Los anticuerpos específicos necesitan una validación específica

Una de las herramientas más utilizadas en la investigación biomédica es el anticuerpo monoclonal. Estas proteínas tienen el potencial de buscar y unirse a cualquier objetivo deseado, y pueden utilizarse para la obtención de imágenes celulares, la clasificación de células, los inmunoensayos y muchas otras aplicaciones.

Pero estos caballos de batalla del laboratorio no siempre funcionan bien. Dependiendo de la naturaleza de su objetivo, un anticuerpo puede ser inconsistente en ciertas pruebas, uniéndose al objetivo equivocado para dar resultados falsos positivos, por ejemplo. Dada la prevalencia del uso de anticuerpos en la investigación, este es un problema potencialmente multimillonario.

Un objetivo importante es desarrollar estrategias de validación de anticuerpos para que los investigadores puedan confiar en que un anticuerpo es adecuado para sus necesidades particulares – y que sus resultados serán reproducibles.

Thermo Fisher Scientific ha desarrollado una plataforma de validación de anticuerpos de dos partes para probar no sólo la especificidad de sus anticuerpos InvitrogenTM (que se unen al objetivo correcto), sino también su idoneidad para diferentes aplicaciones. Sin embargo, la misma prueba no es apropiada para todos los anticuerpos: Thermo Fisher utiliza una prueba apropiada para cada objetivo proteico, dependiendo de su función biológica. Algunos anticuerpos se probarán mejor utilizando CRISPR-Cas9 para eliminar el gen que codifica la proteína diana y comprobar que el anticuerpo ya no se une a nada. Otros anticuerpos podrían probarse mediante inmunoprecipitación seguida de espectrometría de masas para comprobar que se unen a las dianas correctas.

Thermo Fisher está desarrollando y perfeccionando pruebas de validación de anticuerpos basadas en la función biológica del antígeno diana. A continuación se presentan dos estudios de caso de proteínas específicas y sus pruebas de especificidad.

Los anticuerpos para el cáncer

El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) es una proteína bien estudiada: la desregulación en la vía del EGFR está implicada en varios cánceres. Para comprobar si los anticuerpos son específicos del EGFR o de alguna de sus dianas, los investigadores pueden eliminar proteínas críticas de la vía del EGFR y ver cómo cambia la señal de unión de los anticuerpos.

En los últimos años, el sistema CRISPR-Cas9 se ha convertido en la forma más fiable y potente de eliminar un gen. Esto lo hace ideal para probar la especificidad de los anticuerpos dentro de una cascada de señalización. Los investigadores de Thermo Fisher tomaron una línea de carcinoma humano estándar (A-431) y utilizaron un western blot para obtener una línea de base para la señal de unión. A continuación, utilizaron CRISPR-Cas9 para eliminar el gen diana y crear knockouts de EGFR. Un western blot de la proteína extraída de estas células knockout mostró que ya no había señal para la proteína diana (Figura 1).

Otras pruebas confirmaron el resultado. La cascada de señalización aguas abajo del EGFR incluye proteínas como RAS, RAF, MEK y ERK. La activación del EGFR por el factor de crecimiento epidérmico (EGF) conduce a la fosforilación de estas proteínas aguas abajo, que puede detectarse utilizando otros anticuerpos que reconocen estos estados fosforilados. Sin embargo, la adición de EGF a las células con EGFR-knockout no debería dar lugar a ninguna fosforilación aguas abajo. La adición de los mismos anticuerpos que reconocen las dianas fosforiladas no produjo ninguna señal. Por lo tanto, los investigadores de Thermo Fisher están seguros de que el anticuerpo anti-EGFR es específico de la diana.

Un conjunto de modificaciones

En el núcleo de la célula, el ADN está fuertemente empaquetado – envuelto alrededor de las proteínas histonas para formar la cromatina. El estudio de las histonas es difícil, ya que pueden verse afectadas por una serie de cambios químicos, conocidos como modificaciones postraduccionales (PTM). Por ejemplo, los residuos de una histona pueden ganar uno o más grupos metilo, acetilo o fosforilo, cada uno de los cuales tiene un efecto sobre la función celular.

Ciertas técnicas, como la inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP), el western blotting, la inmunofluorescencia y la inmunohistoquímica, utilizan anticuerpos contra PTMs específicos de las histonas para comprender el estado de la histona y su unión. Sin embargo, varias modificaciones de las histonas tienen patrones de unión al ADN similares; un anticuerpo que no haya sido probado rigurosamente contra todos los PTMs de las histonas podría unirse al tipo equivocado y dar un resultado falso-positivo.

Thermo Fisher probó sus anticuerpos específicos contra PTMs de las histonas utilizando un conjunto de péptidos que llevan una variedad de PTMs. Si un anticuerpo es realmente específico para un PTM, se unirá sólo a las manchas que lleven ese PTM. Los investigadores de Thermo Fisher midieron las señales utilizando un factor de especificidad: la intensidad media de todas las manchas que contienen un PTM concreto dividida por la intensidad media de todas las manchas que no lo tienen (Figura 2). Los anticuerpos mostraron un factor de especificidad de 4 a 190 veces mayor para su estado PTM objetivo que para los estados no objetivo, lo que da confianza en que son altamente selectivos.

Thermo Fisher tiene otras siete pruebas de especificidad más allá del knock out genético y las matrices de péptidos. Estas incluyen el uso de ARNi para eliminar la expresión genética, un anticuerpo diferencialmente elevado para verificar de forma independiente la orientación, y la expresión variable natural para confirmar la especificidad. Sólo a través de pruebas tan cuidadosas y rigurosas pueden los investigadores estar seguros de que sus caballos de batalla en el laboratorio son adecuados para su propósito – y que su trabajo resistirá el escrutinio más cercano.

Encuentre notas de aplicación sobre estos anticuerpos de Invitrogen y más sobre el enfoque de pruebas en dos partes de Thermo Fisher Scientific aquí.