Los agonistas de los receptores adrenérgicos alfa-2 bloquean el restablecimiento de la búsqueda de cocaína inducida por el estrés

Experimento 1. Efectos de la clonidina, la lofexidina y la guanabenz sobre la liberación de NE inducida por los golpes de pie

Sujetos

: Efectos de la clonidina, la lofexidina y el guanabenz sobre la liberación de NE inducida por los golpes de pie

Sujetos

Los sujetos eran ratas macho Long-Evans (Charles River, Quebec) que pesaban entre 300 y 350 g al comienzo del experimento. Durante todo el experimento, los animales se alojaron en una sala de colonias con humedad y temperatura controladas y con un horario de luz y oscuridad invertido (luces encendidas a las 17.30-05.30 horas) y tuvieron libre acceso a comida estándar para ratas de laboratorio y a agua. Los procedimientos experimentales siguieron las directrices del CCAC y fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Concordia.

Cirugía

Antes de la cirugía, las ratas fueron anestesiadas con pentobarbital sódico (65 mg/kg, i.p.) y se les inyectó sulfato de atropina (0,6 mg/ml; 0,2 ml/rata, SC) y antibiótico (Penlong, Rogar/STB Inc.; 0,1 ml/rata, i.m.). Se implantaron cánulas guía (calibre 20; Plastics One) para la posterior inserción de las sondas de diálisis; una se colocó en PFC y otra en AMG en hemisferios opuestos. Los animales utilizados para estudiar los efectos del guanabenz recibieron una única cánula guía dirigida al PFC. El hemisferio en el que se implantaron las respectivas cánulas guía se contrabalanceó entre los tratamientos. Las coordenadas estereotáxicas utilizadas (relativas al bregma y a la superficie del cráneo) fueron las siguientes AMG, AP -3,0 mm, ML ± 4,5 mm, DV -6,7 mm; PFC, AP + 3,2 mm, ML ± 0,5 mm, DV -1,5 mm (Paxinos y Watson 1997). Tras la inserción, el eje de la sonda de diálisis se extendía 1 mm desde las cánulas guía. Las cánulas guía implantadas se fijaron al cráneo con tornillos de acero inoxidable y cemento dental. Las cánulas guía se cerraron con obduradores atornillados. Todos los animales fueron devueltos a la sala de colonias para un período de recuperación no inferior a 1 semana antes de las pruebas.

Microdiálisis

La microdiálisis se llevó a cabo en cuatro cámaras de pruebas hexagonales (42 × 39 × 33,5 cm) construidas con plexiglás con techos de madera y suelos de barras de acero inoxidable. Se colocaron cortinas oscuras alrededor de cada cámara y la iluminación se proporcionó en un ciclo invertido mediante bombillas de techo (15 W). La sonda de diálisis consistía en una longitud de 1,8 mm (AMG) o 3,5 mm (PFC) de membrana de diálisis semipermeable (Spectra/Por; 240 μm de diámetro exterior, 13000 M.W. de corte), cerrada en un extremo y unida en el otro a una longitud de 19 mm de tubo de acero inoxidable de calibre 26. Un tubo de PE-20 de 40 a 50 cm de longitud conectaba el otro extremo del eje de acero inoxidable a una rótula de infusión situada encima de la cámara de pruebas que, a su vez, estaba conectada mediante un tubo de PE-20 a una bomba de infusión de velocidad variable. Un tubo de sílice fundida de pequeño diámetro se extendía internamente a través de la sonda, con un extremo descansando a 0,5 mm de la punta de la sonda y el otro extremo saliendo del tubo de PE 35 cm por debajo del eslabón giratorio de infusión. La longitud externa del tubo de PE-20 estaba protegida de los daños por carcasas de resorte de acero. Las sondas se diseñaron de forma que toda la longitud de la membrana semipermeable se extendiera por debajo de la punta de la cánula guía.

Se utilizaron escuadrones separados de animales para examinar los efectos de cada uno de los fármacos probados. Dentro de cada escuadrón, cada animal fue asignado aleatoriamente a la condición de tratamiento. Los animales que recibieron inyecciones de vehículo se ejecutaron en cada escuadrón, pero se combinaron en un solo grupo para el análisis estadístico. Los tamaños finales de los grupos (PFC/ AMG) fueron los siguientes: vehículo (n = 15/17), clonidina 20 μg/kg (n = 7/6), clonidina 40 μg/kg (n = 9/5), lofexidina 75 μg/kg (n = 6/6), lofexidina 150 μg/kg (n = 5/6), guanabenz 640μg/kg (n = 4, PFC). A excepción de los animales que recibieron guanabenz, todos los sujetos se dializaron dos veces, una en la PFC y otra en la AMG con un intervalo de 3-4 semanas entre las pruebas.

Las sondas se insertaron el día anterior al inicio de las pruebas de microdiálisis. Para evitar la oclusión, se perfundió LCR artificial (145 mM de Na+, 2,7 mM de K+, 1,22 mM de Ca2+, 1,0 mM de Mg2+, 150 mM de Cl-, 0,2 mM de ascorbato, 2 mM de Na2HPO4, pH 7,4 ± 0,1) durante la noche a una velocidad de 0,06 μl/min. El muestreo del dializado y la monitorización de la actividad comenzaron a la mañana siguiente. La velocidad de flujo del dializado se aumentó a 0,6 μl/ min, y se recogieron muestras de dializado de referencia (∼12 μl/ muestra) cada 20 min. Las muestras se recogieron hasta que se alcanzó una línea de base estable, definida como un mínimo de tres muestras consecutivas en las que los niveles de NE del dializado variaron en ±10%. Tras el establecimiento de niveles estables de NE en la línea de base, todos los animales recibieron una inyección i.p. (1 ml/kg) del fármaco o vehículo apropiado, que se administró 40 minutos antes de un período de 10 minutos de choques de pie. Los choques se administraron en un programa de tiempo variable con un intervalo medio de 40 segundos (rango de 10-70 segundos); cada choque (0,6 mA) tenía una duración de 0,5 segundos. Se recogieron muestras durante otros 120 minutos (6 muestras). Las muestras se analizaron inmediatamente utilizando uno de los dos sistemas similares de cromatografía líquida de alto rendimiento con detección electroquímica (HPLC-EC). Las muestras (10 μl) se cargaron en columnas de fase inversa (15 × 0,46 cm; HAISIL C18, 5 μm; Sci. Products & Equipment, Concord, Ontario) a través de puertos de inyección manuales (Reodyne 7125; bucle de 20 μl); las corrientes de reducción y oxidación para el NE, el ácido dihidroxifenilacético (DOPAC), el ácido 5-hidroxindolacético (5-HIAA) y el ácido homovanílico (HVA) se midieron con detectores coulométricos ESA de doble canal (Coulochem 5100, con una célula de acondicionamiento modelo 5021 y una célula analítica modelo 5011, Sci. Products & Equipment). Las corrientes de NE se midieron independientemente de las de DOPAC y HVA utilizando canales separados de los detectores Coulochem. Las fases móviles (acetato de sodio 36 mM, SOS 3,1 mM, EDTA 100 μM, acetonitrilo al 5%, ajustado a pH 3,7 mediante ácido acético glacial) se hicieron circular a través de cada sistema cerrado a un caudal de 1,4 ml/min mediante bombas HPLC Waters 510. Los picos obtenidos para NE, DOPAC y HVA fueron integrados y cuantificados por el Sistema de Datos de Cromatografía EZChrom (Equipo Sci. Products &). Las muestras de dializado de ratas individuales se analizaron siempre con el mismo sistema HPLC-EC, y la asignación de animales a cada sistema se contrabalanceó en todos los grupos de tratamiento. Se retiró la comida de las cámaras antes del muestreo, pero se dispuso de un tubo para beber agua. Al finalizar la prueba, la confirmación de la colocación correcta de la sonda se determinó mediante el examen de secciones de 30 μm cortadas a través de los lugares de colocación de la sonda teñidas con violeta de Cresilo.

Experimento 2: Efectos de la clonidina en la reinserción inducida por el choque de pies y la cocaína

Sujetos

Los sujetos eran 25 ratas Long-Evans macho (Charles River, Quebec) que pesaban entre 350 y 425 g al inicio del experimento. Los animales se mantuvieron como se describe en el Experimento 1.

Cirugía

Los animales se prepararon para la cirugía como se describe en el Experimento 1. Se implantó un catéter intravenoso (Dow Corning) en la vena yugular derecha. Se introdujo en la vena un tubo de silicona de 3 cm de longitud (diámetro interior de 0,30 mm, diámetro exterior de 0,64 mm) y se conectó con un tubo termorretráctil a un tubo de silicona de 9 cm de longitud (diámetro interior de 0,51 mm, diámetro exterior de 0,94 mm) que se pasó por vía subcutánea hasta la parte superior del cráneo. El catéter se fijó a la vena con suturas de seda y salió a un conector (una cánula modificada de calibre 22; Plastics One, Roanoke, VA) que se montó en el cráneo con tornillos de joyero y cemento dental; se colocó una tapa de plástico sobre la abertura de la cánula. Se dejó que los animales se recuperaran de la cirugía durante 1 a 2 semanas.

Aparato

Las cámaras de autoadministración utilizadas en los experimentos estaban equipadas con una palanca retráctil (Med Associates, St Albans, VT) y una palanca «ficticia» no retráctil. Ambas palancas estaban situadas a 9 cm del suelo. Una bomba de infusión (Razel Scientific Instruments, Stamford, CT) se activaba con las respuestas de la palanca retráctil o «activa». Las respuestas en la palanca falsa se registraron pero no dieron lugar a la activación de la bomba. La solución de fármaco se administró durante un período de 10 s en un volumen de 65 μl. A lo largo del periodo de infusión, se iluminó una luz blanca de estímulo justo encima de la palanca activa y se registraron respuestas adicionales durante este tiempo, pero no dieron lugar a la reactivación de la bomba. Cada cámara de autoadministración estaba equipada para suministrar un electrochoque de corriente constante, intermitente e ineludible a través de un codificador al suelo de la rejilla (generador Grason-Stadler #E1064GS o Med Associates). El footshock se administró durante 15 minutos según un programa de tiempo variable con un intervalo medio de 40 segundos (rango de 10-70 segundos). Cada descarga (0,6 mA) tenía una duración de 0,5 segundos. Se ha comprobado que esta intensidad de los choques de pie, utilizando nuestro aparato, es la mínima necesaria para inducir una reinserción fiable.

Fármacos

El HCl de cocaína se obtuvo de BDH Chemicals (Toronto, Canadá) y se disolvió en solución salina fisiológica. El HCl de clonidina se adquirió de Sigma (St Louis, MO) y se disolvió en solución salina fisiológica y se inyectó i.p. (0, 20 y 40 μg/kg).

Procedimiento

Fase 1: Entrenamiento. Se entrenó a las ratas para que se autoadministraran HCl de cocaína (0,5 mg/kg/infusión, i.v.) en un programa de refuerzo de proporción fija-1 durante una sesión diaria de autoadministración de 3 horas. Cada día, la mitad de los animales fueron llevados a las cámaras operantes para su sesión de autoadministración por la mañana, aproximadamente tres horas después de apagar las luces, y la mitad de los animales fueron llevados a las cámaras por la tarde, aproximadamente siete horas después de apagar las luces. El grupo de animales asignado a las sesiones de la mañana y de la tarde se alternaba diariamente para que, al final del entrenamiento, todos los animales hubieran recibido el mismo número de sesiones de autoadministración en ambos momentos. Era importante que todos los animales tuvieran una experiencia similar de autoadministración a primera y a última hora del día, ya que durante la fase 2 todos los animales recibían sesiones de extinción por la mañana, seguidas de una sesión de prueba que solía tener lugar por la tarde. Al principio de cada sesión, se encendía una luz roja de la casa durante 10 segundos antes de introducir la palanca retráctil en la jaula. La luz situada justo encima de la palanca activa se encendía durante los 30 segundos siguientes a la presentación de la palanca. La luz de la casa permaneció iluminada durante toda la sesión. Como se indicó anteriormente, las respuestas en la palanca activa dieron lugar a la activación de la bomba de infusión y a la iluminación de la luz situada encima de la palanca durante los 10 segundos de administración del fármaco. Se registraron las pulsaciones adicionales de la palanca durante el periodo de administración del fármaco, pero no dieron lugar a la reactivación de la bomba. Las condiciones de entrenamiento se mantuvieron durante 10 a 12 días. Al final del entrenamiento, se dejó a los animales sin perturbarlos en la sala de la colonia durante 7 a 13 días. Posteriormente, se procedió a la extinción y a la prueba. En este experimento y en el 3B, se asignaron grupos de animales a diferentes dosis de los fármacos de prueba. A continuación, todos los animales de cada grupo fueron sometidos a tres condiciones de prueba: solución salina, cocaína y choque de pies.

Fase 2: Extinción y prueba. Durante la extinción y las pruebas, que tuvieron lugar durante cuatro días consecutivos, los animales fueron alojados 24 horas al día en las cámaras de autoadministración. Los animales disponían libremente de comida y agua, excepto durante las sesiones diarias de extinción y prueba. Los animales fueron llevados a las cámaras en la noche anterior al primer día de extinción y prueba. Dado que durante la fase de entrenamiento se realizaron dos grupos distintos de ratas cada día, un grupo de animales fue sometido a pruebas en los primeros cuatro días de la fase 2 y el otro grupo de animales fue sometido a pruebas en los cuatro días siguientes. Durante la extinción y las pruebas, se mantuvieron todas las condiciones presentes durante el entrenamiento, excepto que las presiones de la palanca no daban lugar a infusiones de cocaína.

En éste y en todos los experimentos posteriores de reinserción, los animales recibieron varias sesiones diarias de extinción de 1 hora, separadas por periodos intermedios en los que se retiró la palanca. El día 1, los animales recibieron cuatro sesiones de extinción; los días 2-4, los animales recibieron de dos a tres sesiones de extinción, suficientes para establecer un nivel de respuesta de referencia de 15 o menos respuestas en una hora, seguidas de una sesión de prueba de 180 minutos. La duración de los periodos intermedios se mantuvo constante para cada experimento y correspondió a la demora necesaria para la absorción de la droga entre las inyecciones de pretratamiento y el inicio de la prueba. En el presente experimento, la duración de los períodos intermedios fue de 40 min.

En la prueba, grupos separados de animales fueron pretratados con 0, 20 o 40 μg/kg, i.p., de clonidina antes de cada una de las tres pruebas de reinserción (solución salina, cocaína y footshock), administradas en días consecutivos y en un orden contrabalanceado. La clonidina se inyectó 40 minutos antes de insertar la palanca. Para las pruebas de cebado con solución salina y cocaína, los animales recibieron una inyección i.p. no contingente de solución salina o cocaína (20 mg/kg) 5 minutos antes de la inserción de la palanca. Para las pruebas de choque de pies, los animales fueron expuestos a un breve estrés de choque de pies intermitente de 15 minutos inmediatamente antes de la inserción de la palanca. Las sesiones de prueba tenían una duración de 3 horas. La dosis de cocaína y los parámetros del footshock se eligieron sobre la base de trabajos anteriores de este laboratorio (Erb et al. 1996; Erb et al. 1998; Shaham et al. 1998). Las dosis de clonidina se eligieron sobre la base de experimentos de reinserción que hemos realizado con ratas entrenadas con heroína (Shaham et al. 2000).

Experimento 3A: Efectos de la lofexidina sobre las altas tasas de respuesta a la sacarosa

Debido a que el perfil farmacológico de la lofexidina no ha sido tan bien caracterizado como el de la clonidina, se realizó un experimento para establecer si, y a qué dosis, la lofexidina induce déficits de rendimiento. Las dosis en las pruebas de reinserción se eligieron sobre la base de los resultados obtenidos en este experimento.

Sujetos

Los sujetos eran 8 ratas macho Long-Evans (Charles River, Quebec) que pesaban 400-550 g al comienzo del experimento. Las ratas se utilizaron previamente en un experimento destinado a estudiar la reintegración de la búsqueda de sacarosa inducida por golpes de pie (Buczek et al. 1999). Los animales se mantuvieron en condiciones similares a las descritas en el Experimento 1.

Aparato

Cada cámara de autoadministración estaba equipada con dos palancas fijas, centradas simétricamente en un panel lateral, a 5 cm del suelo. Las respuestas en una palanca, la palanca «activa», activaban una bomba (Razel Sci. Stamford, CT). Las respuestas en la otra palanca, la palanca «ficticia», se registraron pero no tuvieron consecuencias. La activación de la bomba daba lugar a un suministro de 20 segundos de 0,18 ml de solución de sacarosa a un receptáculo de gotas de líquido situado entre las dos palancas. Durante todo el período de suministro de sacarosa, se iluminó una luz blanca de estímulo justo por encima de la palanca activa y se registraron respuestas adicionales durante este tiempo, pero no dieron lugar a la reactivación de la bomba.

Fármacos

El HCl de lofexidina fue suministrado generosamente por Keith Davies, Britannia Pharmaceuticals Ltd., Reino Unido. El fármaco se disolvió en solución salina fisiológica y se inyectó i.p. (0, 80, 120, 160 o 200 μg/kg).

Procedimiento

Los animales que habían aprendido previamente a autoadministrar sacarosa en un estudio diferente (Buczek et al. 1999) recibieron posteriormente cinco sesiones a lo largo de cinco días consecutivos en las que autoadministraron una solución de sacarosa al 30% en un horario FR-1. En las siguientes sesiones diarias, los animales fueron inyectados con vehículo (0 μg/kg) o con lofexidina (80, 120, 160 o 200 μg/kg, i.p.) 60 minutos antes del inicio de la sesión de autoadministración. Todos los animales recibieron todas las dosis de lofexidina en un orden contrabalanceado; la dosis más alta de lofexidina se probó dos veces. Cada sesión en la que los animales fueron tratados con lofexidina fue seguida por una sesión de pretratamiento con solución salina para minimizar la posibilidad de efectos de arrastre del fármaco.

Experimento 3B: Efectos de la lofexidina en la reinserción inducida por el choque de pies y la cocaína

Sujetos

Los sujetos eran 49 ratas Long-Evans macho (34 de Charles River, Quebec; 15 de Harlan Sprague Dawley, EE.UU.) que pesaban 350-400 g al comienzo del experimento. Los animales se mantuvieron como se describe en el Experimento 1. No hubo diferencias evidentes en la respuesta entre los animales de los dos proveedores en ninguna fase del experimento.

Procedimiento

Fase 1: Entrenamiento. Los animales fueron entrenados para autoadministrarse cocaína en las condiciones descritas en el Experimento 2.

Fase 2: Extinción y prueba. En este experimento los períodos intermedios, como se ha descrito anteriormente, tuvieron una duración de 60 min. En la prueba, grupos separados de animales fueron pretratados con 0, 50, 100, 150 o 200 μg/kg, i.p., de lofexidina antes de cada una de las tres pruebas de reinserción (solución salina, cocaína y estrés por choque de pies), administradas en días consecutivos y en un orden contrabalanceado (véase el Experimento 2). La lofexidina se inyectó 60 minutos antes de la inserción de la palanca. Las sesiones de prueba tenían una duración de 3 horas. Las dosis de lofexidina se eligieron sobre la base de los resultados obtenidos en el Experimento 3A.

Experimento 4: Efectos de Guanabenz en la reinserción inducida por el choque de pies y la cocaína

Sujetos

Los sujetos eran 18 ratas macho Long-Evans (Charles River, Quebec) que pesaban 350-400 g al comienzo del experimento. Los animales se mantuvieron como se describe en el Experimento 1.

Fármaco

Guanabenz se adquirió de Sigma (St Louis, MO) y se disolvió en solución salina fisiológica y se inyectó i.p. (0, y 640 μg/kg).

Procedimiento

Fase 1: Entrenamiento. Los animales fueron entrenados para autoadministrarse cocaína en las condiciones descritas en el Experimento 2.

Fase 2: Extinción y prueba. En este experimento los períodos intermedios, como se ha descrito anteriormente, tuvieron una duración de 60 min. En la prueba, los animales fueron pretratados con 0 o 640 μg/kg de guanabenz, i.p., antes de cada una de las dos pruebas de reinserción (sin footshock, footshock o solución salina, cocaína), administradas en días consecutivos (véase el Experimento 2). El guanabenz se inyectó 60 minutos antes de la inserción de la palanca. Las sesiones de prueba tenían una duración de 3 horas. La dosis de guanabenz se eligió sobre la base de su sustituibilidad por 40 μg/kg de clonidina en un procedimiento de discriminación de drogas (Bennett y Lal 1982).

Análisis estadísticos

Los datos de microdiálisis se analizaron mediante un ANOVA de factores mixtos para la concentración de NE extracelular en muestras de dializado de 20 minutos; el factor entre sujetos fue la dosis de clonidina (0, 20, 40 μg/kg), lofexidina (0, 75 o 150 μg/kg) o guanabenz (0 o 640 μg/kg) y la medida repetida fue el tiempo. Las interacciones significativas entre el tiempo y la dosis se sometieron a ANOVAs de una vía para el factor de la dosis en puntos de tiempo específicos. Cuando fue apropiado, se realizaron pruebas post hoc (LSD de Fisher, p < .05) para comparar el vehículo (0 μg/kg) con las condiciones de la droga.

Las dos medidas dependientes en las pruebas de reinserción fueron el número de respuestas en la palanca activa (infusiones + respuestas de tiempo muerto) y el número de respuestas en la palanca inactiva en tres horas. Todos los datos conductuales se presentan como medias ± SEM. Debido a la considerable variabilidad en el número de respuestas realizadas en las diferentes pruebas de reinserción, se utilizaron los estadísticos no paramétricos para muestras relacionadas (Friedman y Wilcoxon) y no relacionadas (Kruskal-Wallis y Mann-Whiney) cuando fue apropiado.

Para el estudio de la sacarosa (Experimento 3A) las medidas dependientes fueron el número de respuestas en las palancas activa (reforzada + respuestas de tiempo de espera) e inactiva y el número de refuerzos obtenidos. Se realizaron ANOVAs de medidas repetidas con la dosis como factor intra-sujeto. Cuando fue apropiado, se realizaron pruebas post hoc (LSD de Fisher, p < .05) para comparar el vehículo (0 μg/kg) con las condiciones de la droga.