Informes biomédicos

Introducción

El carcinoma hepatocelular (CHC) es una neoplasia primaria de hepatocitos, que representa el 80% de todos los cánceres primarios de hígado. Los pacientes con enfermedades hepáticas crónicas asociadas a infecciones por el virus de la hepatitis B o el virus de la hepatitis C suelen desarrollar CHC(2). Se ha producido una mejora en las técnicas quirúrgicas y el desarrollo de varias modalidades de tratamiento no quirúrgico; sin embargo, la mejora para el pronóstico extremadamente pobre de los pacientes con CHC sigue siendo limitada (3).

La amplia investigación de la apoptosis, también conocida como muerte celular programada, en las últimas décadas ha destacado este proceso como un método adecuado para la terapia del cáncer (4,5). Sin embargo, numerosos fármacos con efectos apoptóticos están actualmente limitados para la terapia del cáncer debido a los efectos secundarios. Por lo tanto, es importante identificar agentes terapéuticos novedosos y fiables que puedan inducir eficazmente la apoptosis de las células cancerosas en el tratamiento de los pacientes con CHC.

Recientemente, la medicina tradicional china tiene un papel importante en el tratamiento de los tumores malignos debido a sus efectos significativamente mejorados y a sus menores efectos secundarios (6). El gecko, una de las medicinas tradicionales chinas más populares, se ha utilizado como fármaco crudo para tratar los tumores malignos en la práctica clínica (7-9). Los péptidos crudos de gecko y el extracto de etanol de gecko pueden inducir la apoptosis en las células humanas de CHC y ejercer una actividad antitumoral en ratones portadores de ascitis H22, lo que se demostró en nuestros estudios anteriores (10,11). El objetivo del presente estudio fue examinar el efecto apoptótico y el mecanismo subyacente de la mezcla de péptidos de gecko (GPM) en líneas celulares de carcinoma de hígado humano HepG2 in vitro.

Materiales y métodos

Materiales y reactivos médicos

El gecko japonicus se adquirió en BozhouYonggang Medicinal Herbs Factory Co. (Anhui, China). La línea celular de HCC humana HepG2 fue presentada por el Medical Science ResearchInstitute of Henan (Henan, China).

El bromuro de metiltiazolil-tetrazolio (MTT) y el Hoechst 33258 se compraron a Sigma (St. Louis, MΟ, EE.UU.).El kit de ensayo de la actividad de la caspasa se compró al BeyotimeInstitute of Biotechnology (Beijing, China). El anticuerpo primario contra el factor inductor de la apoptosis (AIF) se compró a BosterInc. (Wuhan, Hubei, China), y el anticuerpo contra la β-actina se adquirió en Proteintech (Wuhan, Hubei, China). El anticuerpo primario contra el citocromo c (Cyt c) y el anticuerpo secundario conjugado con ratón o conejo se compraron a Zhongshan GoldenBridge Biotechnology Co. (Pekín, China).

El lector de microplacas era un producto de BioTekInstruments, Inc. (Winooski, VT, Estados Unidos). Los microscopios de fluorescencia e invertido BX41 eran producto de Olympus (Tokio, Japón).

Preparación de GPM

Los polvos de salamanquesa (100 g) se mezclaron con 400 m de agua bidestilada y se convirtieron en un homogeneizado. Tras la centrifugación a 5.600 × g durante 5 minutos, se recogió el precipitado y se sumergió en 400 ml de solución de etanol al 55%. El sobrenadante se obtuvo tras la centrifugación a 5.600 × g durante 5 minutos, y se evaporó a presión reducida a 55°C. Posteriormente, se recogieron polvos amarillos tras la liofilización del líquido residual. Se utilizó cromatografía de filtración en gel (SephadexG-25) para purificar los polvos amarillos y, finalmente, se recogió elGPM.

Cultivo de células y observación morfológica

Las células HepG2 se cultivaron en medio de Dulbecco modificado de Eagle suplementado con 10% de suero bovino fetal, 100 U/ml de penicilina y estreptomicina a 37°C en un incubador humidificado al 5% de CO2. El medio de cultivo se sustituyó cada 2 días y las células en fase de crecimiento logarítmico se utilizaron para los siguientes experimentos. Las células HepG2 (3,0×104células/ml) se incubaron con varias concentraciones de GPM durante 24 horas. Se observaron las células y se capturaron imágenes con un microscopio invertido de contraste de fase para detectar los cambios morfológicos.

Ensayo MTT

Se sembraron células HepG2 en una placa de 96 pocillos a una densidad de 6,0×103 células/pocillo. Se añadieron diferentes concentraciones de GPM y 0,003 mg/ml de fluorouracilo (5-Fu) a cada pocillo.Tras la incubación durante 20, 44 y 68 h, respectivamente, se añadieron 20 µl del reactivoMTT (5 mg/l) por pocillo y se incubaron durante otras 4h. El sobrenadante se sustituyó por 200 µl de dimetilsulfóxido y se midió la absorbancia (A) a 490 nm con un lector de microplacas ELX800 Universal. La tasa de inhibición de la proliferación celular (IR) fue la siguiente IR = (1-AGPM/Control) ×100%.

Tinción con Hoechst 33258

Tras el cultivo de una noche en una placa de 6 pocillos, las célulasHepG2 se trataron con varias concentraciones de GPM (0,0,06 o 0.08 mg/ml) y 0,003 mg/ml de 5-Fu en medio de cultivo fresco a37°C durante 24 h. Las células se lavaron dos veces con fosfato-bufferedsalina (PBS) y se tiñeron con la solución de tinción Hoechst 33258 (10µg/ml). Tras 15 minutos de incubación en la oscuridad, las células se lavaron dos veces con PBS frío y se examinaron con el microscopio de fluorescencia.

El análisis de la actividad de la caspasa

La determinación de la actividad de la caspasa 3 y la caspasa 9 se realizó con el kit de ensayo de la actividad de la caspasa, siguiendo el protocolo del fabricante. Tras la exposición a varias concentraciones de GPM (0, 0,06 o 0,08 mg/ml) y 0,003 mg/ml de 5-Fu durante 24 h, las células se cosecharon y se resuspendieron en tampón de lisis. Posteriormente, las células se incubaron en el tampón de lisis durante 20 minutos y se centrifugaron a 16.000 × g a 4°C durante 3 minutos. Se recogieron los sobrenadantes y se determinaron los niveles de proteínas mediante el método Bradford, y se midieron las actividades de la caspasa 3 y la caspasa 9 mediante el tampón de reacción (que contiene ditiotreitol) y los péptidos sustrato de la caspasa Ac-DEVD-pNA y Ac-LEHD-pNA, respectivamente. Los valores obtenidos en la densidad óptica a 405 nm se expresaron como:AGPM/AControl.

Análisis de Western blot

Las células HepG2 se trataron con GPM (0, 0,06 o 0,08mg/ml) y 0,003 mg/ml de 5-Fu durante 24 h, respectivamente. Brevemente, las células fueron tratadas con tampón de lisis en hielo durante 30 minutos, y fueron centrifugadas a 13.000 × g durante 30 minutos a 4°C. La concentración de proteínas se determinó por el método de Bradford. Las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE al 12% y se transfirieron a una membrana de PVDF, que se bloqueó con leche seca desgrasada al 5% en PBS durante 1 hora a 37°C, se lavó 3 veces con solución salina tamponada con Tris que contenía 0,1% de Tween-20 (TBST) durante 15 minutos y se incubó con los anticuerpos primarios: Caspasa-3 (nº cat. sc-7148; 1:200, policlonal de conejo anti-humano), caspasa-9 (nº cat. sc-8355; 1:200, policlonal de conejo anti-humano), Cyt c (nº cat. sc-13156; 1:500, monoclonal de ratón anti-humano), AIF (cat. no. PB0388; 1:200, policlonal de conejo anti-humano) y β-actina (cat. no. 66009-1-Ig;1:5.000, monoclonal de ratón anti-humano) durante la noche a 4°C.Posteriormente, las muestras se lavaron con TBST durante 30 minutos, y la membrana se incubó con los correspondientes anticuerpos secundarios durante 1 h. La quimioluminiscencia se detectó con ECL Plus (Beyotime Institute of Biotechnology).

Análisis estadístico

Los datos experimentales se representan como media ±desviación estándar. Las diferencias entre los grupos se examinaron con un análisis de varianza de una vía utilizando el sistema SPSS 19.0 (IBM Corp., Armonk, NY, EE.UU.). Se consideró que P<0,05 indicaba una diferencia estadísticamente significativa.

Resultados

El GPM inhibe la proliferación de las células HepG2

El efecto del GPM sobre el crecimiento de las células HepG2 se evaluó mediante el ensayo MTT. Los resultados mostraron que el GPM inhibió significativamente la proliferación de las células HepG2 de forma dependiente de la dosis y el tiempo (Fig. 1). Las células tratadas con GPM mostraron una morfología redondeada, encogimiento y pérdida de adhesión (Fig. 2).

Efectos de GPM en la morfología del núcleo

La morfología apoptótica de las células se identificó mediante la tinción con Hoechst 33258. Como se muestra en la Fig. 3, también se observaron cambios morfológicos en las características apoptóticas, como la condensación nuclear, la condensación cromosómica y los cuerpos granulares apoptóticos en las células tratadas con GPM mediante microscopía de fluorescencia.

Efectos de GPM en la actividad de las caspasas

Como iniciadoras y ejecutoras de la muerte celular, las cisteína proteasas tienen un papel importante en el proceso apoptótico(12). Como se muestra en la Fig. 4, el tratamiento con GPM provocó un aumento significativo, dependiente de la dosis, de la actividad de la caspasa 3 y la caspasa 9, lo que sugiere un efecto apoptótico de la GPM en las células HepG2.

Efectos de la GPM en los niveles de expresión de las proteínas apoptóticas

Como se muestra en la Fig. 5, el western blotting demostró que la liberación de Cyt c y AIF de la mitocondria al citosol aumentó, mientras que los niveles de expresión de la caspasa-3 y la caspasa-9 fueron regulados por el tratamiento con GPM de forma dependiente de la dosis. Los cambios en las proteínas fueron significativamente diferentes en comparación con el grupo de control (Fig. 6) (P<0,05).

Discusión

En las últimas décadas, la incidencia del cáncer ha aumentado notablemente, lo que causa graves daños a la salud humana(13). Aunque las estrategias terapéuticas contemporáneas han mostrado una evidente capacidad anticancerígena, los efectos secundarios graves siguen siendo inevitables. La búsqueda de nuevos agentes antitumorales que sean más eficaces pero menos tóxicos ha atraído cada vez más atención (14).La extracción de péptidos de medicinas naturales para la terapia del cáncer ha sido ampliamente reportada en todo el mundo y es prometedora en el tratamiento del cáncer. Los péptidos podrían desempeñar varias funciones, como la inhibición de la proliferación de tumores, la detención del ciclo celular, la supresión de la angiogénesis tumoral y la inducción de la apoptosis (15). La salamanquesa se ha utilizado ampliamente en la medicina tradicional china durante cientos de años. En nuestros estudios anteriores, los péptidos crudos de gecko mostraron una eficaz actividad antitumoral en ratones portadores de H22 y en la línea celular HepG2 (16,17). Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue revelar el mecanismo molecular subyacente por el que el GPM induce la apoptosis en la línea celular de HCC humana HepG2.

En el presente estudio, el ensayo MTT reveló que el GPM podía inhibir el crecimiento de las células HepG2 de forma dependiente de la dosis y el tiempo. Otros experimentos demostraron que esta inhibición se debía al tratamiento con GPM, que inducía una muerte celular dependiente de la dosis con cambios morfológicos típicos. Estos datos sugieren que la GPM puede ser un agente potencialmente eficaz para el tratamiento del cáncer. Mediante la tinción con Hoechst 33258, se demostró que la muerte celular inducida por la GPM en las células HepG2, que pertenece a la apoptosis, para los niveles de expresión de la caspasa-3 y la caspasa-9 se incrementó tras el tratamiento con GPM. El análisis de Western blotting también demostró que el GPM podía estimular la liberación de Cyt c y AIF de las mitocondrias al citosol, lo que sugiere que la apoptosis inducida por el GPM en las células HepG2 está mediada por la vía apoptótica mitocondrial.

La apoptosis es el principal mecanismo de control por el que las células mueren en numerosas condiciones, como la reparación incorrecta de daños en el ADN (18). Este proceso celular autodestructivo es fundamental para el desarrollo de los órganos, la remodelación de los tejidos, la regulación inmunitaria y varias enfermedades (19). Numerosos agentes antitumorales ejercen sus efectos terapéuticos induciendo la apoptosis (20-24). Las mitocondrias tienen un papel esencial en la regulación de la apoptosis celular, y hay ciertas proteínas que están estrechamente asociadas con la apoptosis celular en la intermembrana (25).

La ultraestructura mitocondrial es normal durante la apoptosis celular, pero su función ha cambiado significativamente.La disfunción mitocondrial induce la apertura de los poros de transición de permeabilidad mitocondrial y libera proteínas mitocondrialesapoptógenas, como AIF (26) y Cyt c (27). Normalmente, las proteínas AIF y Cyt c se localizan en el espacio intermembranal de las mitocondrias, mientras que bajo la acción de varios AIF, se liberan de las mitocondrias al citoplasma. El AIF se transfiere finalmente al núcleo, provocando los cambios característicos de la apoptosis. AIF fue la primera proteína descubierta que mediaba la muerte celular independiente de las caspasas (28). El Cyt c se libera en el citosol e induce la apoptosis dependiente de caspasas, lo que lleva a la activación de las caspasas y a la apoptosis (29,30). Aunque la apoptosis inducida por AIF no depende de la caspasa, existe una acción cruzada, sinergia e incluso antagonismo entre AIF, caspasa y Cyt c. Debido a las diversas señales de muerte y tipos de células, la regulación de la apoptosis celular se realiza en realidad a través de diversas interacciones y de toda la red de señales, que requieren un estudio más profundo.

La caspasa, una familia de cisteína proteasas, es una sección integral de la vía apoptótica. La inducción de la apoptosis está asociada a la activación de la caspasa (31). La caspasa-3 se encuentra en la parte inferior de la apoptosis celular, y la caspasa-9 es la caspasa apical en la vía de la apoptosis iniciada por la mitocondria (32). La activación de la caspasa-3 se correlaciona con la activación de la caspasa-9 (33).La liberación de Cyt c desencadena la activación de la caspasa-9 mediante la formación del apoptosoma. La activación posterior de la caspasa-9 iniciadora provoca la ruptura de la caspasa-3 efectora, que posteriormente activa la DNasa y provoca la fragmentación del ADN en el núcleo (34). En resumen, la caspasa-3 es una caspasa ejecutora que puede ser activada por la siguiente vía mitocondrial que implica la activación de la caspasa-9 debido a la liberación de Cyt c al citosol (35), causando finalmente la muerte celular programada.

En conclusión, el GPM posiblemente indujo la muerte celular apoptótica en las células HepG2 mediante la activación de la vía apoptótica mitocondrial. Estos resultados demuestran que el GPM puede ser un agente terapéutico potencial para el tratamiento del CHC.

Agradecimientos

El presente estudio fue apoyado por una subvención de los Programas Clave para el Desarrollo de la Ciencia y la Tecnología de la Provincia de Henan (no. 142102310031).

Glosario

Abreviaturas

Abreviaturas:

GPM	mezcla de péptidos de geco
Cyt c	citocromo c

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