Fronteras en Ciencia de las Plantas

Introducción

Los estreses abióticos reducen drásticamente el rendimiento de los cultivos provocando enormes pérdidas económicas y una amenaza para la seguridad alimentaria (Boyer, 1982; Bray et al., 2000; Cramer et al., 2011), un problema que probablemente se verá agravado por el cambio climático (Mittler y Blumwald, 2010; Lobell et al., 2011; Lesk et al., 2016). Al mismo tiempo, la población humana mundial no deja de crecer; de los 7.000 millones que había a finales de 2011, se espera que supere los 9.000 millones de personas en 2050 (Naciones Unidas, Departamento de Asuntos Económicos y Sociales, División de Población, 2011). En consecuencia, se espera que la demanda de producción de cultivos a nivel mundial se duplique para 2050 (Tilman et al., 2011). Sin embargo, la mayor parte de las nuevas tierras con potencial para la agricultura están situadas en entornos difíciles, como las tierras áridas y los desiertos, que cubren alrededor del 41% de la superficie terrestre mundial (Evaluación de los Ecosistemas del Milenio, 2005). Por lo tanto, la mejora del rendimiento de los cultivos bajo múltiples estreses es vital para evitar pérdidas en los lugares donde se cultivan actualmente y para cultivarlos en tierras más marginales.

La planta modelo, Arabidopsis thaliana, ha proporcionado gran parte de nuestra comprensión de las respuestas moleculares de las plantas al estrés. Sin embargo, Arabidopsis es una planta sensible al estrés y, por lo tanto, la búsqueda de nuevos mecanismos y genes de tolerancia al estrés ha llevado a un creciente interés en las plantas naturalmente tolerantes al estrés nativas de entornos extremos, las llamadas «extremófitas» (John y Spangenberg, 2005; Amtmann, 2009; Dassanayake et al., 2009; Smaoui et al., 2011; Gechev et al., 2012; Oh et al., 2012; Bressan et al., 2013; Cheeseman, 2014; Flowers et al., 2015; Zhu et al., 2015). Una estrategia exitosa ha sido el estudio de parientes extremófilos de Arabidopsis (Brassicaceae) como el hiperacumulador de metales Arabidopsis halleri (Hanikenne et al., 2008), y las halófitas, Schrenkiella parvula (antes Thellungiella parvula) y Eutrema salsugineum (antes Thellungiella salsuginea o Thellungiella halophila) (Volkov et al., 2003; Inan et al., 2004; Orsini et al., 2010; Koch y German, 2013). Además de ser tolerante a la sal (por ejemplo, Inan et al., 2004; Taji et al., 2004; Kant et al., 2006), E. salsugineum también es tolerante al nitrógeno bajo del suelo (Kant et al., 2008), a los niveles altos de boro (Lamdan et al., 2012), bajos niveles de fosfato (Velasco et al., 2016), estrés térmico (Higashi et al., 2013), y muestra una tolerancia al estrés por frío y congelación similar a la de Arabidopsis (Griffith et al., 2007; Lee et al., 2012). Una serie de factores contribuyen a la tolerancia al estrés de E. salsugineum, incluyendo la regulación constitutiva al alza y a la baja de los genes y metabolitos de tolerancia al estrés, lo que sugiere que E. salsugineum está «preparada» para el estrés, la expansión del número de copias de genes relacionados con el transporte de iones, la subfuncionalización y neofuncionalización de genes duplicados, el uso sesgado de codones que facilita una traducción más eficiente de las proteínas relacionadas con el transporte de iones, y la posible participación de genes específicos de linaje (Taji et al., 2004; Gong et al., 2005; Kant et al., 2006, 2008; Lugan et al., 2010; Oh et al., 2010, 2012, 2014; Sun et al., 2010; Dassanayake et al., 2011; Wu et al., 2012; Champigny et al., 2013; Kazachkova et al., 2013; Yang et al., 2013).

Los diversos estreses a los que una extremófita muestra tolerancia reflejan la combinación de estreses característica de cada hábitat específico. Por lo tanto, para obtener una comprensión completa de cómo las plantas hacen frente a múltiples estreses, es vital investigar las extremófitas de una serie de hábitats diferentes. El desierto del Néguev, en el sur de Israel, que forma parte del cinturón de desiertos del Sáhara y de Arabia, se caracteriza por una combinación de temperaturas extremas, baja disponibilidad de agua y nutrientes, y altos niveles de salinidad y radiación, y se considera una zona «árida» con una precipitación anual de entre 25 y 200 mm que es impredecible con una alta variación espacial y temporal (Gutterman, 2002; Ward, 2009). Las temperaturas pueden variar tanto diaria como estacionalmente entre una máxima y una mínima diarias absolutas de 46,8 y -3,6°C, respectivamente1. Estas condiciones extremas, junto con las «islas de salinidad del suelo», han dado lugar a adaptaciones morfológicas, fisiológicas y genéticas especiales que permiten a las plantas prosperar. Por lo tanto, el desierto del Néguev es una probable caja del tesoro biogenético de genes relacionados con las adaptaciones al estrés abiótico.

Hemos examinado varias de las 25 especies de Brassicaceae extremófitas que habitan en el Néguev en busca de tolerancia a múltiples estreses abióticos. Una de ellas es Anastatica hierochuntica (verdadera rosa de Jericó), una planta anual de invierno del desierto saharo-árabe descrita por primera vez por Linnaei (1753) que coloniza las zonas más altas y secas de los wadies o runnels (Friedman y Stein, 1980; Friedman et al., 1981). A. hierochuntica es bien conocida por su mecanismo de dispersión de semillas por higromas, mediante el cual la planta muere, se seca y la reducción de la presión de turgencia hace que las ramas se enrosquen, protegiendo así las semillas e impidiendo su dispersión (Friedman et al., 1978; Hegazy et al., 2006). Una vez que se produce un evento de lluvia grave que moje la planta muerta, las ramas se despliegan y las cápsulas de semillas (siliculas) se abren. Las semillas son dispersadas por las gotas de lluvia que golpean las siliculas abiertas (Gutterman, 2002; Hegazy et al., 2006). Por lo tanto, aunque esté muerta, A. hierochuntica se ha confundido a menudo con una planta de resurrección.

Aquí, examinamos si A. hierochuntica muestra tolerancia al calor, al bajo nivel de nitratos y al estrés salino asociado a su hábitat desértico. Tomando el estrés salino como caso de estudio, determinamos si A. hierochuntica posee mecanismos fisiológicos de tolerancia a la sal que son similares a los de su pariente halófilo, E. salsugineum, y si estas dos extremófitas de ambientes muy diferentes han evolucionado estrategias metabólicas comunes o/y específicas de la especie para hacer frente al estrés salino.

Materiales y métodos

Material vegetal y condiciones de crecimiento

Las semillas de Anastatica hierochuntica se recogieron originalmente en el desierto del Negev (455881′ N y 200751′ E), Israel. La semilla original se abultó en los campos experimentales de la Universidad Ben-Gurion en Midreshet Ben-Gurion, y las semillas de esta colección se siguieron propagando en condiciones de sala de crecimiento (16 h de luz (150 μmol m-2 s-1)/8 h de oscuridad; 22°C). Las semillas de la generación F4 se utilizaron para los experimentos presentados en el presente informe. Las semillas de A. thaliana (Col-0), A. hierochuntica y E. salsugineum (ecotipo de Shandong) se esterilizaron en la superficie con lejía comercial al 50% durante 5 minutos y luego se enjuagaron cuatro veces con agua estéril. Las semillas de A. hierochuntica se sembraron en placas de agar nutritivo que contenían medio MS (Murashige y Skoog, 1962), pH 5,7, 0,5 g L-1 MES, 2% (p/v) de sacarosa y 0,8% (p/v) de agar (Duchefa Biochemie), mientras que las semillas de Arabidopsis y E. salsugineum se suspendieron en agarosa al 0,12% antes de sembrarlas en las placas. Las semillas se estratificaron a 4°C (Arabidopsis, 4 días; E. salsugineum, 7 días; A. hierochuntica, 1 día) y las placas se incubaron en la sala de crecimiento . La siembra de las semillas de las tres especies se escalonó para que la germinación se produjera aproximadamente al mismo tiempo. Para los experimentos en el suelo, las plántulas con cotiledones completamente expandidos se transfirieron de las placas a macetas de 7 cm × 7 cm × 8 cm que contenían suelo de Arabidopsis (Instituto de Ciencias Weizmann; 70% turba fina, 30% perlita 4) y se regaron hasta la capacidad de campo con 1 g L-1 de solución 20-20-20 NPK + micronutrientes (Haifa chemicals). Los pisos que contenían las macetas se cubrieron con cúpulas de plástico y se colocaron en la sala de crecimiento. Después de 2 días, las cúpulas se retiraron gradualmente para permitir el endurecimiento de las plántulas. Cada día, los platos o las macetas se barajaron para eliminar los efectos de la posición de los estantes. Aunque para los fines de los estudios comparativos con Arabidopsis y E. salsugineum, las condiciones de luz en la sala de crecimiento estaban por debajo de las que normalmente encuentra A. hierochuntica, la Figura Suplementaria S1 muestra que las tasas de crecimiento de A. hierochuntica siempre son inferiores a las de Arabidopsis, incluso a intensidades de luz más altas. Esto sugiere que el crecimiento más lento de A. hierochuntica en relación con Arabidopsis y E. salsugineum no fue un efecto de las condiciones de luz de la sala de crecimiento.

Ensayos de Estrés Abiótico

Para los análisis in vitro basados en placas, se aplicó estrés térmico (45°C) durante varios periodos y las placas se transfirieron de nuevo a la sala de crecimiento durante 48 h adicionales. Para el estrés salino, bajo NO3- y oxidativo, las plántulas se sembraron primero en placas MS de control. Debido a las diferentes tasas de crecimiento de las raíces, las plántulas de A. hierochuntica y Arabidopsis se transfirieron a las placas de tratamiento de estrés, 1 y 5 días después de la estratificación, respectivamente. Para el ensayo de elongación de raíces, se transfirieron 10 plántulas uniformes a placas cuadradas verticales MS que contenían varias concentraciones de NaCl. Para evitar cualquier efecto osmótico debido a la absorción de sacarosa en los tejidos aéreos (MacGregor et al., 2008), se cortó la parte superior del agar antes de transferir las plántulas para asegurar que los brotes no estuvieran en contacto con el medio. Para los ensayos de estrés oxidativo y de bajo NO3, se transfirieron plántulas uniformes de Arabidopsis o A. hierochuntica durante 5 días a placas cuadradas verticales que contenían macroelementos MS (menos nitrato amónico para los experimentos de bajo N) y microelementos, pH 5,7 (ajustado con KOH), 0,5 g L-1 MES, 2% (p/v) de sacarosa, 08% (p/v) de agar (Duchefa Biochemie), y varias concentraciones de KNO3- o metil viologen (MV; Sigma, M-2254).

Para los experimentos en suelo, los tratamientos con sal se aplicaron a plantas con cuatro hojas verdaderas (Arabidopsis y E. salsugineum) o dos hojas verdaderas (A. hierochuntica). Las macetas se regaron con 1 g L-1 de solución 20-20-20 NPK + micronutrientes complementada con varias concentraciones de NaCl. Los tratamientos con sal se iniciaron con el 50% de la concentración final de sal, y una semana después se aplicó el 100% de cada nivel de sal. Las plantas se cosecharon después de una semana adicional.

Mediciones de crecimiento, pigmentos, iones y fluorescencia de la clorofila

Los pesos secos de los brotes se obtuvieron secando las muestras a 75°C durante 3 días. Para los ensayos de elongación de la raíz, la longitud de la raíz se midió cada 24 h durante 4 días, y la tasa de crecimiento relativo de la raíz se calculó para cada día consecutivo de acuerdo con Hunt (1990). Para los experimentos de estrés oxidativo, el alargamiento de las raíces se calculó mediante la fórmula (L4-L0)/L4, donde L0 y L4 son las longitudes de las raíces en los días 1 o 4, respectivamente, después de la transferencia a las placas MV. Para evaluar el área foliar total, las hojas se desprendieron, se colocaron entre dos películas transparentes (Graphic Vision Media) y se escanearon. El área foliar se calculó con el software ImageJ 1.432. El contenido de antocianina se analizó según Kant et al. (2006). Los iones Na+ y K+ se extrajeron según lo descrito por Kant et al. (2006) y el contenido de iones se determinó por fotometría de llama (Modelo 410 Flame photometer, Sherwood Scientific, Ltd, UK). La clorofila y los carotenoides se extrajeron en metanol al 100% en una proporción de 1:10 de tejido a disolvente, se mantuvieron toda la noche a 4°C en la oscuridad y se midieron según Lichtenthaler (1987). La fluorescencia de la clorofila se midió con un dispositivo Mini-PAM (Walz, Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Alemania) aplicando una curva de luz rápida (White y Critchley, 1999). El enfriamiento no fotoquímico (NPQ) y el ETR del PSII se calcularon de acuerdo con Bilger y Björkman (1990) y Krall y Edwards (1992), respectivamente.

Número de cromosomas y contenido de ADN

El análisis del número de cromosomas se realizó en protoplastos de meristemos de puntas de brotes jóvenes utilizando una técnica de dispersión de gotas seguida de tinción con DAPI y microscopía de campo brillante de acuerdo con Anamthawat-Jonsson (2003). Para el análisis por citometría de flujo del contenido de ADN 2C, se prepararon suspensiones nucleares picando 60-100 mg de tejido de punta de brote joven en 1 ml de tampón de aislamiento de núcleos (NIB; Dolezel et al., 1989) helado con la adición de PVP-40 al 5% de polivinilpirrolidona. Tras la adición de otros 2 ml de NIB, las muestras se agitaron durante 1 hora y luego se filtraron a través de una malla de nylon de 50 μm y se centrifugaron a 1.900 rpm durante 8 minutos. El pellet que contenía los núcleos se resuspendió en 1 ml de NIB helado complementado con 50 μg m-1 de RNasa A libre de DNasa y 2 μg ml-1 de yoduro de propidio (Sigma-Aldrich Chemical, Co., EE.UU.), se agitó suavemente durante unos segundos y se incubó en hielo durante 10 min. Las muestras se filtraron a través de una malla de 35 μm y se ejecutaron en un FACSVantage SE de Becton Dickinson equipado con un filtro dicroico de paso largo de 640 nm, un filtro de paso de banda de 585/42 nm y un láser de iones de argón refrigerado por aire sintonizado a 15 mW y que funciona a 488 nm. Para cada muestra, se registraron 10.000 núcleos para calcular la posición media del pico G1 en el histograma. La relación de la fluorescencia relativa de las posiciones de los picos G0/G1 de cada muestra se comparó con el estándar interno Raphanus sativus cv. Saxa como referencia del tamaño del genoma (2C = 1,11 pg de ADN). La ganancia del citómetro se ajustó de manera que el pico G0/G1 de R. sativus se situara en el canal 1500.

El contenido de ADN 2C se calculó de la siguiente manera:

Muestra 2C = (posición media del pico G1 de la muestra/posición media del pico G1 de referencia) × ADN 2C de referencia.

Perfiles metabólicos

Las plantas se cultivaron en suelo y se sometieron a estrés salino como se ha descrito anteriormente. Las hojas quinta y sexta de las plantas de Arabidopsis y E. salsugineum, y las hojas tercera y cuarta de A. hierochuntica se cosecharon, se agruparon, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C. Se analizaron cuatro réplicas biológicas para cada tratamiento y se realizaron dos experimentos independientes. La extracción de metabolitos se llevó a cabo según Lisec et al. (2006) con pequeñas modificaciones (Kazachkova et al., 2013).

La deserivatización se realizó según Lisec et al. (2006) mientras que la separación, la evaluación del cromatograma y la identificación/anotación de metabolitos se realizaron según Kazachkova et al. (2013). La abundancia relativa de los metabolitos se determinó normalizando la intensidad del pico de cada metabolito con respecto al estándar de ribitol, obteniendo valores de «respuesta». Estos valores se normalizaron utilizando la transformación log10 y se analizaron estadísticamente utilizando el software MultiExperiment Viewer Versión 3.1 (Saeed et al., 2003). Se realizaron pruebas ANOVA de dos vías entre todas las especies y especies emparejadas. Para identificar los metabolitos que se vieron significativamente afectados por el tratamiento salino dentro de cada especie (Figura 8), se realizó un ANOVA de una vía (Tabla Suplementaria S3) seguido de una prueba de Dunnett. Para el análisis de componentes principales (PCA), se utilizaron los datos de respuesta transformados en log10, mientras que la agrupación jerárquica se realizó sobre los valores de respuesta lineales divididos por la mediana de abundancia de cada metabolito.

Resultados

A. hierochuntica Morfología, organización del genoma y contenido de ADN

En la naturaleza, las plantas de A. hierochuntica muestran una gran variación en la velocidad de desarrollo y en el tamaño del cuerpo, que va desde unos pocos mm hasta 15-20 cm de altura, dependiendo de la disponibilidad de humedad en el suelo. La figura 1 muestra varias etapas de desarrollo de A. hierochuntica en nuestras condiciones de laboratorio. En sus primeras etapas de crecimiento, las plantas son muy uniformes y producen dos cotiledones seguidos de dos pares opuestos de hojas verdaderas obovadas y densamente hirsutas (Figuras 1A-C). La bifurcación del brote comienza con la tercera y cuarta hojas que se separan en ramas individuales. En el punto de la rama se produce una inflorescencia axilar que forma un denso racimo de flores blancas subsésiles con cuatro pétalos (Figuras 1D,G,H). La bifurcación repetida se produce entre pares subsiguientes de hojas más lanceoladas, dentadas e hirsutas, lo que da lugar a una estructura de brotes simpodial y multiramificada que puede variar mucho en su arquitectura tridimensional general (Figuras 1E,F). Los frutos son siliculas peludas de dos alas que contienen cuatro semillas cada una (Figuras 1I-K).

Se ha informado mediante tinción con carmín ácido que el genoma de A. hierochuntica está organizado en 11 cromosomas (haploides) (Lifante et al., 1992). Para confirmar este hallazgo, visualizamos los cromosomas de A. hierochuntica utilizando un protocolo de caída de protoplastos (Anamthawat-Jonsson, 2003). El análisis de la tinción con 4′, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) mostró claramente la presencia de 22 cromosomas (diploides) (Figura 2A). La citometría de flujo reveló que el genoma de A. hierochuntica es aproximadamente 4,5 veces mayor que el de Arabidopsis (Figuras 2B,C). Para validar nuestros resultados, también realizamos citometría de flujo con E. salsugineum y demostramos que el genoma de esta especie es aproximadamente dos veces mayor que el genoma de Arabidopsis, tal y como informaron previamente Inan et al. (2004). Así pues, A. hierochuntica tiene un genoma de aproximadamente 607 Mbp.

A. hierochuntica muestra tolerancia al estrés abiótico asociado a su hábitat desértico

Las plantas de Anastatica hierochuntica pueden experimentar temperaturas diarias superiores a los 40°C. Además, el desierto del Néguev se caracteriza por la existencia de reservas de nitrógeno en el suelo (Zaady, 2005). Por ejemplo, hemos medido niveles de NO3- en el suelo que oscilan entre 0,4 y 4 mM (datos no mostrados). Por lo tanto, probamos si A. hierochuntica muestra mayor tolerancia al estrés térmico y a los bajos niveles de NO3- en el medio de crecimiento, que Arabidopsis. Las plántulas cultivadas in vitro (etapa de dos cotiledones) de ambas especies sobrevivieron a 1 hora de estrés térmico (45°C) con una reducción aproximada del 25% en el peso fresco (FW) para ambas especies, pero sin efecto en el contenido de clorofila o carotenoides (Figuras 3A-D; Figura Suplementaria S2). Dos horas de estrés térmico afectaron gravemente a las plántulas de Arabidopsis dejándolas pálidas o blanqueadas (Figura 3A). Este efecto se reflejó en una reducción del 67% en el FW, y una reducción del 45 y 54% en el contenido de clorofila y carotenoides, respectivamente, en comparación con las plántulas de control. Por otro lado, no hubo más reducción en el FW de las plántulas de A. hierochuntica en comparación con el estrés térmico de 1 h y no hubo efecto en los niveles de clorofila y carotenoides en comparación con el control. El estrés térmico de 3 y 4 h causó un estrés severo a las plántulas de Arabidopsis como se manifiesta en la imposibilidad de crecimiento de las plántulas y el blanqueo casi completo de los cotiledones. Por el contrario, A. hierochuntica mostró una tolerancia al calor considerablemente mayor que Arabidopsis después de 3 y 4 h de estrés térmico. Por ejemplo, el estrés térmico de 4 horas, causó una caída del 50% en el FW de A. hierochuntica mientras que Arabidopsis exhibió una reducción del 73% del FW. Además, las plántulas de A. hierochuntica no se blanquearon, sino que mantuvieron los niveles de clorofila en aproximadamente el 65% de los niveles de control, sin que el estrés térmico afectara al contenido de carotenoides.

Anastatica hierochuntica también mostró tolerancia al estrés por bajo N en comparación con Arabidopsis (Figura 3E). Arabidopsis mostró una reducción progresiva y brusca del FW a medida que se reducían los niveles de NO3- en agar nutritivo, mostrando una reducción del 75% del FW a 0,05 mM de NO3- (Figura 3F; Figura Suplementaria S3). Por el contrario, A. hierochuntica mostró una caída mucho más moderada del FW a medida que se reducían los niveles de NO3-, y el FW sólo cayó un 25% a 0,05 mM de NO3-. La condición de alto estrés de las plántulas de Arabidopsis a niveles bajos de NO3- se manifestó en la producción de cantidades progresivamente mayores de antocianinas a medida que los niveles de NO3- disminuían (Figura 3G). Por otro lado, no se pudieron distinguir diferencias significativas en el contenido de antocianinas de A. hierochuntica en comparación con el control en ningún nivel de NO3-.

Debido a que el desierto del Néguev posee islas de alta salinidad y a que A. hierochuntica también se encuentra creciendo en el valle del Mar Muerto, comprobamos si A. hierochuntica presenta una mayor tolerancia al estrés salino que Arabidopsis. Se observó una reducción mucho mayor del crecimiento de Arabidopsis a medida que aumentaba la concentración de sal que la observada en A. hierochuntica (Figuras 4A-C; Figura Suplementaria S4). Por ejemplo, a 100 y 200 mM de NaCl, Arabidopsis mostró una reducción del 55 y 77% del FW, respectivamente, mientras que el FW de A. hierochuntica sólo se redujo en un 30 y 48% a la respectiva concentración isosalina (Figura 4A). Del mismo modo, el peso seco se vio afectado en menor medida en A. hierochuntica que en Arabidopsis a 100 y 200 mM de NaCl (Figura 4B). El área foliar de Arabidopsis también se vio afectada en mayor medida por el estrés salino que A. hierochuntica. Por ejemplo, Arabidopsis mostró una reducción del 74% del área foliar a 200 mM de NaCl mientras que el área foliar de A. hierochuntica sólo se redujo en un 49% (Figura 4C). Además, en un ensayo de elongación de raíces en placa in vitro, las plántulas de Arabidopsis mostraron una clara y drástica reducción de la tasa de crecimiento relativo de las raíces mediada por la sal, de forma que a 200 mM de NaCl, la elongación de las raíces prácticamente había cesado (Figura 4D). Por otro lado, 100 mM de NaCl sólo tuvo un efecto leve en la tasa de crecimiento relativo de la raíz de A. hierochuntica, mientras que la elongación de la raíz continuó incluso a 200 mM de NaCl (Figura 4E).

A. hierochuntica controla estrechamente la acumulación de Na+ y exhibe características fotoquímicas que son resistentes al estrés salino

Una característica de la tolerancia natural a la sal es la capacidad de las plantas para controlar estrechamente la acumulación de Na+ (por ejemplo, Kant et al., 2006). En condiciones de control, A. hierochuntica poseía aproximadamente 4,5 veces más Na+ en los brotes que Arabidopsis, similar a la cantidad tres veces mayor de Na+ en los brotes de E. salsugineum en comparación con Arabidopsis (Figura 5A; Kant et al., 2006). Ambas especies acumularon cantidades crecientes de Na+ a medida que aumentaban las concentraciones de sal, pero Arabidopsis acumuló Na+ en mucha mayor medida que A. hierochuntica (Figura 5B). Arabidopsis y A. hierochuntica mostraron niveles comparables de K+ en los brotes bajo condiciones de control y una reducción similar en el contenido de K+ en respuesta al estrés salino (Figura 5C). Así, bajo condiciones de control, A. hierochuntica tuvo una relación Na+/K+ más alta que Arabidopsis (Figura 5D), pero a medida que las concentraciones de sal en el suelo se incrementaron, las relaciones Na+/K+ aumentaron en mucha menor medida en A. hierochuntica (Figuras 5D,E). Ambas especies mostraron relaciones FW/DW similares en todas las concentraciones de sal (Figura 5F), lo que sugiere que las diferencias en los contenidos de iones no se debieron a variaciones en el contenido de agua de los tejidos. En conjunto, nuestros datos de análisis de iones sugieren que A. hierochuntica es capaz de controlar estrechamente la acumulación de Na+.

Recientemente informamos de que A. hierochuntica, en condiciones de control, presenta una menor NPQ, un mecanismo para disipar el exceso de energía lumínica, que Arabidopsis, y una tasa de transporte de electrones del fotosistema II (PSII ETR) relativamente mayor (Eppel et al., 2014). En el presente estudio, A. hierochuntica mostró un NPQ aproximadamente un 50% menor que Arabidopsis en condiciones de control (Figura 5G), y mientras que el estrés salino no tuvo ningún efecto sobre el NPQ de Arabidopsis, causó una caída adicional del 50% en el NPQ de A. hierochuntica. En condiciones de control, la ETR del PSII fue aproximadamente un 55% mayor en A. hierochuntica en comparación con Arabidopsis (Figura 5H). El estrés salino provocó una caída de la ETR del PSII en ambas especies, pero A. hierochuntica mantuvo una ETR del PSII un 45% mayor en comparación con Arabidopsis. Por lo tanto, los datos de NPQ y PSII ETR sugieren que la fotoquímica de A. hierochuntica muestra una considerable resistencia al estrés salino.

Reprogramación metabólica de Arabidopsis, E. salsugineum y A. hierochuntica en respuesta al estrés salino

Eutrema salsugineum exhibe una extrema tolerancia a la sal (Kant et al., 2006; Kazachkova et al., 2013), lo que nos brindó la oportunidad de comparar tres especies relacionadas originarias de ambientes muy diferentes, y que difieren en su tolerancia a la sal: la glicófita sensible a la sal Arabidopsis (Columbia templada, MT, EE.UU.), y las dos extremófitas – A. hierochuntica moderadamente tolerante a la sal (desierto de Negev caliente y seco), y E. salsugineum (zonas costeras frías y saladas de la provincia de Shandong, China).

Las plantas de Arabidopsis, E. salsugineum y A. hierochuntica cultivadas en el suelo fueron expuestas a concentraciones crecientes de NaCl (E. salsugineum no fue expuesta a 50 mM de NaCl debido al efecto leve de esta concentración; Kazachkova et al., 2013), y se determinó la abundancia relativa de metabolitos primarios de carbono y nitrógeno en el tejido foliar. Para obtener una visión global de las diferencias entre las especies de plantas y entre los tratamientos, se empleó el PCA. La inspección de los dos primeros componentes principales, que representan el 68% de la varianza total dentro del conjunto de datos, permitió clasificar las muestras por especies y tratamientos (Figura 6). El primer componente principal, que representa el 48,2% de la varianza total, separó claramente el metabolismo de Arabidopsis de sus dos parientes extremófilos (Figura 6A). Entre los metabolitos que más afectan a la separación entre especies (en orden decreciente de valor absoluto del vector propio y confirmado por el ANOVA de dos vías) estaban la rafinosa, el malato, el galactinol, el fumarato, el ácido fosfórico y el glicerato (Tablas Suplementarias S1 y S2). En general, la prueba ANOVA de dos vías para las tres especies reveló que 25 de los 33 metabolitos eran significativamente diferentes entre las especies (Tabla Suplementaria S2). Entre estos 25 metabolitos, 22 metabolitos también mostraron una interacción significativa especie × tratamiento salino.

El segundo componente principal que representa el 19,8% de la varianza total discriminó las muestras según el tratamiento de la sal. Entre los metabolitos que más afectan a la separación entre muestras (en orden descendente de valor absoluto del vector propio y confirmado por el ANOVA de dos vías) estaban la prolina, el malato, la rafinosa, la serina, el fumarato y el mio-inositol. En total, se encontró que 20 metabolitos eran significativamente diferentes entre los tratamientos con sal (Tabla Suplementaria S2). Los grupos de muestras de Arabidopsis control y tratada con sal estaban sustancialmente repartidos en el segundo componente, mientras que los grupos de muestras de E. salsuginem y A. hierochuntica estaban más condensados.

La completa separación de los perfiles metabólicos de Arabidopsis y de las dos extremófitas, y la respuesta metabólica parcialmente superpuesta de E. salsugineum y A. hierochuntica sugerían respuestas comunes y específicas de las especies de las extremófitas al estrés salino (Figura 6A). Esta noción fue apoyada por el análisis de agrupación jerárquica (HCA) que colocó a las dos extremófitas en un clado separado de Arabidopsis pero separó a E. salsugineum y A. hierochuntica en dos subclados (Figura 6C). El PCA de las dos extremófitas por separado ilustró claramente la respuesta metabólica específica de cada especie al estrés salino (Figura 6B). Los metabolitos que afectaron principalmente a la separación de las extremófitas (en orden decreciente del valor absoluto del vector propio y confirmado por la prueba ANOVA de dos vías) fueron: prolina, citrato, aspartato, rafinosa, ácido treónico y ácido piroglutámico (Tablas suplementarias S1 y S2).

El examen de los metabolitos individuales en condiciones de control reveló un fenotipo metabólico general comparable entre las dos extremófitas, con la mayoría de los metabolitos mostrando una abundancia significativamente mayor en A. hierochuntica y E. salsugineum en comparación con Arabidopsis (Figura 7). Entre los metabolitos que mostraron diferencias entre Arabidopsis y las dos extremófitas en condiciones de control fueron: (i) los intermediarios del ciclo TCA, citrato y malato que fueron significativamente mayores en las extremófitas, y fumarato que fue significativamente mayor en Arabidopsis; (ii) los azúcares, glucosa y fructosa; (iii) los fosfatos de hexosa, fructosa-6-fosfato y glucosa-6-fosfato; (iv) el ácido fosfórico; (v) los antioxidantes, ascorbato y dehidroascorbato (Foyer y Noctor, 2011). Los niveles de los metabolitos indicados en (ii) a (v) fueron todos más altos en las extremófitas. Además, el osmoprotector prolina (Smirnoff y Cumbes, 1989) fue mayor en las plantas extremófitas en condiciones de control, mientras que los osmoprotectores mio-inositol (también precursor del osmoprotector galactinol; Bohnert et al., 2006) y galactinol (también precursor del osmoprotector rafinosa; Taji et al., 2002; Nishizawa et al., 2008) fueron mayores en Arabidopsis. Curiosamente, la mayoría de los metabolitos mostraron niveles significativamente más bajos en A. hierochuntica en comparación con E. salsugineum.

La inspección de los niveles de metabolitos en respuesta al estrés salino reveló sólo unas pocas respuestas de metabolitos comunes. Las tres especies mostraron mayores niveles de los osmoprotectores mio-inositol y prolina en respuesta al estrés salino (Figura 8). En particular, E. salsugineum mostró un mayor contenido de prolina que Arabidopsis y A. hierochuntica en el control y 100 mM de NaCl. Los altos niveles de prolina son una característica bien caracterizada de E. salsugineum cultivada en el suelo y bien fertilizada (Kant et al., 2006; Guevara et al., 2012; Kazachkova et al., 2013). Además, los niveles de glicina se redujeron en respuesta al estrés en las tres especies, aunque el nivel real de glicina fue mayor en Arabidopsis en todos los niveles de tratamiento en comparación con las extremófitas.

En contraste con las pocas respuestas metabólicas comunes entre las tres especies, un número considerable de metabolitos mostraron una respuesta común global en ambas extremófitas que fue diferente a la observada en Arabidopsis. Por ejemplo, entre los aminoácidos, el nivel de alanina en Arabidopsis disminuyó gradualmente en respuesta a la sal, mientras que permaneció constitutivamente alto en las extremófitas e incluso aumentó ligeramente en A. hierochuntica a 200 mM de NaCl. El aspartato fue apenas detectable en Arabidopsis, pero aumentó sustancialmente con la concentración de sal en ambas especies de extremófitas, pero particularmente en E. salsugineum. Por el contrario, los niveles de treonina aumentaron drásticamente en Arabidopsis, mientras que permanecieron relativamente bajos en las extremófitas, con un pequeño pero significativo aumento en A. hierochuntica a niveles de sal más altos. La serina y el glicerato, que son intermediarios del ciclo fotorrespiratorio, también mostraron diferencias en la acumulación entre las extremófitas y Arabidopsis. El contenido de serina aumentó en respuesta a la sal tanto en Arabidopsis como en A. hierochuntica, pero se acumuló a niveles considerablemente más altos en Arabidopsis a la mayor concentración de sal. Por otro lado, la serina sólo mostró una ligera disminución mediada por la sal en E. salsugineum. Los niveles generales de glicerato fueron mucho más bajos en Arabidopsis que en las extremófitas. Además, mientras que el glicerato no mostró ninguna respuesta a la sal en Arabidopsis, se mantuvo en un nivel constantemente más alto en A. hierochuntica y mostró un aumento mediado por la sal en E. salsugineum.

Los niveles de los intermediarios del ciclo TCA, citrato y malato, fueron sustancialmente más altos en las extremófitas en comparación con Arabidopsis. Sin embargo, mientras que en E. salsugineum tanto los niveles de citrato como de malato aumentaron significativamente en respuesta a la sal, los niveles de citrato en A. hierochuntica aumentaron significativamente mientras que el malato se mantuvo en un nivel constantemente más alto que en Arabidopsis. El contenido de fumarato, por otro lado, fue sustancialmente mayor en Arabidopsis, disminuyendo en respuesta al estrés salino, pero permaneciendo constantemente bajo en las extremófitas. Los niveles de otros ácidos carboxílicos, como el ascorbato y el dehidroascorbato, fueron constitutivamente más altos en las extremófitas que en Arabidopsis.

También se observaron diferencias en los contenidos de azúcares entre Arabidopsis y las extremófitas. Las diferencias más llamativas fueron en los niveles de los osmoprotectores galactinol y rafinosa (Taji et al., 2002; Nishizawa et al., 2008). Ambos aumentaron drásticamente en Arabidopsis, pero se indujeron en un grado mucho menor en las extremófitas. Además, la fructosa-6-fosfato y la glucosa-6-fosfato se acumularon en mayor medida en las extremófitas, manteniéndose en niveles globales constantes en A. hierochuntica, mientras que se redujeron significativamente en E. salsugineum en respuesta a la sal.

También discernimos respuestas específicas de las especies que se diferenciaban entre las extremófitas. Por ejemplo, el nivel de serina en E. salsugineum se redujo significativamente por el estrés salino mientras que en A. hierochuntica el contenido de serina aumentó significativamente. El piroglutamato (posiblemente parte de la vía de reciclaje del glutatión, un osmoprotector y un reservorio de Glu (Ohkama-Ohtsu et al., 2008; Kumar y Bachhawat, 2012; Schreiber et al, 2012), la fructosa y el glicerofosfoglicerol mostraron niveles constitutivamente más altos en E. salsugineum en comparación con A. hierochuntica.

A. hierochuntica es tolerante al estrés oxidativo severo

Los niveles constitutivamente más altos de los compuestos antioxidantes ascorbato y dehidroascorbato en A. hierochuntica (y E. salsugineum) en comparación con Arabidopsis (Figuras 7 y 8) sugieren que A. hierochuntica posee un sistema antioxidante constitutivamente activo. La comparación de la respuesta de las plántulas de Arabidopsis y de A. hierochuntica al metil viologeno (MV) formador de ROS (Babbs et al., 1989; Fujii et al., 1990), demostró que las plántulas de A. hierochuntica mostraron una notable tolerancia a concentraciones crecientes de MV en comparación con Arabidopsis (Figura 9A). El FW de los brotes de A. hierochuntica y la elongación de las raíces disminuyeron en mucha menor medida que Arabidopsis a medida que aumentaba la concentración de VM. Además, A. hierochuntica mantuvo los niveles totales de clorofila en respuesta a concentraciones extremas de VM (12 μM) mientras que los niveles de clorofila se redujeron en Arabidopsis, que mostró signos de blanqueo (Figuras 9A-D; Figura Suplementaria S5). Los graves síntomas de estrés observados en Arabidopsis también se reflejaron en la elevada acumulación de antocianinas en respuesta a la VM mientras que en A. hierochuntica sólo se observaron bajos niveles de antocianinas (Figura 9E). Estos datos sugieren que A. hierochuntica tiene un sistema antioxidante muy activo.

Discusión

Anastatica hierochuntica – Una planta desértica de linaje III que es tolerante a múltiples estreses abióticos

La familia Brassicaceae comprende más de 3.600 especies, incluyendo muchos cultivos importantes, así como el principal sistema de plantas modelo A. thaliana (Franzke et al., 2011; Al-Shehbaz, 2012). Contiene 301 géneros clasificados en 49 tribus monofiléticas. La familia puede dividirse en dos grupos principales: el grupo Aethionema y el grupo central (Franzke et al., 2011), este último puede dividirse en tres linajes principales (linajes I, II y III).

En los últimos años, se han generado una serie de recursos genómicos para las Brassicaceae proporcionando así una impresionante plataforma para estudios de biología evolutiva y comparativa. Se han secuenciado o se están secuenciando al menos 36 genomas (Koenig y Weigel, 2015), incluyendo 13 especies del linaje I (por ejemplo, A. thaliana, Arabidopsis lyrata, Capsella rubella), 17 especies del linaje II o del linaje ampliado II (por ejemplo, Arabis alpina, Brassica napus, E. salsugineum, S. parvula) pero solo tres especies del linaje III (Diptychocarpus strictus, Euclidium syriacum, Malcolmia maritima) (Franzke et al., 2011; Kiefer et al., 2014; Huang et al., 2015). Además, de los genomas completados, ninguno es de especies del linaje III. Esta rica colección de genomas ofrece un medio para comprender características tales como los rasgos de desarrollo e historia de la vida que pueden faltar en A. thaliana. En particular, las extremófitas de la familia Brassicaceae que prosperan en algunos de los entornos más extremos ofrecen excelentes sistemas para comprender los mecanismos moleculares que subyacen a la adaptación a entornos difíciles.

La extremófita A. hierochuntica de la tribu Anastaticeae pertenece a las especies del linaje III poco representadas (Couvreur et al., 2010; Kiefer et al., 2014; Huang et al., 2015), para las que hay una escasez de conocimientos fisiológicos y moleculares. Además, A. hierochuntica presenta una oportunidad para la comparación de una anual del desierto con las extremófitas Brassicaceae como E. salsugineum que facilitará nuestra comprensión de cómo las plantas se han adaptado a hábitats extremos muy diferentes.

En el estudio actual, demostramos que A. hierochuntica es tolerante a varios estreses asociados con su hábitat del desierto, a saber, las altas temperaturas, el bajo N del suelo y la salinidad (Figuras 3 y 4). Tanto la tolerancia al calor como la tolerancia al bajo N son rasgos importantes para los que A. hierochuntica podría ser una fuente de nuevos determinantes de tolerancia. El estrés térmico, especialmente cuando se combina con la sequía, puede conducir a enormes pérdidas en la producción de cultivos (Mittler, 2006; Mittler y Blumwald, 2010; Lesk et al., 2016), en particular porque los cereales son más sensibles a estas tensiones durante la fase de llenado del grano (Barnabas et al., 2008). De hecho, un informe reciente identificó la tolerancia al calor en el trigo en la fase reproductiva como un rasgo clave para aumentar los rendimientos bajo el cambio climático previsto (Stratonovitch y Semenov, 2015). Aunque los informes detallados sobre las extremófitas capaces de soportar temperaturas extremadamente altas son escasos, se han iniciado algunos trabajos (Emad El-Deen, 2005; Lawson et al., 2014; Yates et al., 2014; Gallas y Waters, 2015). Rhazya stricta, en particular, puede mantener la fotosíntesis totalmente funcional en el campo a temperaturas de la hoja de hasta 43°C junto con intensidades de luz >1000 μmol de fotones m-1 s-1 (Lawson et al., 2014).

La eficiencia en el uso del nitrógeno (NUE) es otro rasgo que ha sido objeto de muchas investigaciones y esfuerzos de mejora (McAllister et al., 2012; Han et al., 2015). Las plantas de cultivo sólo aprovechan entre el 30 y el 40% del N aplicado (Raun y Johnson, 1999), y el N restante se pierde por lixiviación, desnitrificación, volatilización, erosión del suelo y consumo microbiano, aumentando así tanto la contaminación ambiental por N como los costes de producción (Good et al., 2004). Debido a que el mejoramiento tradicional para mejorar la NUE ha llegado a una meseta, se ha sugerido el uso de extremófitos poco tolerantes al N como un enfoque para identificar nuevos alelos y genes (Kant et al., 2011). De hecho, E. salsugineum es más tolerante a las condiciones de limitación de N que Arabidopsis, y posee un mayor contenido de N, aminoácidos totales y proteína soluble total a bajos niveles de N en el suelo (Kant et al., 2008). La mayor NUE de E. salsugineum puede atribuirse en parte a una mayor captación constitutiva de NO3- en condiciones de bajo N, así como a la expresión diferencial de genes que codifican genes de asimilación y transporte de NO3-.

A. hierochuntica y E. salsugineum comparten características similares de absorción de sal y fotosintética en respuesta al estrés salino

Anastatica hierochuntica mostró varias características fisiológicas de tolerancia a la sal que son similares a las observadas en E. salsugineum (Inan et al., 2004; Kant et al., 2006). En primer lugar, bajo condiciones de control, A. hierochuntica posee mayores niveles de Na+ en los brotes que Arabidopsis (Figura 5). En E. salsugineum, el mayor contenido de Na+ en los brotes probablemente ayuda a mantener un potencial osmótico foliar constitutivamente más negativo que el de Arabidopsis (Inan et al., 2004). En segundo lugar, bajo condiciones salinas A. hierochuntica muestra un control estricto de la acumulación de Na+ en comparación con Arabidopsis (Figuras 5A-D), de nuevo similar a E. salsugineum (Kant et al., 2006). Una corriente entrante de Na+ significativamente reducida y una menor afluencia de Na+ en las raíces de E. salsugineum en comparación con Arabidopsis (Volkov y Amtmann, 2006; Wang et al., 2006), así como la expresión diferencial de un gen que codifica el antiportador Na+/H+, SOS1 (Kant et al., 2006), probablemente contribuyen al control estricto de la captación de Na+ en la extremófita.

En tercer lugar, A. hierochuntica muestra un mayor transporte de electrones del PSII y un menor NPQ que Arabidopsis en condiciones de control y salinas, lo que sugiere que una mayor cantidad de energía lumínica se utiliza con fines productivos en A. hierochuntica que en Arabidopsis (Figuras 5G,H). E. salsugineum también es capaz de mantener un NPQ más bajo que Arabidopsis en condiciones salinas, mientras que el transporte de electrones del PSII aumenta en respuesta a la sal (Stepien y Johnson, 2009).

A. hierochuntica posee un sistema antioxidante altamente activo

Anastatica hierochuntica muestra niveles constitutivamente altos de compuestos antioxidantes (Figuras 7 y 8) y una sorprendente tolerancia a la VM generadora de ROS (Figura 9), lo que sugiere que A. hierochuntica posee un sistema antioxidante altamente activo, que es una característica común de las extremófitas. En E. salsugineum y S. parvula, por ejemplo, varias enzimas implicadas en la eliminación de ROS son muy activas, y los metabolitos antioxidantes como la tiorredoxina, el ascorbato y el dehidroascorbato muestran niveles constitutivamente más altos que en Arabidopsis (M’rah et al., 2007; Kazachkova et al., 2013; Uzilday et al., 2014). La mayor expresión de los genes de E. salsugineum que codifican componentes de la maquinaria antioxidante tanto en condiciones de control como de estrés salino podría subyacer a las mayores actividades enzimáticas y niveles antioxidantes (Taji et al., 2004; Gong et al., 2005).

Los mecanismos antioxidantes activos no solo son importantes para las extremófitas del desierto o las halófitas, sino que también son cruciales para otras extremófitas. Por ejemplo, las plantas árticas, como Deschampsia antarctica, tienen que mantener la fotoquímica bajo una combinación de bajas temperaturas y alta luz. D. antarctica posee una actividad de superóxido dismutasa (SOD) constitutivamente más alta en comparación con otras Poaceae, expresa una isoenzima MnSOD resistente al peróxido de hidrógeno durante la aclimatación al frío, y produce una serie de compuestos protectores inducibles contra los rayos UV-B (Xiong y Day, 2001; Pérez-Torres et al., 2004; Ruhland et al., 2005).

Además de los mecanismos antioxidantes, los procesos de disipación de energía también pueden prevenir la generación de ROS dañinos. Por ejemplo, en las extremófitas como A. hierochuntica y la planta alpina, Ranunculus glacialis, la fotorrespiración juega un papel en la disipación de energía (Streb et al., 2005; Eppel et al., 2014). Sin embargo, este no parece ser el caso de E. salsugineum. Más bien, hay un aumento mediado por el estrés en los niveles de proteína de la oxidasa terminal plastidial que podría funcionar como un sumidero de electrones alternativo y evitar la generación de ROS (Stepien y Johnson, 2009). Curiosamente, la cantidad de PTOX en las hojas de R. glacialis supera la cantidad encontrada en todas las demás especies de plantas examinadas, e incluso cuando el flujo de electrones para la asimilación, la fotorrespiración y la reacción de Mehler están bloqueados, las hojas de R. glacialis bajo alta intensidad de luz pueden mantener el flujo de electrones (Streb et al., 2005; Laureau et al., 2013).

Por lo tanto, para las extremófitas que se encuentran con una combinación de estreses severos como A. hierochuntica (alta intensidad de luz, altas temperaturas, bajo estado de nutrientes del suelo, suelos salinos), los sistemas antioxidantes altamente activos a menudo acoplados con mecanismos de disipación del exceso de energía parecen cruciales para la supervivencia en hábitats extremos.

Las extremófitas de diferentes hábitats exhiben estrategias metabólicas comunes y distintas para hacer frente al estrés salino

Nuestros datos de perfiles metabólicos sugirieron que las extremófitas poseen cambios en el metabolismo, tanto comunes como específicos de la especie, mediados por el estrés, que son diferentes a los de Arabidopsis (Figuras 6-8). Además, el análisis PCA sugirió que los diferentes niveles de estrés salino causan cambios mucho mayores en Arabidopsis que en las extremófitas (Figura 6) indicando que A. hierochuntica y E. salsugineum pueden estar preparadas para el estrés de acuerdo con otros informes sobre E. salsugineum (por ejemplo, Kant et al., 2006; Kazachkova et al., 2013; Vera-Estrella et al., 2014). El análisis de los niveles de metabolitos en condiciones de control (Figura 7) corrobora la idea de que las extremófitas están preparadas para el estrés. Ambas extremófitas mostraron acumulación de antioxidantes, azúcares e intermedios del ciclo TCA, que han demostrado ser importantes para las respuestas de las plantas a diversos estreses, incluyendo la sal y la sequía (Smirnoff, 1996; Urano et al., 2009; Lugan et al., 2010; Obata y Fernie, 2012). Sin embargo, no todas las extremófitas están preparadas para el estrés. Por ejemplo, la leguminosa extremófita Lotus creticus, tolerante a la sal, no presenta este fenómeno (Sánchez et al., 2011).

Se observaron notables diferencias entre las extremófitas y Arabidopsis en la abundancia de intermediarios específicos del ciclo del TCA. Ambas extremófitas mostraron altos niveles de malato y citrato pero bajos niveles de fumarato mientras que Arabidopsis mostró el patrón opuesto (Figuras 7 y 8). Esta firma metabólica parece ser una característica importante de las Brassicaceae extremófilas bajo condiciones de control, sal y bajo N e independientemente de las plataformas de crecimiento (Kant et al., 2008; Kazachkova et al., 2013). Anteriormente especulamos que un gran aumento en la reserva de malato y los bajos niveles de fumarato podrían reflejar la generación de oxaloacetato para proporcionar esqueletos de carbono para una mayor síntesis de aminoácidos en E salsugineum (Kazachkova et al., 2013). El oxaloacetato se puede metabolizar posteriormente en aspartato (Sweetlove et al., 2010), y de hecho observamos niveles de aspartato más altos, tanto de control como inducidos por la sal, en las extremófitas en comparación con Arabidopsis. Un uso de los niveles más altos de aspartato podría ser el suministro de grupos amino al ciclo fotorrespiratorio a través de la glicina (Novitskaya et al., 2002). La alanina también puede aportar grupos aminos a la glicina durante la fotorrespiración (Liepman y Olsen, 2001; Novitskaya et al., 2002), y las extremófitas fueron capaces de mantener los niveles de alanina bajo condiciones de control y de estrés salino mientras que el contenido de alanina disminuyó en Arabidopsis en respuesta a la sal. En consonancia con la idea de que las extremófitas pueden mantener el flujo metabólico a través del ciclo fotorrespiratorio, la relación glicina/serina fue siempre menor en las extremófitas que en Arabidopsis. Una alta proporción de glicina a serina a menudo se correlaciona con la oxigenación de la rubisco en las etapas de corto plazo después de la inducción de las condiciones fotorrespiratorias (Novitskaya et al., 2002). Sin embargo, el aumento del flujo a través de la vía fotorrespiratoria provoca una reducción de la relación glicina/serina (Timm et al., 2012). Un apoyo adicional a un mayor flujo fotorrespiratorio en las extremófitas puede derivarse de los mayores niveles de glicerato en A. heirochuntica y E. salsugineum bajo condiciones de control y estrés salino en comparación con Arabidopsis. El glicerato es el producto de la penúltima reacción en la vía fotorrespiratoria y se convierte en 3-fosfoglicerato, que se retroalimenta en el ciclo de Calvin (Hagemann y Bauwe, 2016). Como se mencionó anteriormente, la fotorrespiración juega un papel importante en la disipación del exceso de energía en A. hierochuntica (Eppel et al., 2014).

Otra razón para los bajos niveles de malato en Arabidopsis en comparación con las extremófitas podría deberse a la probable mayor inhibición de la fotosíntesis mediada por la sal en Arabidopsis (Stepien y Johnson, 2009). Esto podría conducir a una reducción del flujo de carbono a través de la vía glicolítica y, por tanto, a una necesidad de conversión de malato en piruvato por parte de la enzima málica para mantener la función del ciclo TCA (Casati et al., 1999). Por otro lado, tanto A. hierochuntica como E. salsugineum muestran una tasa fotosintética relativamente más alta y un NPQ más bajo que A. thaliana y otras especies de plantas, en condiciones de control y de sal, y bajo varias concentraciones de CO2 e intensidades de luz (Figuras 5G,H; Stepien y Johnson, 2009; Eppel et al., 2014). De hecho, los mayores niveles globales de glucosa, fructosa, glucosa 6-fosfato y fructosa 6-fosfato en las extremófitas pueden indicar un mayor flujo de glucólisis, ya sea por la fotosíntesis o por el consumo de almidón, lo que puede mantener la entrada de piruvato en el ciclo TCA.

Se cree que la desafinosa y su precursor galactinol son osmoprotectores y antioxidantes (Taji et al, 2002; Nishizawa et al., 2008; Farrant et al., 2009). Observamos un gran aumento en el contenido de galactinol y rafinosa en Arabidopsis en respuesta a la sal, mientras que los niveles de estos metabolitos permanecieron bajos en las extremófitas (Figura 8). Es notable que las extremófitas de dos hábitats muy diferentes hayan evolucionado para evitar la acumulación de altos niveles de rafinosa como un componente de tolerancia al estrés similar al musgo de espiga Selaginella lepidophylla, tolerante a la desecación (Yobi et al., 2012). Aunque, no está claro qué ventaja se obtiene al no acumular rafinosa, este azúcar puede ser metabolizado en sacarosa y posteriormente en glucosa y fructosa para la glucólisis.

La mayor acumulación de metabolitos observada en las extremófitas es costosa (Munns, 2002) y podría contribuir a la menor tasa de crecimiento de E. salsugineum en comparación con Arabidopsis (Lugan et al., 2010). Sin embargo, A. hierochuntica, donde los niveles de la mayoría de los metabolitos y, por tanto, los costes son menores en comparación con E. salsugineum, presenta una rápida germinación y establecimiento de las plántulas. Es posible que el hábitat salino de E. salsugineum, demande constantemente altos niveles de solutos compatibles y antioxidantes. Por el contrario, A. hierochuntica está expuesta a niveles de salinidad más bajos que E. salsugineum, pero experimenta una intensa radiación lumínica, baja disponibilidad de agua y nutrientes y temperaturas extremas. Al acumular compuestos específicos, como los antioxidantes, mientras acumula moderadamente otros solutos como azúcares y aminoácidos, A. hierochuntica podría haber desarrollado una estrategia de tolerancia al estrés con menores costes metabólicos, adaptada a su hábitat específico, permitiendo un rápido establecimiento de las plántulas y una rápida finalización de su ciclo vital para evitar la estación seca.

Contribuciones de los autores

GE, RS y SB concibieron y diseñaron el estudio. GE y RS realizaron todos los experimentos excepto el recuento de cromosomas, la fluorescencia de la clorofila y la citometría de flujo, que fueron realizados por AK, AE y AC, respectivamente, bajo la supervisión de SB, SR y NT-Z, respectivamente. GE y YK, bajo la supervisión de AF, realizaron los experimentos de perfiles metabólicos y el análisis de datos. TA participó en los experimentos de estrés oxidativo. YG supervisó y participó en las recolecciones de campo de A. hierochuntica y asesoró sobre los protocolos de crecimiento. GE y SB escribieron el artículo y todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito.

Financiación

Esta investigación fue apoyada por la Fundación Koshland para el apoyo a la investigación interdisciplinaria en la lucha contra la desertificación, el Fondo Judío Goldinger Trust para el Futuro, y el Programa I-CORE del Comité de Planificación y Presupuesto y la Fundación Científica de Israel .

Declaración de conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un potencial conflicto de intereses.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Noga Sikron su excelente ayuda técnica y a Albert Batushansky su asesoramiento estadístico. Agradecemos la amable donación de semillas de R. sativus por parte del profesor J. Doležel. Agradecemos al Laboratorio de Servicios Gilat Hasade por las mediciones del contenido de iones, y a María Fernanda Arroyave Martínez por la imagen del crecimiento de Arabidopsis y A. hierochuntica a mayores intensidades de luz. Estamos muy agradecidos a Anna Amtmann por la lectura crítica de este manuscrito.

Material Suplementario

El Material Suplementario de este artículo se puede encontrar en línea en: https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fpls.2016.01992/full#supplementary-material

Notas al pie

1. ^http://www.ims.gov.il/IMSENG/All_Tahazit/homepage.htm
2. ^http://rsbweb.nih.gov/ij/