Ensayos de apoptosis comúnmente utilizados en la investigación de la apoptosis
Pregunta:
¿Cuáles son los ensayos de apoptosis más utilizados?
El hombre de las proteínas dice:
La investigación de la apoptosis requiere el uso de una amplia gama de ensayos de apoptosis ya que el proceso en sí es bastante complicado. Además, no hay un único parámetro que pueda definir la muerte celular en todos los sistemas, por lo que debe utilizar varios enfoques para llevar a cabo su investigación.
Principales tipos de ensayos de apoptosis
Hay cinco tipos distintos de ensayos de apoptosis que se utilizan actualmente en la investigación de la apoptosis. Estos incluyen los ensayos de caspasas, los ensayos de fragmentación del ADN, los ensayos de permeabilidad celular y los ensayos mitocondriales. Además, también hay un tipo de ensayo que puede utilizarse para facilitar el análisis de la vía de señalización de la apoptosis.
Ensayos de caspasas. La presencia de enzimas caspasas en cualquier muestra es un indicador seguro de que se están produciendo eventos bioquímicos complejos asociados a la apoptosis. Por ello, los ensayos de caspasas pueden utilizarse para detectar la apoptosis en poblaciones celulares durante sus etapas más tempranas. Estos ensayos utilizan habitualmente sustratos específicos que son digeridos por las caspasas para liberar sustratos colorimétricos o fluorométricos.
Ensayos de fragmentación del ADN. La apoptosis y la fragmentación del ADN van de la mano, por lo que se puede determinar el grado de apoptosis midiendo los fragmentos de ADN presentes en la muestra. La mayoría de los investigadores utilizan el análisis de escalera de ADN apoptótico, la cuantificación por ELISA y los ensayos TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) para este propósito.
Ensayos de permeabilidad celular. La apoptosis en fase media puede determinarse mediante ensayos de permeabilidad celular. Como probablemente sepa, las células sanas tienen membranas plasmáticas rígidas mientras que las células muertas tienen membranas celulares altamente permeables. Con sus membranas altamente comprometidas, los colorantes fluorescentes pueden atravesar fácilmente las células apoptóticas. Cuando esto ocurre, observará un patrón de fluorescencia o tinción característico que indica la presencia de poblaciones de células apoptóticas en su muestra.
El aumento de la permeabilidad celular también provoca la pérdida de proteínas citosólicas de la célula. La lactato deshidrogenasa (LDH) es una enzima citosólica soluble que se libera en el medio de cultivo tras la pérdida de la integridad de la membrana resultante de la apoptosis o la necrosis. La actividad de la LDH, por tanto, puede utilizarse como indicador de la integridad de la membrana celular y sirve como medio general para evaluar la citotoxicidad resultante de compuestos químicos o factores tóxicos ambientales. Existen varios ensayos para la cuantificación de la LDH liberada.
Ensayos mitocondriales. Los ensayos mitocondriales pueden ayudar a determinar la apoptosis en una fase temprana, ya que utilizan un colorante catiónico que emite una fluorescencia diferente cuando se utiliza en poblaciones de células sanas y en poblaciones de células apoptóticas.
Saber qué ensayos de apoptosis utilizar y cuándo utilizarlos puede ayudarle mucho en su investigación, así que es mejor que empiece a conocerlos de memoria.