miméticos de la hipoxia

Utilizamos el método cuantitativo RT-PCR, para examinar los niveles de mRNA relacionados con los cambios observados en los niveles de proteína ARNT. Las células MCF-7, HeLa, REPC y Hep3B se cultivaron en condiciones de normoxia antes de aplicar el tratamiento de hipoxia al 3%, hipoxia al 1%, CoCl2 y DMOG durante 24 horas (Fig. 5). Las células MCF-7 demostraron una disminución insignificante de los niveles de ARNT mRNA en respuesta a la hipoxia. Sin embargo, se observó una reducción significativa de los niveles de ARNT mRNA debido al tratamiento con CoCl2 y DMOG. Mientras que las células HeLa y REPC no mostraron ningún efecto en los niveles de ARNT mRNA tras los tratamientos, las células Hep3B reaccionaron a la hipoxia con una fuerte reducción del ARNT mRNA. En estas células se observó una reacción de disminución más leve al CoCl2.

La proteína ARNT se estabiliza en presencia de HIF-1α

Las células CMF-7, T47D y Hep3B se transfectaron transitoriamente con HIF-1α siRNA, para aclarar el efecto de Hif-1α en los niveles de proteína ARNT (Fig. 6). Las células se incubaron durante 48 horas en normoxia con el reactivo de transfección RNAiMAX y siRNA, seguido de una fase de recuperación de 6 horas. Posteriormente las células se mantuvieron en hipoxia al 1% durante 24 horas. Observamos que los niveles de proteína ARNT disminuían en hipoxia si se bloqueaba HIF-1α. Sin embargo, la transfección inespecífica de ARNsi no influyó en el aumento observado de los niveles de proteína ARNT en hipoxia.

Discusión

El translocador nuclear del receptor de hidrocarburos de arilo (ARNT/HIF-1β) desempeña un papel como regulador transcripcional fundamental en la homeostasis celular. Funciona como socio de heterodimerización de varias proteínas reguladoras importantes, como HIF-α, proteínas SIM, AhR y CHF1. Por lo tanto, está implicado en muchas vías celulares reguladoras diferentes. Debido al hecho de que se cree que la ARNT se expresa de forma constitutiva y no está influenciada por cambios fisiológicos o farmacológicos, por ejemplo la hipoxia, la ARNT no se consideraba el factor limitante y una posible diana terapéutica en informes anteriores . Sin embargo, estudios recientes informan de una relación entre la ARNT y varias enfermedades, como el cáncer . Se sabe que HIF-1α y HIF-2α tienen funciones cruciales en el desarrollo y/o la terapia del cáncer . Como su cofactor obligatorio, el agotamiento de ARNT daría lugar a niveles inactivos o disminuidos de los complejos HIF-α. Para subrayar aún más la relevancia de ARNT, demostramos por primera vez que la hipoxia, los miméticos de hipoxia y HIF-1α juegan un papel importante en los mecanismos reguladores de la expresión de ARNT dependiendo del tipo celular evaluado.

Examinamos ocho líneas celulares diferentes de 2 especies de huéspedes diferentes para demostrar la influencia de la hipoxia y los miméticos de hipoxia en la expresión de la proteína ARNT. Las células de cáncer de mama MCF-7 reaccionan a la hipoxia con un aumento de los niveles de proteína ARNT, mientras que los niveles de ARNT mRNA parecen disminuir o permanecer sin cambios. Esto implica que existe una regulación de retroalimentación recíproca entre la estabilización de la proteína y la síntesis de novo. Se conocen regulaciones similares de bajada y subida de la transcripción de genes en hipoxia para varias enzimas y moléculas. Nuestros hallazgos no son necesariamente el resultado de una reducción general de la síntesis de ARNm en la célula como respuesta al estrés celular, ya que la transcripción del gen ESR2 se induce en la hipoxia y en el knock-down de HIF-1α (datos no publicados).

La exposición a la hipoxia durante un periodo superior a 48 horas conduce a una reversión a los niveles basales de la proteína ARNT que puede observarse en normoxia. Se conoce un pico de expresión similar para la proteína HIF-1α después de 4 a 12 horas bajo tratamiento hipóxico. Una incubación hipóxica adicional conduce a la disminución de los niveles de HIF-1α hasta alcanzar un estado estable. Este hecho podría sugerir un efecto estabilizador de la sobreexpresión de HIF-1α hacia el ARNT. La formación de complejos HIF-1α/ARNT en el núcleo podría impedir la degradación de ARNT a través de los proteasomas, lo que coincide con Choi et al. y Mandl et al. . Para investigar nuestros hallazgos, eliminamos transitoriamente HIF-1α en las células MCF-7 y observamos una reducción de hasta el 90% de los niveles de proteína ARNT en hipoxia en comparación con la normoxia. Este efecto también se observó en las células T47D y Hep3B. Un análisis in silico de las secuencias del siRNA y del gen descartó una reacción cruzada del siRNA de HIF-1α que derriba el ARNT debido a una fuerte homología de secuencia entre el ARNT y el HIF-α. Estos resultados sugieren una fuerte correlación entre el ARNT y la expresión de la proteína HIF-1α. Una explicación podría ser un efecto estabilizador de los socios de unión de ARNT independientes del O2, como el AhR, SIM y CHF1, hacia ARNT en normoxia. En hipoxia, los niveles reducidos de AhR, SIM y CHF1, podrían ser compensados por la sobreexpresión de HIF-α con respecto a la estabilización de ARNT. Por lo tanto, la eliminación de HIF-1α podría dar lugar a una gran disminución de los niveles de ARNT a través de una menor síntesis de novo y una menor estabilidad frente a la ubiquitinación y la degradación proteasomal, ya que faltan socios de dimerización. Esta hipótesis subrayaría una regulación de ARNT altamente dependiente de los socios de unión, lo que estaría en línea con Choi et al. y Mandl et al. . Para examinar si la inducción de HIF-α conduce a un aumento concomitante de la expresión de ARNT, tratamos las células con CoCl2 y DMOG. A pesar de que el efecto estabilizador de HIF-α de CoCl2 y DMOG es análogo, las células MCF-7 después de DMOG reaccionan menos fuertemente con un aumento de la proteína ARNT que después del tratamiento con CoCl2. Estas observaciones están en línea con un efecto estabilizador de HIF-α sobre ARNT. En las células HepG2 se observó un comportamiento opuesto entre la inducción de ARNT por CoCl2 en contraste con DMOG. Curiosamente las células REPC reaccionan con una disminución de los niveles de ARNT bajo el tratamiento con DMOG. Aunque el efecto estabilizador de HIF-α de DMOG es similar al de CoCl2, una reacción celular diferente por DMOG no es inusual debido a un modo de acción diferente. Por otro lado, las células Cos7 y Hep3B reaccionan a la hipoxia y a ambos miméticos de la hipoxia con un fuerte aumento de los niveles de proteína ARNT, lo que coincide con el efecto estabilizador de HIF-α postulado por Mandl et al. . El hecho de que, en contraste con varias líneas celulares tumorales, los niveles de ARNT estén bien influenciados en la línea celular primaria Cos7 por la hipoxia y los miméticos de hipoxia podría implicar una pérdida de función durante la tumorigénesis en ciertos tumores. Los datos relativos a ARNT en el desarrollo del cáncer celular son escasos y, por lo tanto, es necesario seguir investigando.

La línea celular Hep3B muestra aumentos significativos de los niveles de proteína ARNT debido a los tres tratamientos hipóxicos, mientras que la hipoxia y el CoCl2 reducen significativamente el ARNM de ARNT. Estos resultados apoyan la hipótesis de un mecanismo de retroalimentación recíproca, que también se puede hipotetizar en las células MCF-7. La línea celular renal REPC muestra un comportamiento desviado. Estas células reaccionan con un fuerte aumento de la proteína ARNT debido a la hipoxia, pero con una inducción menos intensa debido al CoCl2 y en disenso con la disminución de los niveles de la proteína ARNT bajo el tratamiento con DMOG como se discutió anteriormente. Pero además, las células REPC no muestran ninguna variación en los niveles de ARNT mRNA bajo los distintos tratamientos, lo que implica una regulación sobre la base de proteínas.

Las células Kelly muestran niveles estables de proteína ARNT. Ni la hipoxia ni los miméticos de la hipoxia son capaces de influir en el ARNT. Dichos niveles estables de ARNT se observan también en las células HepG2 en tratamiento de hipoxia y DMOG, pero esta línea celular reacciona con un fuerte aumento de la proteína ARNT al tratamiento con CoCl2. Las células HeLa no muestran un cambio significativo de los niveles de ARNT, ni en lo que respecta a la proteína ni al ARNm. Estos hallazgos apoyan la opinión actual, de que el ARNT se expresa constantemente y no está influenciado por la hipoxia, tal y como revisó Semenza . Nosotros y otros hemos demostrado que esta opinión no puede ser generalizada . Aportamos datos que contradicen la hipótesis de una pareja de heterodimerización de ARNT constantemente expresada y no regulada pero que está en línea con Chilov et al., . También apoyando a Choi et al. y Mandl et al., mostramos que la heterodimerización con HIF-α es un mecanismo importante de estabilización de la proteína ARNT en hipoxia .

En conclusión, nuestros datos sugieren una regulación estabilizadora general de los socios de unión de ARNT, como HIF-α, AhR, SIM y CHF1 con respecto a la expresión de ARNT. Además, podemos demostrar que cada línea / tipo de célula reacciona de forma distinta a la hipoxia y a los miméticos de la hipoxia con respecto a la inducción de la síntesis de proteínas ARNT. Por lo tanto, una predicción universalizada de la extensión celular de la expresión de la proteína ARNT no es permisible. Estos hallazgos muestran que la regulación de ARNT debe ser investigada más a fondo, especialmente en lo que respecta a la tumorigénesis, porque la regulación de ARNT es mucho más compleja de lo que se aprecia hoy en día.

Agradecimientos

Agradecemos a T. Svensson, B. Rudzewski y A.-K. Hellberg por su excelente apoyo técnico. Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

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