Fronteras en Bioingeniería y Biotecnología

Introducción

Las albúminas séricas son proteínas comúnmente utilizadas en el biodiagnóstico y como modelo en la investigación de biointerfaces (Rosi y Mirkin, 2005; Singh et al, 2005; Arcot et al., 2015). Entre ellas, la albúmina de suero bovino (BSA) es la más barata y una proteína ampliamente utilizada como agente de bloqueo en las pruebas ELISA (Maingonnat et al., 1999). En los diagnósticos en papel, la BSA (Huang et al., 2018) aumenta selectivamente la hidrofobicidad del papel para mejorar los biofluidos y el flujo de elución al disminuir la absorción de líquidos. La BSA protege y aumenta la vida útil de las biomoléculas funcionales secadas en papel. La funcionalidad y la longevidad de la inmunoglobina G y la inmunoglobina M secadas en superficies tratadas con BSA pueden aumentar en un orden de magnitud (van Remoortere et al., 2001). La BSA también evita la adsorción inespecífica de las proteínas de los analitos para el análisis cuantitativo.

Múltiples artículos han informado ampliamente sobre el fenómeno de sorción de las moléculas de BSA en diferentes interfaces como el oro (Dennison et al., 2017), la mica (Fitzpatrick et al., 1992), el silicio (Jachimska et al., 2016; Givens et al., 2017) y la celulosa (Mohan et al., 2014; Lombardo et al., 2017). La conformación de la molécula de BSA adsorbida y la topología de la capa formada se ven muy afectadas por el pH, la fuerza iónica y la temperatura. Las moléculas de BSA conservan su estructura nativa entre pH 4,0 y 8,0. Por debajo de pH 4,0 y por encima de 8,0, las moléculas de BSA cambian su conformación de plegado que difiere de su estructura nativa (Su et al., 1998a; Barbosa et al., 2010; Phan et al., 2015). El punto isoeléctrico de la BSA se encuentra a un pH de 4,5. A este pH, la carga superficial neta se convierte en cero y las moléculas de BSA se agregan. El aumento del pH aumenta la carga de la BSA y la repulsión electrostática dominante estabiliza las moléculas de BSA y evita la agregación (Li et al., 2008).

A pesar de estar entre las proteínas más estudiadas, siguen existiendo múltiples interrogantes sobre el efecto que el pH y la fuerza iónica tienen sobre la conformación de la BSA tras la adsorción. En este contexto, el concepto de cobertura superficial, definido únicamente por la fracción superficial o la densidad de peso, carece de claridad. Es necesario comprender mejor las variables que definen la interfaz sólido-líquido de la BSA para diseñar dispositivos robustos de biodiagnóstico.

Las moléculas de albúmina de suero bovino se adsorben en una interfaz formando una capa con un espesor en la escala nanométrica. Unos pocos métodos de caracterización, como la reflectividad (Su et al., 1998b, 2016; Raghuwanshi et al., 2017a, b), el elipsómetro, el microscopio de fuerza atómica (AFM), la resonancia de plasmón superficial (SPR) y la microbalanza de cristal de cuarzo con disipación (QCM-D), pueden medir el espesor de la capa de proteína adsorbida en la escala nanométrica requerida. En particular, la QCM-D puede monitorizar cinéticamente el proceso de sorción de biomoléculas midiendo la masa de proteína adsorbida en una interfaz en nanogramos (Kristensen et al., 2013; Luan et al., 2017). La QCM-D permite controlar la temperatura, la fuerza iónica y el entorno de pH. El modo de disipación de QCM revela la rigidez de las capas de proteínas adsorbidas.

En este estudio, se describe un comportamiento reversible que responde al pH de las moléculas de BSA adsorbidas en la interfaz oro-salina. La capa de BSA adsorbida se comporta como una esponja sensible al pH donde las moléculas de agua se adsorben y desorben dependiendo del pH circundante entre 4 y 8. Este trabajo monitorea y cuantifica el fenómeno de sorción de agua en la capa tipo esponja de BSA y dilucida los mecanismos involucrados a diferentes pH y fuerza iónica. Nuestro objetivo es describir la cobertura de BSA en la interfaz sólido-líquido en términos de número de moléculas y peso/espesor de la capa. Se trata de aclarar el concepto de cobertura de la superficie de la biomolécula y de dilucidar el comportamiento dinámico de las moléculas de BSA adsorbidas en el contexto del biodiagnóstico.

Materiales y experimentos

Materiales

El polvo liofilizado de albúmina de suero bovino (97%) y la sal de cloruro de sodio (NaCl) (99,5%) se adquirieron en Sigma Aldrich (Castle Hill, NSW, Australia). El ácido clorhídrico (HCl) y el hidróxido de sodio (NaOH) se compraron a Merck Ltd. Todos los productos químicos son de grado analítico y se utilizaron sin ninguna purificación.

Mediciones de QCM-D

Las mediciones de microbalanza de cristal de cuarzo con disipación se realizaron en un instrumento E4-QCM-D de Biolin Scientific Ltd. Se utilizaron sensores de cristal de cuarzo recubiertos de oro después de limpiarlos en una solución de H2O2:NH3:H2O (1:5:5) durante 15 minutos y seguidos de una limpieza con UV-Ozona durante 10 minutos.

Los sensores de oro se colocaron en módulos de celdas líquidas. Se disolvió 1 mg/mL de BSA en la solución salina (0,9% de NaCl) y el pH de la solución se ajustó a pH 7,0 y 4,5. Por separado, se ajustó el pH de la solución salina a 7,0 y 4,5. Las soluciones preparadas se hicieron pasar por los módulos de células líquidas mediante una bomba peristáltica. Los cambios en la frecuencia de resonancia del sensor de cuarzo (F) y la disipación (D) con respecto a la frecuencia fundamental de 5 MHz y a seis sobretonos impares diferentes (1, 3, 5, 7, 9 y 13) se monitorizaron simultáneamente.

Primero se bombeó una solución salina en la célula líquida y se dejó que se equilibrara para generar una línea de base estable. A continuación, se hizo pasar BSA en solución salina a través de la celda, y se permitió que las moléculas de BSA se adsorbieran en la interfaz de oro. A continuación, se bombeó solución salina para eliminar las moléculas de BSA no adheridas. Los ciclos de enjuague de las soluciones salinas a diferentes pH y agua fueron entonces los siguientes:

Las variaciones obtenidas en la frecuencia de resonancia ΔF y la disipación ΔD se ajustaron mediante el modelo de Sauerbrey utilizando el software Dfind.

Mediciones DLS

La dispersión dinámica de la luz (DLS) en la BSA dispersada en la solución salina a diferentes pH (4,5 y 7,0) se midió en el analizador de tamaño de partículas DLS (Brookhaven Nanobrook Omni). Se utilizó una fuente de láser semiconductor rojo de 40 mW (640 nm) con control de temperatura. Las mediciones se realizaron tres veces y se promediaron. Todas las mediciones se realizaron a temperatura ambiente (22°C).

Mediciones del ángulo de contacto

El ángulo de contacto en el oro y la BSA adsorbida a diferentes pH en una interfaz de oro se midieron utilizando una configuración OCA 35 DataPhysics Instruments GmbH, Alemania. Las mediciones se llevaron a cabo directamente en la superficie del sensor que se sacó del montaje QCM después de la medición. Todas las mediciones se realizaron a temperatura ambiente (22°C). Se realizaron un mínimo de cinco mediciones del ángulo de contacto en la superficie del sensor y se promediaron.

Microscopio de fuerza atómica (AFM)

Las mediciones de microscopía de fuerza atómica se realizaron en modo de golpeo con un AFM JPK Nanowizard III. Los voladizos (AC160TS-R3) seleccionados para la obtención de imágenes tenían una frecuencia nominal de 300 kHz y una constante de resorte de 26 N/m. La toma de imágenes se realizó en la interfaz de oro desnudo y en la capa de BSA adsorbida a pH 4,5 en la interfaz de oro. Las imágenes se tomaron directamente en la superficie del sensor que se sacó de la configuración de QCM después de la medición. Todas las mediciones se realizaron a temperatura ambiente (22°C).

Resultados

Se estudia un fenómeno de sorción de agua reversible que responde al pH de las moléculas de BSA adsorbidas en la interfaz sólido-líquido mediante QCM-D con ciclos de enjuague de solución salina a pH 7,0 y 4,5. Se seleccionó el oro como interfaz sólida ya que su hidrofobicidad dirige la adsorción de BSA (Lori y Hanawa, 2004; Phan et al., 2015; Ozboyaci et al., 2016). Las capas de BSA adsorbidas a diferentes valores de pH se enjuagan con ciclos alternos de soluciones salinas a pH 4,5 y 7,0. Además, se realizó un enjuague con agua pura Milli-Q para evaluar el efecto que la fuerza iónica tiene sobre la capa de BSA adsorbida.

La figura 1 (superior) muestra el cambio en la frecuencia (F5 y F7) para las moléculas de BSA adsorbidas a un pH de 7,0 a partir de la solución de BSA/salina seguida de un enjuague con la solución salina original (pH 7). El siguiente ciclo de enjuague se realizó con la solución salina a pH 4,5. A continuación, se realizaron ciclos alternos de soluciones salinas a pH 4,5 y 7.

En la Figura 1, tras una línea de base inicial estable, se observó una disminución repentina de F que indica la adsorción de moléculas de BSA en la interfaz oro-líquido. La F disminuyó hasta ΔF = -35,5 y se estabilizó. Tras el enjuague con solución salina (pH 7), el F aumentó de ΔF = -35,5 a ΔF = -34,0, lo que demuestra la eliminación de las moléculas de BSA no adsorbidas de la superficie. Tras el enjuague con solución salina (pH 4,5), el F aumentó aún más a ΔF = -30,0, lo que revela una disminución adicional de la masa de la superficie del sensor. Sorprendentemente, los ciclos posteriores de enjuague con solución salina (pH 7,0) disminuyen la F a ΔF = -34,0, lo que significa un aumento de la masa en la superficie del sensor debido a la absorción de moléculas de agua en la capa de BSA. Los siguientes ciclos de enjuague con solución salina siguen el mismo cambio cíclico de masa en la interfaz del oro.

En el segundo experimento, similar al primero, la adsorción de moléculas de BSA a pH 4,5 fue seguida de ciclos de enjuague con solución salina a diferentes pH (Figura 1: Parte inferior). Las moléculas de BSA adsorbidas corresponden a la disminución de F a ΔF = -38,5. El enjuague con solución salina (pH 4,5) elimina la BSA no adsorbida (ΔF = -38,0).

El siguiente enjuague con solución salina (pH 7,0) aumenta aún más la masa de la capa en la superficie del oro, lo que corresponde a la disminución de F a ΔF = -43. El aumento de la masa se debe a la absorción de moléculas de agua en la capa de BSA. Posteriormente, el enjuague con solución salina (pH 4,5) desorbe las moléculas de agua y devuelve el valor de F a ΔF = -37. Cada ciclo de enjuague adsorbe y desorbe la misma cantidad de moléculas de agua.

En el mismo experimento, se estudió el efecto de la fuerza iónica sobre la capa de BSA adsorbida, enjuagando la capa con agua pura. La figura 1 muestra la adsorción de BSA a pH 7,0 y 4,5 seguida de ciclos de enjuague con solución salina a diferentes pH y con agua pura Milli-Q.

En ambos casos, el enjuague con agua aumenta el valor en ΔF = -29,2 (BSA adsorbida a pH 4,5) y -26,5 (BSA adsorbida a pH 7,0). Esto indica que el enjuague con agua disminuye aún más la masa, lo que corresponde a una mayor desorción de las moléculas de agua de la interfaz. Cada ciclo de enjuague mantiene el mismo comportamiento en el cambio de masa que se debe a la sorción de agua en la capa de BSA.

Es interesante que en todos los experimentos, los ciclos de enjuague con solución salina alternados a pH 4,5 y 7,0 muestran la sorción reversible de moléculas de agua dentro de la capa de BSA adsorbida. El enjuague de la capa de BSA con solución salina a pH 7,0 adsorbe moléculas de agua dentro de la estructura de la capa de BSA, lo que aumenta la masa de la interfaz sólido-líquido. Por el contrario, el enjuague de la capa de BSA con solución salina a pH 4,5 desorbe las moléculas de agua de la capa de BSA, lo que reduce la masa de la interfaz. La sorción de agua totalmente reversible medida indica que las moléculas de BSA no se desorben durante el enjuague y su cobertura superficial permanece idéntica; sólo varía el número de moléculas de agua en la interfase.

El fenómeno de sorción de agua tras el enjuague con solución salina (a diferentes pH) se produce sólo debido a la capa de BSA adsorbida y se confirma mediante un experimento de enjuague con solución salina por separado en el sensor de oro desnudo (Material suplementario S1). Una línea de base estable en la frecuencia del sensor de oro desnudo se mantiene con la solución salina (a pH 4,5). Posteriormente, la interfaz de oro se enjuagó con un ciclo de enjuague salino alternativo de pH 7,0 y 4,5 (Material suplementario S1). Los resultados muestran claramente que el enjuague salino alternativo a diferentes pH no tiene ningún efecto sobre la frecuencia del sensor de oro. Por lo tanto, sólo la capa de BSA adsorbida en el oro muestra el cambio en la frecuencia en los ciclos de enjuague salino a diferentes valores de pH.

La masa adsorbida, la cobertura de la superficie y el espesor de la capa de BSA adsorbida se extraen mediante el ajuste del modelo de Sauerbrey a los datos de QCM. El modelo se utiliza para ajustar una capa rígida en la que el valor de la disipación es inferior a 2, como se observa en todos nuestros experimentos (Material Suplementario S2). La ecuación de Sauerbrey viene dada por Δm=-CΔfn, donde, C = 17,7 ng/Hz.cm2 es constante para el cristal de cuarzo recubierto de oro de 5 MHz, n es el sobretono, Δm es la masa adsorbida y Δf es el cambio de frecuencia.

Las moléculas de BSA se adsorbieron hasta una cobertura de masa de 6,3 mg/m2 (espesor 5,6 nm) a pH 7,0 (Figura 2A). El enjuague de la capa de BSA preadsorbida con solución salina (pH 4,5) disminuyó la cobertura de masa a 5,6 mg/m2 y su espesor a 4,9 nm (Tabla 1), lo que se debe a la liberación de moléculas de agua de la estructura de la capa de BSA adsorbida. Un nuevo enjuague con solución salina (a pH 7,0) reabsorbe las moléculas de agua en la misma cantidad. La diferencia de cambio de masa es Δm = 0,7 mg/m2.

De forma similar, en la Figura 2B, el enjuague de la capa de BSA preadsorbida a pH 4,5 con solución salina (a pH 7,0) aumenta la masa adsorbida de 6,4 mg/m2 a 7,4 mg/m2 y el grosor de 6,2 a 6,9 nm; esto se debe a la absorción de moléculas de agua en la capa de BSA. El ciclo de enjuague de la solución salina a diferentes valores de pH mantuvo la diferencia de cambio de masa de Δm = 1,0 mg/m2, que es 1,4 veces mayor que el cambio de masa a pH 7,0 (0,7 mg/m2).

El número medio de moléculas de agua adsorbidas/desorbidas en la capa de BSA durante el ciclo de enjuague de la solución salina se calcula a partir de la diferencia de masa adsorbida a diferentes pH (Material suplementario S3). La capa de BSA adsorbida a pH 4,5 adsorbe/desorbe 3,3 × 1019 moléculas de agua durante los ciclos de enjuague, lo que representa 570 moléculas de agua/molécula de BSA (Tabla 1). Sin embargo, la capa de BSA adsorbida a pH 7,0, adsorbe/desorbe 2,3 × 1019 moléculas de agua, o 450 moléculas de agua/molécula de BSA, durante el ciclo de enjuague con solución salina reversible.

Las mediciones de dispersión dinámica de la luz (DLS) aclaran el estado agregado y no agregado de la BSA en solución salina a pH 4,5 y pH 7,0 (Figura 3). A pH 4,5, la DLS revela que las moléculas de BSA se agregan y muestran múltiples distribuciones de tamaño: 5 nm, 10 nm, 20 nm y 50 nm. Sin embargo, a pH 7,0, las moléculas de BSA no se agregan, debido a las repulsiones electrostáticas, y tienen una distribución de tamaños de 5 y 10 nm. El tamaño de 5 y 10 nm de la BSA hidratada es comparable al tamaño y la forma de las moléculas individuales de BSA (14 nm × 4 nm × 4 nm) (Anderegg et al., 1955; Wright y Thompson, 1975).

Las imágenes del microscopio de fuerza atómica confirman la adsorción de la molécula de BSA en la interfaz del oro (Figura 4). Estas imágenes demuestran las diferencias en la morfología de la superficie del oro desnudo (Figuras 4a,b) y de la BSA adsorbida en la interfaz del oro a pH 4,5 (Figuras 4c,d). Al comparar las imágenes ampliadas del oro desnudo (Figura 4b) y de la superficie absorbida por la BSA (Figura 4d) se aprecian las diferencias entre las superficies. Aunque ambas superficies tienen partículas que las forman, la definición y, por lo tanto, el material visualizado es diferente. Las partículas de la superficie de oro desnudo están más definidas (por ejemplo, límites más nítidos entre las formas), lo que indica un material más duro en comparación con la superficie recubierta de BSA. El oro recubierto de BSA muestra la presencia de agregados adicionales de moléculas de BSA. La imagen de AFM ampliada del oro recubierto de BSA (Figura 4d) muestra que la dimensión lateral de las moléculas de BSA agregadas varía entre 30 y 100 nm con una altura en el rango de 5-15 nm.

Se midió el ángulo de contacto formado por las gotas de agua en dos superficies: el oro y la BSA adsorbida en el oro para aclarar la humectabilidad (Figura 5). El sensor de oro es hidrófilo con un ángulo de contacto de 66°. Sin embargo, la capa de BSA adsorbida a pH 4,5 se vuelve más hidrofílica, ya que el ángulo de contacto con el agua disminuyó a 60°, que se redujo aún más a 55° para la capa de BSA adsorbida a pH 7,0. Se informó de una observación similar para las capas de BSA adsorbidas en una superficie de silicio a medida que el ángulo de contacto con el agua disminuía de 57° (a pH 4,5) a 54° (a pH 7,0) (Jachimska et al., 2016). El cambio en el ángulo de contacto y el grosor de la capa para la BSA adsorbida a diferentes pH indica diferencias estructurales y topográficas durante el proceso de adsorción en la interfaz del oro.

Discusión

El punto isoeléctrico de la BSA se encuentra entre pH 4,5-4,8; es el pH en el que la carga neta de la molécula se hace cero. Cerca del punto isoeléctrico, las moléculas de BSA tienen menos repulsión electrostática entre moléculas. La elevada fuerza iónica de la solución salina (0,15 M) también desempeña un papel en el cribado de las cargas y en la obstaculización de las interacciones electrostáticas. Por lo tanto, las moléculas de BSA se agregan en la suspensión de BSA/solución salina. Las mediciones de DLS (Figura 3A) confirman la presencia de agregados de BSA de tamaños de hasta 60 nm en la suspensión de BSA/salina a pH 4,5.

Durante la adsorción de BSA (a pH 4,5) en la interfaz de oro, no se espera ninguna atracción electrostática de BSA hacia la interfaz de oro. Sin embargo, una débil carga positiva de la proteína BSA globular puede proporcionar una deriva suficiente para la adsorción en una interfaz (Su et al., 1998a; Jachimska et al., 2016). Múltiples artículos han informado previamente de que la adsorción de la BSA y de proteínas similares cerca del punto isoeléctrico está impulsada por interacciones hidrofóbicas que superan las interacciones electrostáticas (Uyen et al., 1990; Tilton et al., 1991; Figueira y Jones, 2008; Norde, 2008; Jeyachandran et al., 2009; Rabe et al., 2011; Huang et al., 2017; Xu et al., 2018; Attwood et al., 2019). Las mediciones del ángulo de contacto (Figura 5) muestran que la interfaz de oro desnudo es menos hidrofóbica, y que la albúmina se une al oro mediante interacciones hidrofóbicas (Norde y Giacomelli, 2000; Figueira y Jones, 2008). Dado que las repulsiones entre las moléculas de BSA están tamizadas, las moléculas de BSA hidratadas se adsorben en grandes cantidades (6,4 mg/m2) como agregados y con múltiples puntos de contacto en la interfaz de oro (Figura 6A). La imagen de AFM (Figuras 4c,d) confirma la adsorción y agregación de las moléculas de BSA en la interfaz de oro. Las imágenes de AFM revelan que la dimensión lateral de los agregados oscila entre 30 y 100 nm con la altura distribuida entre 5 y 15 nm. Esto confirma que las moléculas de BSA se adsorben como una combinación de conformaciones planas y de pie.

A pH 7,0, las moléculas de BSA están cargadas negativamente. Esto crea una repulsión electrostática entre las moléculas de BSA que dificulta su aglomeración en la solución. Las mediciones de DLS muestran la distribución de moléculas de BSA no aglomeradas de tamaño 5 y 10 nm (Figura 3B). Estos tamaños son comparables con las dimensiones de las moléculas individuales de BSA (14 nm × 4 nm × 4 nm) (Anderegg et al., 1955; Wright y Thompson, 1975). Durante la adsorción de la BSA en el oro, una combinación de repulsión electrostática e interacciones hidrofóbicas forma una capa de BSA en la interfaz. La fuerte repulsión lateral entre las moléculas de BSA adsorbidas reduce la capacidad de adsorción de la BSA (5,6 mg/m2) en la interfaz. Por lo tanto, las moléculas de BSA se adsorben como moléculas individuales (no agregadas) y forman una monocapa en la interfaz de oro (Figura 6A).

En los experimentos de QCM-D (Figura 1), las moléculas de BSA prehidratadas se adsorben en la interfaz. Tras un enjuague salino alternativo a diferentes pH, la capa de BSA adsorbe/desorbe más moléculas de agua. La BSA adsorbida a pH 4,5 atrapa y libera más moléculas de agua (1,0 mg/m2) en comparación con las moléculas de BSA adsorbidas a pH 7,0 (0,7 mg/m2). La razón es que la cantidad de BSA adsorbida a pH 4,5 (6,4 mg/m2) es mayor que a pH 7,0 (5,6 mg/m2).

La masa seca calculada (no hidratada) de las moléculas de BSA adsorbidas para la cobertura completa de la superficie del sensor de oro es de aproximadamente 2 mg/m2 (Material suplementario S3). La masa seca calculada es comparable con la publicada en la literatura (Jachimska et al., 2016). Cuando una molécula de BSA seca se hidrata, sus grupos hidrofílicos se unen al agua rápidamente. La unión se debe a la estructura dipolar del agua que interactúa con los grupos polares de la BSA. En la BSA hidratada, algunas moléculas de agua se unen firmemente, mientras que otras moléculas de agua se unen de forma suelta o simplemente quedan atrapadas entre la estructura de bucle de la BSA. La cantidad de agua que hidrata la capa de BSA aumenta la fracción de masa adsorbida en la interfaz. En el ciclo de enjuague salino a diferentes valores de pH se produce una redistribución de cargas en la capa de BSA adsorbida. Esta redistribución de la carga crea un gradiente entre la capa de BSA adsorbida y la solución en bruto. El gradiente actúa como fuerza motriz para atrapar y liberar las moléculas de agua poco unidas de la capa de BSA.

El grosor de la capa de BSA se evalúa ajustando el modelo de Sauerbrey a los datos de QCM-D (Figura 2). La capa de BSA hidratada adsorbida a pH 4,5 y enjuagada con solución salina (pH 7,0) da el mayor espesor de 6,9 nm (Figura 6B). La gran cantidad de moléculas de BSA adsorbidas (6,4 mg/m2) atrapa muchas moléculas de agua que hinchan la capa de BSA. El enjuague de la misma capa con la solución salina (pH 4,5) reduce el espesor de la capa a 6,4 nm, lo que se debe a la liberación de moléculas de agua de la capa. Se observa un fenómeno similar para las moléculas de BSA adsorbidas a pH 7,0. Sin embargo, el grosor de la capa de BSA es más fino que el de la capa de BSA adsorbida a pH 4,5 (Figura 6B).

Además, la capa de BSA adsorbida en ambos valores de pH permanece rígida e irreversiblemente adherida durante los ciclos de enjuague salino. Sólo se produce la sorción de moléculas de agua durante la variación del pH. La rigidez e irreversibilidad de la BSA adsorbida se debe al gran tamaño y al elevado peso molecular de la BSA. La molécula de BSA forma una multitud de puntos de contacto en la interfaz oro-líquido mediante interacciones electrostáticas e hidrofóbicas que impiden la desorción de las moléculas de BSA de la interfaz.

La capa de BSA no se desprende de la interfaz de oro incluso con cambios en la fuerza iónica de la solución (enjuague con agua desionizada). El enjuague con agua sólo desorbe más moléculas de agua de la capa de BSA y la masa en la superficie del sensor disminuye aún más (Figura 2). El cambio de la fuerza iónica de la BSA hidratada con agua pura libera más moléculas de agua de la capa. La capa de BSA se reduce a un grosor de 4,8 nm (cuando se adsorbe a pH 4,5) y de 4,3 nm (cuando se adsorbe a pH 7,0), como se muestra en la Figura 6B. Los continuos ciclos de enjuague con solución salina producen el mismo fenómeno reversible de sorción de agua.

Conclusión

La albúmina de suero bovino en solución salina (0,9% de NaCl) fue adsorbida en la interfaz oro-líquido a pH 7,0 y 4,5. El proceso dinámico se midió mediante QCM-D y se confirmó mediante AFM, DLS y mediciones del ángulo de contacto. Se observa un fenómeno de sorción de agua reversible, rápido y dependiente del pH para la capa de BSA adsorbida al realizar ciclos de enjuague de solución salina a pH 4,5 y 7,0. Las moléculas de agua hidratan la capa de BSA a pH 7,0 y la deshidratan a pH 4,5. La capa de BSA adsorbida a pH 4,5 es hidratada por 1,4 veces más moléculas de agua que la capa de BSA adsorbida a pH 7,0. Este fenómeno se explica por las diferentes conformaciones adoptadas por las moléculas de BSA adsorbidas a diferentes pH. Cerca del punto isoeléctrico a pH 4,5, las moléculas de BSA se neutralizan y se adsorben como agregados en grandes cantidades: 6,4 mg/m2. A pH 7,0, las moléculas de BSA se cargan (repulsión electrostática) y se adsorben como una capa de moléculas individuales a 5,6 mg/m2. La capa de moléculas de BSA agregadas (a pH 4,5) adsorbidas en la interfaz del oro atrapa más moléculas de agua (570 moléculas de agua/BSA) que la capa de moléculas individuales de BSA (a pH 7,0), que retienen 450 moléculas de agua/BSA. El cambio de la fuerza iónica mediante el enjuague de la capa de BSA con agua pura sólo desorbe más agua de la estructura de la capa adsorbida. En todos los casos, la capa de BSA es rígida y se adsorbe de forma irreversible en la interfaz del oro y sólo las moléculas de agua se adsorben/desorben durante el ciclo de enjuague. El fenómeno observado es importante para la comprensión fundamental y para diseñar nuevos dispositivos de biodiagnóstico y sensores robustos.

Declaración de disponibilidad de datos

Los datos brutos que apoyan las conclusiones de este artículo serán puestos a disposición de cualquier investigador cualificado por los autores, sin reservas indebidas.

Contribuciones de los autores

VR, CB y BY realizaron los experimentos. VR y GG realizaron el análisis de los datos y redactaron el manuscrito.

Financiación

Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Investigación Australiano (ARC), Australian paper, Norske Skog, Orora y Visy a través de la subvención IH170100020 del Industry Transformation Research Hub.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un potencial conflicto de intereses.

Material complementario