Fronteras de la Farmacología

Introducción

Los péptidos biológicamente activos son el término general para diferentes péptidos que constituyen distintas composiciones y disposiciones de aminoácidos naturales. Se sabe que poseen una variedad de funciones biológicas como actividades antioxidantes, promotoras del sistema inmune, moduladoras de hormonas, antibacterianas, antitrombóticas, antivirales y antihipertensivas debido a los compuestos multifuncionales derivados de proteínas animales o vegetales (Wang et al., 2017). Además, tienen una alta seguridad alimentaria y una alta biodisponibilidad que los convierten en candidatos potenciales para el desarrollo de fármacos peptídicos funcionales y aditivos alimentarios funcionales (Sarmadia e Ismaila, 2010).

Según la estimación de la Organización Mundial de la Salud, las ECV representan la mortalidad de más de 17,5 millones de personas cada año. Entre las características importantes de la ECV, la hipertensión es un objetivo esencial para la prevención y el tratamiento de la ECV (Celermajer et al., 2012). Los fármacos reductores de la presión arterial utilizados actualmente, como el captopril y el enalapril, tienen un uso limitado debido a las reacciones adversas como la tos, la erupción cutánea y el dolor de cabeza (Yu et al., 2018). Sin embargo, las incidencias cada vez mayores de las ECV requieren algunas alternativas novedosas y seguras, como los péptidos activos derivados de alimentos. Últimamente, se han realizado importantes avances en la identificación y el cribado de componentes alimentarios que afectan positivamente a la salud cardiovascular (Martínez-Maqueda et al., 2012; Liu et al., 2018). Entre dichos compuestos, los péptidos han ganado especial atención debido a su efecto antihipertensivo. Anteriormente, la actividad hipotensora in vitro de los péptidos se ha determinado principalmente midiendo la actividad inhibidora de la enzima convertidora de angiotensina (ECA), que es una dipeptidil carboxipeptidasa localizada en la membrana celular y que puede causar un daño elevado al alterar el equilibrio entre los dos sistemas hormonales que regulan la presión arterial y el equilibrio de fluidos (Clayton et al., 2015; Gebre et al., 2018). Además, se confirmó que los péptidos antihipertensivos derivados de alimentos ejercen un efecto hipotensor en pacientes hipertensos sin ninguna toxicidad ni efectos secundarios (Martínez-Maqueda et al., 2012). La separación y purificación de péptidos antihipertensivos a partir de proteínas alimentarias proporcionaría una nueva dirección para el desarrollo de fármacos antihipertensivos naturales.

Los recursos de las semillas de Ginkgo biloba han sido ampliamente estudiados en todo el mundo debido a su notable actividad biológica y acción farmacológica. Las semillas de ginkgo, como medicina tradicional china, tienen una historia de más de 600 años, pero se sabe poco sobre sus principales componentes activos. Sólo unos pocos estudios informaron de los efectos antioxidantes, antifatiga y bacteriostáticos del aislado proteico de las semillas de G. biloba (Lena y Philip, 2002; Huang et al., 2010). Wu et al. (2013) hidrolizaron el péptido de Ginkgo con alcalasa y pepsina para obtener dos péptidos antioxidantes con capacidad para eliminar los radicales libres e inhibir la peroxidación lipídica. Sin embargo, los péptidos hipotensores de Ginkgo necesitan ser explorados más a fondo para desentrañar sus mecanismos subyacentes para una mayor acción.

Aquí, utilizamos cuatro tipos de proteasas para hidrolizar el GPI, con el fin de elegir uno de los hidrolizados con alta actividad inhibidora de la ECA y realizar la ultrafiltración para obtener componentes con diferentes MWs. Se estudiaron los efectos de los MWs en la actividad inhibidora de la ECA de los GPHs. También se estableció la relación entre la composición de aminoácidos y la actividad de los péptidos. Se purificaron, identificaron y sintetizaron los péptidos inhibidores de la ECA recién extraídos; se comprobaron sus valores IC50 y se exploraron los patrones de inhibición de los péptidos mediante gráficos de Lineweaver-Burk. También dilucidamos el mecanismo de inhibición de la ECA mediante un análisis de acoplamiento molecular.

Materiales y métodos

Materiales

Las semillas de G. biloba L. se adquirieron en la ciudad de Linyi de la provincia de Shandong, China. Las semillas se descascarillaron, se descascarillaron y se utilizaron para los experimentos posteriores. La enzima convertidora de angiotensina I y la hippuril-l-histidil-L-leucina (HHL), el ácido hipúrico, se compraron a Sigma (St. Louis, MO, Estados Unidos) y a Yuanye Bio-Technology (Shanghai, China), respectivamente. El captopril se adquirió de MedChem Express (NJ, Estados Unidos).

Preparación de GPI

Las semillas de G. biloba L. se secaron a 45°C, luego se trituraron en polvo y se tamizaron a través de una malla de 80. El polvo se liofilizó tras un tratamiento de desfenolación y desengrasado. El polvo de semillas de G. biloba resultante se disolvió en DW (1:20, p/v; pH 10,0). La suspensión anterior se agitó y se extrajo durante 12 h, seguida de una centrifugación a 10.000 g durante 30 minutos. El sobrenadante obtenido se ajustó al punto isoeléctrico de la proteína de ginkgo, pH 4,62, y se incubó durante 60 minutos, seguido de una nueva centrifugación a 10.000 g durante 30 minutos. El precipitado obtenido se resuspendió utilizando agua destilada, y la solución se ajustó a pH 7. Posteriormente, las GPI obtenidas se liofilizaron hasta su próximo uso.

Preparación de hidrolizados de proteínas de ginkgo (GPHs)

Para ello, se preparó una solución de GPI al 4% y se hidrolizó por separado con cuatro proteasas en sus condiciones óptimas de hidrólisis durante 5 h. Las dosis de enzimas fueron de 2.000 U. Después de la hidrólisis, las enzimas se inactivaron a 90°C durante 10 min y la solución se centrifugó a 3.000 g durante 30 min para obtener los sobrenadantes individuales obtenidos de cuatro enzimas.

Grado de hidrólisis

El grado de hidrólisis (DH) se calculó haciendo referencia al método de Kimatu et al. (2017) como sigue:

donde, B representaba la cantidad (mL) de NaOH añadida para mantener el pH constante durante el proceso de hidrólisis; Nb era la concentración molar de la solución de NaOH; MP era la masa (g) de la proteína; α designaba el grado medio de disociación en los sustratos proteicos durante la hidrólisis; htot era el número total de enlaces peptídicos en la proteína.

Aislamiento y purificación del péptido inhibidor de la ECA

La ultrafiltración de la muestra se llevó a cabo utilizando el ultrafiltro tipo copa MSC300 (MoSu, Shanghai, China). La muestra se añadió desde el puerto de alimentación y la botella de nitrógeno se conectó al accesorio de la manguera de la copa de ultrafiltración. A continuación, se colocó el vaso de ultrafiltración y se empaquetó en el agitador magnético conectado con la botella de gas nitrógeno con una presión no superior a 0,22 MPa. Las muestras se hicieron pasar secuencialmente por membranas de ultrafiltración de 1, 3, 5 y 10 kDa y se obtuvieron cuatro componentes (<1, 1-3, 3-5 y 5-10 kDa). Las cuatro fracciones se recogieron, se liofilizaron y se utilizaron para probar la actividad inhibidora de la ECA. Los componentes con mayor actividad de la ECA se seleccionaron para su posterior purificación según el procedimiento dado por Zheng et al. (2017). El hidrolizado liofilizado (200 mg) obtenido tras la ultrafiltración se resuspendió en agua purificada para obtener una concentración final de 50 mg/mL y se sometió a una purificación adicional utilizando la columna de filtración de gel Sephadex G-15 (1,5 cm × 60 cm). Las muestras se filtraron con una membrana de microfiltración y la elución se realizó con agua destilada a un flujo de 1 mL/min. La muestra se controló y se separó a una longitud de onda de 220 nm utilizando la HPLC semipreparativa P270 (Aixin, Guangzhou, China). Las fracciones (7,5 mL cada una) se recogieron y se liofilizaron.

Determinación de la actividad inhibidora de la ECA

Este ensayo se llevó a cabo según las descripciones están dadas por el informe anterior de O’Loughlin et al. (2014) con algunas modificaciones. Brevemente, el sustrato hipuril-histidil-leucina (HHL, 5 mM) y las muestras se mezclaron en Na2 0,1 M (pH 8,3) con cloruro de sodio 0,3 M. A continuación, se añadieron 50 μL de muestra y 150 μL de sustrato a un tubo de centrífuga, se mezclaron y se dejaron reposar en agua a 37°C durante 5 min. Posteriormente, se añadió la solución de ECA (50 mU/mL) y se incubó a 37°C durante 45 min. La reacción se terminó añadiendo 250 μL de HCl 1M y la solución se filtró a través de un filtro de jeringa de nylon de 0,45 μM antes de ser analizada por RP-HPLC (Waters, Milford, MA, Estados Unidos) en un Inertsil ODS-3 (250 × 4,6 mm, tamaño de partícula de 5 μm). La fase móvil consistió en agua destilada: acetonitrilo = 75:25 (V/V, con 0,1% de TFA) con un flujo de 0,5 mL/min y detección a 228 nm. Se utilizó captopril como control y la actividad inhibitoria (%) se determinó como sigue:

donde A era el área del pico de ácido hipúrico con la muestra, B era sin la muestra.

Análisis de LC-MS/MS e identificación de las secuencias de péptidos purificados

Las muestras purificadas se analizaron mediante Q Exactive (Thermo Fisher Scientific, MA, Estados Unidos) utilizando un Easy-nLC 1000 (Thermo Fisher Scientific, MA, Estados Unidos). La muestra se desaló y liofilizó, se reconstituyó en una solución de FA al 0,1% y se almacenó a -20°C hasta su siguiente uso. Las dos fases móviles fueron las siguientes: la fase móvil A constituía una solución acuosa de ácido fórmico al 0,1%, y la fase móvil B era una solución acuosa de acetonitrilo al 0,1% de ácido fórmico (acetonitrilo al 84%). Después de equilibrar la columna con el 95% de la solución A, se cargó la muestra desde el automuestreador a la columna Trap. La relación masa-carga de los fragmentos de los péptidos se recogió de la siguiente manera: se adquirieron un total de 20 patrones de fragmentos después de cada exploración completa. El archivo sin procesar de la prueba de espectrometría de masas se buscó utilizando el software Mascot 2.2 para la base de datos correspondiente.

Síntesis de péptidos

Los péptidos potenciales de inhibidores de la ECA identificados por LC-MS/MS se sintetizaron en GL Biochem (Shanghai, China). La pureza de los péptidos sintéticos se confirmó además por HPLC, que era superior al 95%.

Cinética de la inhibición de la ECA

El modelo de inhibición cinética del péptido G. biloba se probó utilizando el método de Lin et al. (2017). Brevemente, se dejaron reaccionar diferentes concentraciones de sustrato HHL (0,5, 1, 2 y 5 mM) con la ECA. El gráfico de Lineweaver-Burk se basó en el recíproco de la velocidad de reacción (1/v) y la concentración de sustrato (1/). Los interceptos en los ejes X e Y representaban los recíprocos de Km y Vmax, respectivamente.

Análisis de acoplamiento

Para ello, se descargó el archivo de estructura tridimensional de la proteína ACE (PDB ID: 1O8A) del Banco de Datos de Proteínas RCSB (PDB1). La estructura tridimensional de los péptidos de G. biloba se dibujó utilizando el software de simulación molecular Discovery Studio 3.5. Se realizó el hidroprocesamiento y se minimizó la energía mediante el programa CHARMM. Además, se retuvo el Zn2+ en el modelo ACE. El software DS 3.5 puntuó el resultado del docking según su propia función de puntuación, basada en las puntuaciones y la energía libre combinada de cada resultado. Entre todos los resultados, se seleccionó el mejor resultado de acoplamiento.

Análisis estadístico

Se realizó un ANOVA de una vía, seguido de las pruebas de rangos múltiples de Duncan utilizando el programa SPSS Statistics 20.0 (SPSS, Inc, Chicago, IL, Estados Unidos) se utilizó para el análisis de los datos con una diferencia de significación (P ≤ 0,05).

Resultados

Actividad inhibidora de la DH y de la ECA de las GPH

Como puede verse en la Figura 1A, la DH se prolongó con el tiempo durante todo el proceso de hidrólisis. La DH aumentó rápidamente antes del intervalo de 2 h, y después, la tasa de aumento disminuyó gradualmente con el tiempo. En general, la tasa de hidrólisis fue alta durante la 1 h inicial, que se redujo o se hizo constante después. Entre las cuatro proteasas, la alcalasa tuvo la mayor DH, que alcanzó el 14,7% después de 5 horas, seguida de la tripsina (8,91%) y la dispasa (6,91%). La DH más baja se observó en el caso de la flavorzima, que fue sólo del 3,23% a las 5 h. Estos resultados implican que la GPI fue escindida por las proteasas en diferentes sitios, lo que dio lugar a hidrolizados de proteínas con diferentes composiciones peptídicas.

En cuanto a la actividad inhibidora de la ECA de los cuatro hidrolizados de proteasa, la actividad aumentó con la DH a lo largo del período de tiempo. Como se muestra en la Figura 1B, las actividades inhibitorias de la alcalasa, la tripsina, la dispasa y la flavourzima a las 5 h fueron de 62,70, 39,81, 48,39 y 25,95%, respectivamente. Debido a sus diferentes sitios de escisión, se obtuvieron diferentes péptidos con diversas actividades inhibidoras de la ECA. Entre ellos, la actividad del hidrolizado alcalino era relativamente más fuerte, lo que indicaba que la proteasa alcalina puede producir eficazmente un hidrolizado con mayor efecto inhibidor de la ECA.

Actividad inhibidora de la ECA de las GPH y de la fracción de membrana

La actividad inhibidora de la ECA de las GPH y de las fracciones resultantes dependía significativamente del MW, como se muestra en las figuras 1C,D. A concentraciones de muestra de 1 mg/mL, la actividad inhibidora de la ECA aumentó gradualmente a medida que disminuía el MW de los componentes. La actividad de inhibición a 3-5 y 5-10 kDa fue de 44.94% (IC50 = 1.257 mg/mL), 44.04% (IC50 = 1.765 mg/mL), respectivamente. Posteriormente, la actividad aumentó gradualmente con los MW más bajos y alcanzó el nivel más alto (69,86%; IC50 = 0,224 mg/mL) a <1 kDa.

Purificación de péptidos de Ginkgo

La alcalasa se utiliza a menudo para la preparación de péptidos activos debido a su amplia especificidad y fuerte capacidad para degradar proteínas. A partir del tratamiento de ultrafiltración, se reveló que la actividad inhibidora de la ECA mejoraba con la disminución del MW del polipéptido. Por lo tanto, el péptido de la fracción <1 kDa se purificó aún más utilizando la columna Sephadex G-15. Como puede verse en la Figura 2A, Sephadex G-15 se dividió en tres componentes (A1, A2 y A3). Los tres componentes se recogieron y liofilizaron, y se midieron sus actividades inhibidoras de la ECA. Los resultados se muestran en la figura 2B. Las actividades inhibidoras de la ECA de los tres componentes (1 mg/mL) fueron de 64,08, 58,55 y 74,96%, respectivamente. Por lo tanto, se seleccionó el componente A3 más activo para la identificación estructural del siguiente paso.

Identificación de los péptidos de Ginkgo y síntesis de péptidos

Para identificar el péptido potencial inhibidor de la ECA, se analizó el componente A3 más activo mediante LC-MS/MS (Tabla suplementaria S1). Sobre esta base, se seleccionaron tres péptidos del componente A3 y sus secuencias de aminoácidos fueron Thr-Asn-Leu-Asp-Trp-Tyr (TNLDWY), Arg-Ala-Asp-Phe-Tyr (RADFY) y Arg-Val-Phe-Asp-Gly-Ala-Val (RVFDGAV) (Figura 3). Las secuencias identificadas de estos péptidos estaban compuestas por 5-7 residuos de aminoácidos. Para identificar la actividad inhibidora de la ECA de estas tres fracciones peptídicas, los péptidos se sintetizaron químicamente. Los péptidos sintetizados obtenidos se identificaron por espectrometría de masas (Figuras 4A-C). Los resultados mostraron que los valores IC50 de TNLDWY, RADFY y RVFDGAV eran de 1,932, 1,35 y 1,006 mM, respectivamente (Figura 4D).

Mecanismo inhibitorio de los péptidos de Ginkgo

El modo de inhibición del péptido de G. biloba se analizó según el gráfico de Lineweaver-Burk. Como puede verse en la Figura 5, cuando se añadió el péptido de Ginkgo TNLDWY, tanto la Vmax como la Km cambiaron, la Vmax aumentó con el aumento de la concentración del péptido; mientras que la Km no cambió significativamente con la concentración del péptido, lo que indicó que su patrón de inhibición puede ser un modo de inhibición no competitivo. En el caso de RADFY y RVFDGAV, la Vmax no cambió significativamente con la concentración; mientras que la Km aumentó con el aumento de la concentración del péptido, lo que indica que ambos péptidos son inhibidores competitivos, que pueden unirse a los sitios activos de la ECA, bloqueando así la unión de la ECA al sustrato e inhibiendo la actividad de la ECA.

Simulación de acoplamiento molecular entre péptidos y ECA

En este estudio se evaluó la interacción de tres péptidos con la ECA. Los resultados mostraron que todos los péptidos podían unirse bien a la ECA y formar un complejo estable, lo que indica su uso como potencial inhibidor de la ECA. La puntuación de la Energía de Interacción Cdocker se mostró en la Tabla 1. Las puntuaciones de las fracciones TNLDWY, RADFY y RVFDGAV fueron 102,995, 105,335 y 117,706, respectivamente. Los resultados del acoplamiento molecular se muestran en la figura 6 y en la tabla 2. La posición óptima de acoplamiento de TNLDWY puede formar seis enlaces de hidrógeno, entre ellos formó enlaces de hidrógeno con Ala 354, Tyr523 en el bolsillo activo S1, His353, His513 en el bolsillo activo S2, y residuos Zn2+ y se encontró unido de forma estable con todos ellos. Esto puede estar relacionado con la fuerte actividad inhibidora de la ECA del péptido. Se observó en la Figura 6B que RADFY puede formar siete enlaces de hidrógeno con residuos de aminoácidos, y enlaces de hidrógeno intermoleculares con los residuos Gln281, His353, His513 y Tyr520 en el bolsillo activo S2. La formación de estos enlaces de hidrógeno estabilizó en gran medida el complejo enzima-péptido. Además, RADFY formó un enlace iónico con Zn2+, fuerzas de conjugación con Val380, His383, Glu384, His387, Glu411, Lys511 y Tyr523, así como una fuerza de Van der Waals con el residuo aminoácido Trp356. Estas interacciones pueden provocar la deformación del ligando Zn2+ y la inactivación de la ECA. En comparación con TNLDWY y RADFY, RVFDGAV puede formar cuatro enlaces de hidrógeno con residuos de aminoácidos, que se conectaron de forma estable a ALA354, TYR523 en el bolsillo activo S1, y Glu162 en el bolsillo activo S1′. Sin embargo, el RVFDGAV podía formar enlaces iónicos con el Zn2+, lo que conducía directamente a la desactivación de las moléculas ACE. Además, formó un conjugado con los residuos de aminoácidos como Glu162, His353, Glu376, Val379, His387, Phe391, His410, Phe457 y Phe527 (Figura 6C).

Discusión

En los últimos años, los péptidos inhibidores de la ECA derivados de alimentos a partir de proteínas vegetales han atraído cada vez más la atención debido a sus menores efectos secundarios. En este estudio, se utilizaron la alcalasa, la dispasa, la tripsina y la flavorzima para hidrolizar la proteína de Ginkgo. La DH y la actividad inhibidora de la ECA del hidrolizado de proteína de Ginkgo obtenido por la hidrólisis de la alcalasa fueron las más altas. El proceso de hidrólisis tuvo lugar rápidamente durante la etapa inicial, lo que resultó en la hidrólisis de muchos enlaces peptídicos, luego, la tasa de hidrólisis se redujo debido a la reducción gradual de la disponibilidad de sustratos para la hidrólisis (Ketnawa et al., 2017; Hu et al., 2018; Wei et al., 2018). Estos hallazgos fueron consistentes con el informe anterior de hidrolizados de proteína de colza con una acción inhibidora eficaz de la ECA cuando se hidroliza con alcalasa (He et al., 2013).

La enzima convertidora de angiotensina es una dipeptidasa extracelular multifuncional presente en diferentes tejidos. La actividad inhibidora de la ECA disminuye la presión arterial mediante la reducción de la producción de angiotensina II y la reducción de la destrucción de las cininas (Zheng et al., 2017). La actividad inhibidora de la ECA del hidrolizado se relacionó con la distribución del peso molecular. Se utilizó la ultrafiltración para separar el hidrolizado de Ginkgo en cinco componentes. En el peso molecular <1 kDa, la actividad inhibidora de la ECA del hidrolizado de Ginkgo fue la más alta. Esta observación concuerda con estudios anteriores que informan de la mayor actividad de la ECA de los polipéptidos de bajo peso molecular (Wang et al., 2015; Ola et al., 2017). Además, Silvestre et al. (2012) confirmaron que el tratamiento de ultrafiltración puede retener péptidos (AAA) en la posición C-terminal para promover la actividad inhibidora de la ECA.

Para purificar aún más el péptido inhibidor de la ECA altamente activo, el componente de Ginkgo (<1 kDa) se separó mediante cromatografía de filtración en gel, y la secuencia de aminoácidos se identificó utilizando LC-MS/MS. Así, se obtuvieron tres nuevos péptidos inhibidores de la ECA: TNLDWY (1,932 mM), RADFY (1,35 mM) y RVFDGAV (1,006 mM) que mostraron una fuerte actividad inhibidora de la ECA. Según el informe de Hernández-Ledesma et al. (2011), la mayoría de los péptidos inhibidores de la ECA eran secuencias cortas que constaban de 2 a 12 aminoácidos. Además, la actividad del péptido inhibidor de la ECA estaba fuertemente relacionada con la presencia de su aminoácido C-terminal, aminoácido aromático y aminoácido hidrofóbico. Por ejemplo, la presencia del aminoácido aromático (Tyr, Phe y Trp) aumentó significativamente la actividad del péptido inhibidor de la ECA. Además, se sabe que Arg también desempeña un papel importante en el péptido inhibidor. Toopcham et al. (2017) demostraron que la actividad inhibidora del polipéptido se reducía significativamente tras la eliminación de Arg. Además, Liu et al. (2018) demostraron que un aminoácido como Leu en el péptido afectaba significativamente a la actividad inhibidora de la ECA independientemente de su posición en el C-terminal o en el N-terminal. Lee y Hur (2017) también informaron de resultados similares. Estos estudios informaron de los péptidos KPLL, VLAQYK y DLP de diferentes materiales proteicos con una apreciable actividad inhibidora de la ECA en presencia del aminoácido hidrofóbico (Leu). En nuestro estudio, Tyr se localizó en el C-terminal de TNLDWY y RADFY. Además, los dos péptidos de RADFY y RVFDGAV contenían Arg en el N-terminal, y el contenido de aminoácidos hidrofóbicos en los tres péptidos era mayor. Sobre todo, los fragmentos peptídicos se correspondían con las características estructurales de los péptidos inhibidores de la ECA.

El modo de inhibición de los péptidos inhibidores de la ECA se observó generalmente no competitivo, competitivo y mixto. En el caso de los péptidos cortos (2-12 aminoácidos), la mayoría de ellos eran inhibidores competitivos y se unían a la enzima ECA para impedir la unión del sustrato HHL. Un estudio similar realizado por Lin et al. (2017) demostró que los péptidos KYIPIQ y LPLPLL de la caseína Qula presentaban un modo de inhibición competitivo. Sin embargo, en el caso de los inhibidores no competitivos, se unen a sitios distintos del sitio de unión al sustrato de la enzima y, en última instancia, afectan a la unión del sustrato a la enzima. Se observaron patrones similares en el caso de péptidos inhibidores de origen alimentario, como el PFPGPIPN de la caseína Qula, y el péptido YLVR de la avellana (Lin et al., 2017; Liu et al., 2018). En este modo competitivo, la ECA, el sustrato y el péptido formaron un complejo enzima-sustrato-inhibidor, que impidió una mayor liberación del producto y dio lugar a una disminución de la Vmax (Barbana y Boye, 2011).

Estudiar el mecanismo de interacción molecular entre la ECA y los péptidos inhibidores es útil para el cribado y el diseño de nuevos péptidos inhibidores de la ECA. Sin embargo, no se dispone de suficiente información sobre las interacciones moleculares de los péptidos inhibidores. El acoplamiento molecular se basa en el «principio de la cerradura y la llave» de los ligandos y los receptores, simulando la interacción entre los ligandos de moléculas pequeñas y las biomacromoléculas del receptor. El modo de unión y la afinidad entre ellos permite el cribado virtual de fármacos. La ECA es una enzima carboxipéptida dependiente de Zn2+, en la que el Zn2+ es una parte importante del centro activo de la ECA (Pina y Roque, 2009). De acuerdo con los datos reportados previamente (Pan et al., 2012), los principales residuos de interacción en el sitio activo de la ECA se dividieron en tres bolsillos activos (S1, S2 y S1′). S1 (Ala354, Glu384 y Tyr523); S2 (Gln281, His353, Lys511, His513 y Tyr520); y S1′ (residuo Glu162). En el sitio activo de la ECA, dos histidinas (His383 e His387) junto con Glu 411 constituían un ligando de Zn2+. Se ha informado de que la inhibición de la actividad de la ECA inducida por péptidos puede lograrse mediante la combinación de complejos enzima-péptido con enlaces de hidrógeno (Fu et al., 2017). Además, la formación de fuerzas de van der Waals con residuos de aminoácidos como His353, Ala 354, Ser355, Glu384, His513 y Pro519, la interacción conjugada con Tyr360 y las interacciones no covalentes con Glu384, Arg522 también pueden contribuir a la estabilidad de los complejos enzima-péptido. La presencia de estas fuerzas hará que la estructura del complejo enzima-péptido sea más estable, más propicia para la inhibición de la actividad de la ECA, lo que puede ser la razón de la fuerte actividad inhibidora de la ECA de TNLDWY, RADFY y RVFDGAV.

Conclusión

En este estudio, se utilizaron semillas de G. biloba para preparar potenciales péptidos inhibidores de la ECA. Los GPHs preparados a partir de diferentes proteasas mostraron una actividad inhibidora de la ECA diversa in vitro. Las mayores actividades inhibidoras de la ECA in vitro se observaron en los GPHs preparados a partir de la alcalasa. Los componentes obtenidos por ultrafiltración con alcalasa mostraron que los péptidos de menor MW conferían una mayor actividad inhibidora de la ECA. Se obtuvieron tres péptidos inhibidores potenciales de la ECA (TNLDWY, RADFY y RVFDGAV) de la fracción peptídica (<1 kDa) por LC-MS/MS. RVFDGAV mostró la mayor actividad inhibidora de la ECA con un valor IC50 de 1,006 mM y apareció como un inhibidor competitivo. Los resultados del acoplamiento molecular indicaron que los péptidos podían unirse firmemente a la ECA e interactuar además con residuos de aminoácidos en el sitio activo de la ECA. Nuestros resultados indicaron que los péptidos obtenidos por hidrólisis enzimática de la alcalasa mostraron una eficaz actividad inhibidora de la ECA in vitro, lo que los convierte en potenciales candidatos para el desarrollo de alimentos funcionales o fármacos antihipertensivos en el futuro.

Contribuciones de los autores

F-FM, HW, C-KW y KT participaron en el diseño del proyecto, realizaron la mayoría de los experimentos y redactaron el manuscrito. Z-JW y LJ contribuido al diseño experimental, la preparación del manuscrito, y la presentación. Todos los autores participaron en la redacción del manuscrito y/o lo revisaron críticamente por su importante contenido intelectual.

Financiación

Este estudio fue apoyado por los principales proyectos de ciencia y tecnología de la provincia de Anhui (17030701024, 17030701058 y 17030701028) y el proyecto clave de investigación y desarrollo de la provincia de Anhui (1704g07020110 y 1804b06020347).

Declaración de conflicto de intereses

HW fue empleado de Anhui Habopharmqnceutical Co, Ltd. Z-JW era empleado de Anhui Qiangwang Seasoning Food Co., Ltd.

Los autores restantes declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un potencial conflicto de intereses.

Material complementario

El material complementario de este artículo puede encontrarse en línea en: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2018.01579/full#supplementary-material

Notas al pie

1. ^ http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do