Micropropagación de Anthurium spp.

2.1. El cultivo de tejidos de Anthurium

En los métodos de vitropropagación hay varias ventajas sobre la propagación convencional, como el ajuste flexible de los factores que afectan a la regeneración, como el tipo de explante, los niveles de nutrientes y reguladores del crecimiento de las plantas y las condiciones del entorno, la producción de clones en la proporción deseada, la producción continuada durante los cambios estacionales utilizando los métodos de cultivo de tejidos también aumentan la tasa de multiplicación de las plantas. Tipo de explante El éxito del cultivo de tejidos está relacionado con la elección correcta de los explantes. Los cultivos de brotes o puntas de brotes y nódulos son los tipos de cultivo más utilizados en la micropropagación de plantas. Los explantes de las puntas de los brotes y de los segmentos nodales del tallo son adecuados para mejorar la ramificación axilar. La micropropagación de anturios a partir de yemas axilares, puntas de brotes, explantes de láminas, nodos, peciolos y microesquejes se ha utilizado con éxito. Entre estas partes de la planta, las hojas son la fuente de explantes más utilizada en el vitrocultivo de Anthurium. El genotipo de Anthurium juega un papel importante en la vitropropagación. Los estudios mostraron que diferentes genotipos tenían diferentes respuestas a las mismas condiciones de cultivo. Por este motivo, es necesario establecer un procedimiento adecuado para cada variedad de Anthurium que pueda adaptarse a la producción comercial. La selección del tipo de explante para inducir la callogénesis y la orgonogénesis es importante para las plantas. En los estudios de orgonogénesis directa e indirecta, el uso de explantes de hojas jóvenes es importante para el éxito del cultivo. Martin et al. observaron un mayor número de brotes en los explantes de lámina joven marrón que en los de lámina joven verde. Viégas et al. también indicaron la importancia de utilizar hojas marrones nuevas para la inducción de callos. Bejoy et al. informaron de que los explantes extirpados de hojas verdes pálidas mostraban un mejor desarrollo de callos que las hojas marrones pálidas. Atak y Çelik también utilizaron hojas jóvenes marrones y verdes de Anthurium andreanum para evaluar la eficacia de la formación de callos. Consiguieron disminuir el tiempo de formación de callo utilizando explantes de hojas marrones e indujeron el porcentaje de formación de callo un 50% más que el realizado por las hojas verdes. Establecer el cultivo aséptico El segundo paso importante en la micropropagación es obtener el cultivo aséptico del material vegetal. Los sistemas de cultivo aséptico son eficaces para erradicar los contaminantes bacterianos, fúngicos y de insectos. Los protocolos de esterilización utilizados para diferentes fuentes de plantas de Anthurium se indican en la Tabla 1. El NaOCl es el principal material de desinfección utilizado para establecer condiciones de cultivo aséptico de Anthurium. Se ha utilizado NaOCl para las concentraciones difieren de 1%-5% . Los tiempos de incubación de los explantes en hipocloruro de sodio mostraron diferencias debido a sus concentraciones. También es necesario utilizar soluciones desinfectantes adicionales para erradicar los contaminantes fúngicos y bacterianos. El Benomyl, el Cetrimite, la gentamicina y el sulfato de estreptomicina se utilizan eficazmente para este fin.

Medio de cultivo El medio de cultivo influye en la eficacia de la propagación en las aplicaciones de cultivo de tejidos vegetales. Se utilizan compuestos orgánicos, vitaminas y reguladores del crecimiento de las plantas para estimular un crecimiento saludable. La tasa de crecimiento de los tejidos y las respuestas morfogenéticas se ven muy afectadas por las características de los nutrientes incluidos. Hay varios medios basales como Chu , Gamborg’s B5 , Murashige y Skoog , Murashige y Tucker y Nitsch y Nitsch . Estos medios se utilizan con éxito para el establecimiento de cultivos de tejidos de diferentes explantes de varias plantas. En los estudios de cultivo de tejidos vegetales, se han utilizado diferentes combinaciones de cada medio basadas en diferentes concentraciones de macro y micronutrientes para desarrollar protocolos eficientes. Los protocolos de cultivo de tejidos rápidos y eficientes son importantes para la micropropagación de Anthurium tanto como en otras plantas. El éxito del cultivo de tejidos vegetales depende de la composición del medio utilizado. Diferentes combinaciones de macronutrientes como el nitrógeno, el potasio, el calcio, el fósforo, el magnesio y el azufre y micronutrientes como el hierro, el níquel, el cloro, la manganasa, el zinc, el boro, el cobre y el molibdeno cambian la naturaleza del medio. Cada especie de planta tiene su propia composición del medio o debe ser mejorada para obtener mejores resultados. Las modificaciones pueden realizarse en macro y micronutrientes, contenido de azúcar, reguladores del crecimiento de las plantas, vitaminas y otros suplementos de nitrógeno. Los medios MS con algunas modificaciones se han aplicado frecuentemente en el cultivo de tejidos de Anthurium. Las diferencias causadas por el uso de diferentes concentraciones de reguladores del crecimiento de las plantas en combinación con los orgánicos MS utilizados para obtener los tejidos deseados. El nitrógeno es un macronutriente esencial en la vida de las plantas. Es un componente importante de las proteínas y los ácidos nucleicos. El nitrato es la principal fuente de nitrógeno. El NO3- se reduce a amonio tras su absorción. Las plantas tienen la capacidad de utilizar la forma reducida de nitrógeno para su metabolismo. La absorción de nitrato se produce eficazmente en un pH ácido. Pero después de la absorción de nitrato, el medio se vuelve menos ácido. Cuando se absorbe el amonio, el medio se vuelve más ácido. El pH del medio de cultivo de las plantas es importante porque en un medio tamponado, la existencia de ambos iones afecta a la absorción eficaz del nitrógeno. La forma y la cantidad de nitrógeno en los medios tienen efectos significativos en el crecimiento y la diferenciación celular. El control del pH en los medios no es la única razón para utilizar ambos iones, un exceso de iones de amonio es tóxico para las plantas. Los medios que contienen altos niveles de NH4+ también inhiben la síntesis de clorofila. Se sabe que el crecimiento de las raíces es inducido por el NO3- y reducido por el NH4+. Pero la morfogénesis está siendo controlada por la cantidad total de nitrógeno en el medio y necesita tanto de NO3- como de NH4+. Debido al uso óptimo de NH4+: NO3- tiene un papel clave en la morfogénesis, por lo que el equilibrio entre NO3- y NH4+ difiere para diferentes plantas y diferentes tipos de cultivos. Esta situación implica que esta proporción debe ajustarse específicamente para cada especie de planta y para diferentes propósitos. La modificación de la relación NO3- y NH4+ mediante pequeñas alteraciones afecta a la diferenciación y al crecimiento.

Nitsch +0.5mg/l BA

Especie de Anthurium	Fuente de cultivo	Componentes del medio	Aim	Referencia
A.andreanum	Hoja	MS+2,2-4,4µM BA+0,9µM 2,4-D	Brotes adventicios
	Raíz	Modificada MS+2.2µM BA	Brotes múltiples
	Hoja	Nitsch modificado +1mg/l BA+0.1mg/l 2,4-D	Inicio del callo
		Desarrollo del brote
		Nitsch +1,0mg/l IBA+0,04% AC	Raíces
	Hoja	½MS+0.6mg/l 2,4-D+1mg/l BAP	Inducción de callo
		½MS+250mg/l NH4NO3+0,1mg/l 2,4-D+1mg/l BA	Regeneración de brotes
		½MS+1mg/l IBA+0.04% AC	Rayos
	Hojas, espádice	¼MS+1mg/l BAP	Siembras múltiples
		¼MS+1mg/l IBA	Raíces
	Semilla	MS+2mg/l BA+0.5mg/l NAA	Proliferación del callo
	Petiol	½MS+0.1mg/l 2,4-D+0,5 mg/l BA	Callus
		½MS+0,1mg/l 2,4-D+1,0 mg/l BA	Shoot
		½MS+0.5mg/l 2,4-D	Raíz
Anthuriumssp.	Hoja	½MS+1mg/l BA+0.08mg/l 2,4-D	Inducción del callo
		½MS+1mg/l BA	Multiplicación del callo
		½MS +1mg/l BA	Regeneración de brotes
		¼MS+1g/l AC	Rayos
A.andreanumAndré cv.	Hoja, pecíolo	Medio Pietrik modificado+0,36µM 2,4-D+4,4µM BA	Callos
Anthurium andreaumcv Rubun	Microcorte de semilla germinada	MS+4.4µM BA+0,05µM NAA	Siembras múltiples
A.andreanumLind.	Brote apical	MS+0,1mg/l NAA+0,25mg/l BAP	Múltiples brotes apicales
		MS+0.5mg/l BAP+60mg/l sulfato de adenina	Múltiples brotes
		MS+0.5mg/l IAA+2g/l AC	Rayos
	Cultivo de medias anteras	NWT+0,25mg/l 2,4-D +0,02mg/l NAA+1,5mg/l TDZ + 0.75 mg/l BAP	Callus Regeneración de brotes
		NWT+ 0. 2mg/l NAA+1,0 mg/lKIN	Rayos
A.andreanumLindl.cv.	Segmentos nodales	MS+4,44mM BAP+2,89mM GA3	Inducción de brotes
A.andreanum Hort	Lamina	½MS+1,11µM+BA+1,14µM IAA+0,46µM Kin	Inducción de brotes
		½MS+0.44µM BA	Rayos múltiples
		½MS+0,54µM+NAA+0,93µM Kin	Rayos
	Hoja	¼MS+0.88µM BA+0,9µM 2,4-D+0,46µM Kin	Callus
		¼MS+0.88µM BA+0,54µM NAA+0,46µM Kin	Rayos múltiples
		½MS+0,54µM NAA	Rayos
		½MS+0.5mg/l 2,4-D+1mg/l BAP	Siembras adventicias
	Hoja, peciolo	½MS+0.90µM 2,4-D+8,88µM BA	Inducción del callo
		½MS+0,90µM 2,4-D+4,44µM BA	Proliferación del callo
		MS+5.71mM NAA	Raíces
A.scherzerianum	Hoja	½MS+0.08mg/l 2,4-D+1mg/l BAP+1mg/l 2-iP	Callus
		MS+0,5mg/l BAP	Rayos
A.scherzerianumSchott	Hoja	Medida MS+2,5 mM NH4NO3+18µM 2,4-D+6% sacarosa	Inducción del embrión

Tabla 2.

Componentes del medio de cultivo in vitro para cultivares de Anthurium (Modificado de ).

Medio MS utilizado frecuentemente para el cultivo de tejidos de Anthurium y la proporción de NO3- a NH4+ es de 66:34 en este medio. Por esta razón, generalmente se utiliza el medio MS modificado en la organogénesis de Anthurium. Los investigadores han estudiado las modificaciones de la concentración de nitrato de amonio en los medios de Anthurium. Hamidah et al. utilizaron macroelementos MS de media potencia con 2,5 mM de nitrato de amonio para cultivos in vitro. Mientras que Puchooa utilizó 200 mg/L de concentración reducida de nitrato de amonio para el cultivo de callo, y aumentaron la cantidad a 720 mg/L para la regeneración. Dufour y Guérin utilizaron diferentes composiciones de NO3 y NH4 para evaluar los resultados del desarrollo. Según sus resultados, la proporción de 0,37 mostró un mejor crecimiento y desarrollo de la planta. Atak y Çelik prefirieron utilizar sales MS de media potencia con NH4NO3 rebajado a 250 mg/L para la regeneración de brotes. Winarto et al. mejoraron un protocolo para la inducción de callos y la regeneración de plantas y el medio NWT-3 contiene 750 mg/l de NH4NO3. En condiciones de cultivo, el uso de productos químicos sintéticos con actividades fisiológicas similares a las de las hormonas vegetales tiene capacidad para inducir el crecimiento de la planta como se desea. La auxina y las citoquininas son las hormonas más importantes que regulan el crecimiento y la morfogénesis en el cultivo de tejidos vegetales. Su uso combinado promueve el crecimiento de los callos, las suspensiones celulares, el desarrollo de las raíces y los brotes y tiene la capacidad de regular la morfogénesis. Existen auxinas y citoquininas sintéticas además de las naturales. Se utilizaron diferentes combinaciones y concentraciones de reguladores del crecimiento vegetal como el ácido 2,4-diclorofenoxiacético , el ácido naftaleno acético , la bencilaminopurina y la kinetina para indicar la formación de callos a partir de diferentes tipos de explantes de cultivares de Anthurium. En los estudios preliminares, la inducción y la regeneración de callos seguida de la regeneración de brotes y raíces son los principales pasos del cultivo de tejidos de plantas enteras. Como planta comercial importante, el objetivo principal del cultivo de tejidos de Anthurium es desarrollar un protocolo de cultivo de tejidos rápido y más eficaz para acortar el tiempo. Como se indica en la Tabla 2, se utiliza con frecuencia la combinación de 2,4-D y BA en los medios de cultivo para inducir la iniciación de callos a partir de explantes de hojas en diferentes variedades de Anthurium. Asimismo, la adición de BAP y 2-iP al medio de callo ha sido evaluada por diferentes investigadores. Las concentraciones de 2,4-D utilizadas en el medio de callo oscilan entre 0,08 mg/l y 1 mg/l de 2,4-D. Las concentraciones de BA varían entre 0.1 mg/l y 1 mg/l.

Las plantas micropropagadas requieren un sistema radicular desarrollado para resistir las condiciones ambientales externas. El enraizamiento de los brotes tiene lugar in vitro. Por lo tanto, la determinación del tipo y los niveles adecuados de auxinas en los medios requeridos para promover el enraizamiento.

El carbón activado se añade al medio para promover el crecimiento de las raíces. El CA se compone de carbono y se utiliza a menudo en el cultivo de tejidos vegetales para absorber gases y sólidos disueltos. No es un regulador del crecimiento pero tiene la capacidad de modificar la composición del medio. Hay varios usos ventajosos del carbón vegetal en el tipo de cultivo. Estos son la adsorción de los compuestos secretados de los tejidos cultivados, la disminución de las oxidaciones fenólicas, los cambios de pH del medio para optimizar para la morfogénesis, la prevención del crecimiento de callos no deseados, la simulación de las condiciones del suelo debido a la capacidad de promover la formación de raíces, la capacidad de utilizar en la producción de productos vegetales secundarios en condiciones de cultivo . El efecto más importante de la utilización de CA al medio es la disminución rigurosa de las concentraciones de los reguladores del crecimiento vegetal y otros suplementos orgánicos. El CA muestra una mayor capacidad de adsorción de los fenólicos producidos comúnmente por los tejidos heridos, las hormonas vegetales como el IAA, NAA, IBA, BA, kinetina, zeatina y otras hormonas . La propiedad de adsorción del CA cambia con la pureza, el pH y la densidad. Las plántulas de Anthurium propagadas por Atak y Çelik se enraizaron en un medio que contenía CA y se muestran en la figura 1.