Estudio comparativo del efecto de la baicalina y sus análogos naturales sobre las neuronas con privación de oxígeno y glucosa que implican la reacción inmunitaria innata de TLR2/TNF𝛼

Al confirmarse la antiinflamación de la baicalina y la baicaleína, se estudiaron las investigaciones sobre la respuesta inmunitaria innata en la reperfusión de la isquemia cerebral y se presentó la razón, en parte, por la que la antiinflamación de la baicalina y la baicaleína era uno de los principales ensayos para la protección del cerebro del daño por reperfusión de la isquemia . Se indicaron varios receptores como objetivos clave de la lesión por reperfusión isquémica en la glía, como los receptores tipo toll (TLR) y los NOD (dominio de oligomerización de unión a nucleótidos). Nuestro experimento anterior demostró que la baicalina atenuaba la expresión de NOD2 y TNFα en las neuronas con daño por isquemia y reperfusión in vivo e in vitro . Se ha informado de que el wogonoside inhibe la angiogénesis inducida por el lipopolisacárido a través de la transducción de señales del receptor tipo Toll 4 (TLR4). Sin embargo, el TLR2 no ha sido investigado por la baicalina y sus análogos naturales.

Basado en la información mencionada anteriormente, investigamos el comportamiento de regulación de la baicalina y sus análogos a través de un tipo de célula neuronal PC12 con el fin de explorar los posibles objetivos de la baicalina y sus análogos en las reacciones inmunes innatas durante la privación de oxígeno y glucosa (OGD) y las relaciones entre la estructura química y el efecto entre la baicalina y sus análogos naturales. Dado que el TLR2 es uno de los receptores iniciales en la inmunidad innata y la activación inflamatoria, así como el TNFα, pueden ser inhibidos por la baicalina en las células pulmonares, se analizó la expresión proteica del TLR2 y del TNFα para averiguar el papel de la baicalina y sus análogos en estos modelos de lesión nerviosa. Mientras tanto, la caspasa3 es un índice bien conocido de apoptosis, y varios estudios informaron que algunas flavonas podrían inducir la apoptosis de las células inflamatorias , por lo que detectamos la expresión de la proteína caspasa3. Además, en este trabajo también se detectó el efecto de los cuatro análogos sobre la capacidad total de antioxidación de las células en el modelo OGD, que comparó además la competencia total de estas flavonas.

2. Materiales y métodos

2.1. Productos químicos y materiales

La baicalina (la pureza era del 98%) fue presentada por el Dr. Lujun Zhang, del Laboratorio de Ciencias Farmacéuticas de la Universidad de Tsinghua. El wogonósido (con una pureza del 98%) fue presentado por el Dr. Xiuwei Yang, de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas de la Universidad de Pekín. La baicaleína y la wogonina, todas con una pureza del 98% (número de lote 111595-200604 y 111514-200403), se adquirieron en el Instituto Nacional de Control de Productos Farmacéuticos y Biológicos de China. Durante todo el experimento se utilizó agua desionizada. Los demás disolventes y reactivos orgánicos eran de calidad de reactivo analítico. El tampón PBS con pH7,4 se preparó en nuestro laboratorio. Las células PC12 fueron proporcionadas por el Banco de Células del Instituto de Medicina Fundamental de la Academia China de Ciencias Médicas (Pekín, China). El suero fetal bovino (FBS) y el medio RPMI 1640 se compraron a GIBCO. Los anticuerpos anti-TLR2/TNFα/caspasa3/β-actina se compraron a la empresa Santa Cruz (EE.UU.). El anticuerpo secundario se compró a la empresa Zhongshan (Pekín, China). El kit de detección de la capacidad de antioxidación total (T-AOC) se adquirió en el Instituto de Bioingeniería de Nanjing Jiancheng (Nanjing, China).

2.2. Cultivo celular

Las células PC12 se ajustaron a aproximadamente 1 × 106 células/mL con 2 mL inoculados en cada pocillo de placas de 6 pocillos (Costar) en RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 5% de suero de caballo y penicilina/estreptomicina (100 U/mL cada uno). Las células se cultivaron en una incubadora humidificada (5% de CO2) (Sanyo, Japón) a 37°C y se dejaron fijar durante al menos 48 h.

2.3. Ensayos de citotoxicidad in vitro

Las dosis seguras de baicalina y sus tres análogos para las células se evaluaron mediante el ensayo de MTT (metiltiazol tetrazolio) in vitro. Tras 24 h de incubación de las células en placas de 96 pocillos, se añadieron la baicalina y sus análogos con la dosis de 10 mg/mL a 0,001 mg/mL. 24 h después de la adición de los compuestos, el medio de cultivo en las placas de 96 pocillos se incubó con MTT (5 mg/mL, 200 μL por pocillo) a 37°C durante 4 h. A continuación se aspiró cuidadosamente el medio y se añadieron 200 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) por pocillo para disolver los productos azules de formazán. Los valores de absorbencia a 490 nm se midieron utilizando un lector de microplacas (Modelo 550，Bio-Rad，USA). Los resultados de la absorbancia de los pozos de ensayo se expresaron como células vivas. Se calculó la concentración de citotoxicidad del 50% (CC50) .

2,4. Células para la privación de oxígeno-glucosa

Para la privación de oxígeno-glucosa (OGD) , sustituimos el medio de crecimiento por medio de cultivo sin glucosa (2 mL por pocillo) y pusimos las placas en una incubadora (YCP-30Q, Changsha, China) llena de 95% N2/5% CO2 a 37°C durante 120 min. A continuación, las células se devolvieron al medio de alimentación normal y se incubaron en condiciones normales a 37°C (Sanyo, Japón) durante el tiempo específico para los experimentos posteriores. Los cultivos celulares de control no privados de oxígeno y glucosa se incubaron en condiciones normales en el medio con glucosa.

Para el efecto protector de los compuestos frente a los daños causados por la OGD, el ensayo de vida celular se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente. Tras 24 h de incubación de las células en placas de 96 pocillos, se añadieron la baicalina y sus análogos con las dosis de 10 mg/mL a 0,001 mg/mL. 24 h después de añadir los compuestos, el medio de cultivo en las placas de 96 pocillos se incubó con MTT (5 mg/mL, 200 μL por pocillo) a 37°C durante 4 h. Se aspiró cuidadosamente el medio y se añadieron 200 μL de DMSO por pocillo para disolver los productos azules de formazán. Los valores de absorbencia a 490 nm se midieron con un lector de microplacas. Los resultados de la absorbancia de los pozos de ensayo se expresaron como células vivas. Se calculó la concentración efectiva del 50% (EC50). En combinación con la citotoxicidad (CC50) de los compuestos, los índices de seguridad (IS) se calcularon mediante EC50/CC50.

Para el estudio de TLR2/TNFα y caspasa3, la concentración mínima de seguridad de la baicalina y sus análogos se ordenó en 10 μg/mL. Estos compuestos (10 μg/mL) se añadieron cuando el medio de cultivo se cambió por una solución de glucosa y las células se cultivaron en condiciones normales. Las células se recogieron para el experimento de proteínas en el tiempo de reperfusión específico (0,5, 1, 3, 6 h) después de añadir la baicalina y sus análogos. En el control, se utilizó el medio como vehículo y las células se recogieron al tiempo de reperfusión de 6 h.

2.5. Preparación de las muestras

Se emplearon dos grupos sin medicamentos como control. Un grupo de las células fue sembrado en el medio con medio de crecimiento normal durante todo el proceso experimental sin privación de oxígeno-glucosa. El segundo grupo se sembró en el medio con proceso de privación de oxígeno-glucosa como modelo de control. En cada punto de tiempo, la muestra de células se preparó igual que la descripción anterior. Se extrajo el medio de cada pozo, y las células se lavaron tres veces con PBS frío (pH 7,4) y se utilizaron con 100 μL de RIPA para recoger la proteína total para el Western blot.

2.6. Western Blot

El ensayo de Western blot para la expresión de proteínas de β-actina, TLR2, TNFα y Caspasa3 se referenció con una mínima modificación de la siguiente manera: se cargaron las muestras en el gel (10%), se corrió hasta el marcador (adquirido en Fermentas República de Lituania) y se fue hasta el final del gel. La transferencia debe ser semidirecta durante 60 minutos a 12 voltios y 280 mA. A continuación se bloqueó la membrana con leche al 10% en PBST (1 × PBS + 0,1% Tween20) durante 60 min agitando lentamente a temperatura ambiente. La membrana se introdujo en 1 mL de PBST con anticuerpo en una dilución de 1 : 1000, se incubó durante 60 min a temperatura ambiente en el agitador y se lavó 3 veces con PBST después de la incubación del anticuerpo primario. Después, la membrana se incubó durante 60 minutos en PBST con el anticuerpo secundario con la concentración 1 : 3000. La membrana se lavó 3 veces con PBST al final.

2.7. Detección de la capacidad de antioxidación total

El principio de este experimento era detectar el cambio de color tras la reducción de Fe3+ a Fe2+ por los componentes reductores de las muestras. Los componentes reductores podrían incluir las moléculas enzimáticas y no enzimáticas, como el antioxidante liposoluble vitamina E y los antioxidantes hidrosolubles vitamina C, la bilirrubina y el ácido úrico. A continuación se midió la densidad óptica a 520 nm con un lector de microplacas. La muestra de células se preparó igual que la descripción anterior y se recogió al tiempo de reperfusión específico (6 h) después de añadir la baicalina y sus análogos. Se extrajo el medio de cada pocillo y las células se lavaron tres veces con PBS frío (pH 7,4). Las células de la placa se resolvieron con PBS (1 mL/pozo) mediante la congelación y descongelación repetida. El sobrenadante se recogió para la prueba T-AOC después de centrifugar a 12 000 rpm/min.

2.8. Análisis de datos

Todos los valores se expresaron como media ± D.S. Los datos se analizaron estadísticamente mediante ANOVA. Se utilizaron las comparaciones de Newman-Keuls para determinar el origen de las diferencias significativas cuando procedía. Los valores P inferiores a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Se empleó el software de CALC 2.0 (The China Association of Pharmacology) para el cálculo de CC50 y EC50.

3. Resultados

3.1. Perfil de crecimiento celular

Las células se sembraron en las placas del medio con un 10% de FBS durante 48 h. No se utilizarían para los experimentos hasta que crecieran bien y se adhirieran firmemente unas a otras en el plano de las placas multipocillo.

3.2. Pruebas MTT de citotoxicidad

Para examinar la citotoxicidad y determinar las dosis seguras de baicalina y sus análogos, se realizó el ensayo MTT en células PC12 in vitro. Sobre la base de los experimentos, 10 μg/mL de baicalina y wogonósido fue la mayor concentración de seguridad en células PC12 normales, y 1 μg/mL de baicaleína y wogonina fue la mayor concentración de seguridad en células PC12 normales (Figura 2).

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Figura 2

Citotoxicidad de la baicalina wogonósido, baicaleína y wogonina en células PC12 normales (ensayo MTT). Tras 24 h de incubación de las células en placas de 96 pocillos, se añadieron las sustancias químicas con una dosis de 10 mg/mL a 0,001 mg/mL. *𝑃<0,05 frente al control normal. Los datos se presentan como media ± D.S. de siete experimentos independientes.

En las células PC12 tratadas con privación de oxígeno-glucosa, sólo sobrevivieron menos del 40% de las células en comparación con el control normal (𝑃<0,05). En comparación con el control modelo, la concentración mínima efectiva (MEC) de la baicalina y la wogonina fue de 10 μg/mL, mientras que la MEC tanto del wogonósido como de la baicaleína fue la misma a 1 μg/mL. La concentración máxima efectiva (MAXEC) de la baicalina y la wogonina fue la misma a 1 mg/mL, lo que implica la misma seguridad de las mismas. La MAXEC del wogonósido fue de 1 mg/mL, pero la MAXEC de la baicaleína fue sólo de 10 μg/mL. Se sugirió que la baicaleína era más citotóxica que el wogonósido. Todos estos compuestos no se mostraron en la manera dependiente de la concentración claramente (Figura 3).

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Figura 3

Protección de la baicalina wogonósido, baicaleína y wogonina en células PC12 con privación de oxígeno-glucosa (ensayo MTT). Tras 24 h de incubación de las células en placas de 96 pocillos y 2 h de privación de oxígeno-glucosa, se añadieron los compuestos con la dosis de 1 mg/mL a 0,001 mg/mL. #𝑃<0,05 frente al control normal. *𝑃<0,05 frente al modelo. Los datos se presentaron como media ± D.S. de siete experimentos independientes.

El CC50 de la baicalina (188,4 μg/mL o 0,422 mmol/L) mostró grandes diferencias con respecto a los otros tres compuestos. La baicaleína mostró más toxicidad celular con CC50 8,9 μg/mL (igual a 0,0329 mmol/L). La wogonina y el wogonósido mostraron una toxicidad similar con CC50 10,6 μg/mL (igual a 0,0373 mmol/L) y 13,7 μg/mL (igual a 0,0298 mmol/L), respectivamente. Sin embargo, la baicaleína fue más eficaz en la protección de las células contra el daño por OGD. La dosis mínima efectiva de baicaleína fue de 1 μg/mL (igual a 0,0037 mmol/L). La EC50 de la baicalina fue de 1,2 μg/mL (igual a 0,0027 mmol/L), y la EC50 de la wogonina y el wogonósido fue de 4.3 μg/mL (igual a 0,0151 mmol/L) y 7,4 μg/mL (igual a 0,0161 mmol/L). Comparando entre la toxicidad y el efecto, los índices de seguridad de los cuatro compuestos fueron 156 (baicalina), 8,89 (baicaleína), 2,47 (wogonina) y 1,85 (wogonósido), respectivamente (Tabla 1).

3.3. Efecto sobre las expresiones de las sustancias Efecto sobre las expresiones de TLR2, TNFα, y Caspasa3

Las proteínas de TLR2 y TNFα en las células lesionadas por OGD se expresaron de forma distinta, lo que significa que la OGD estimuló la reacción inmunitaria innata, causando inflamación. La proteína caspasa3 en el modelo de OGD se incrementó en cierto grado, pero no hubo un valor estadístico significativo (Figura 4). La baicalina atenuó la expresión proteica de TLR2 y TNFα 3 horas después de la administración. Cuando la baicalina surtió efecto durante 0,5 horas, la expresión de TLR2 mostró significación estadística sin importar si se comparaba con la normal o con el modelo (𝑃<0,05), y la expresión de TLR2 de 1 hora aumentó (comparando con la normal, 𝑃<0,05); sin embargo, su expresión de 3 h o 6 h no mostró ninguna diferencia evidente comparando con la normal (comparando con el modelo, 𝑃<0,05). La expresión de TNFα de 0,5 h seguía siendo superior a la del control (𝑃<0,05), y sus expresiones de 1 h, 3 h y 6 h se redujeron de forma evidente, lo que mostró una diferencia significativa respecto al nivel del modelo (𝑃<0,05). Aparentemente, la baicalina no afectó a la expresión de la proteína caspasa3, como se muestra en la figura 4(a).

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