Nuevos conocimientos sobre la estructura y la función del apoptosoma

La información estructural temprana fue fundamental para revelar la organización de los dominios del apoptosoma . El apoptosoma humano contiene siete moléculas de Apaf-1 dispuestas simétricamente en una estructura en forma de rueda para formar un eje central compuesto por NODs con siete brazos HD2 extendidos, cada uno de los cuales termina en una región en forma de V que está formada por las dos β-hélices . Los pliegues α/β de los NBD y HD1 unen ADP/dATP entre ellos, mientras que las repeticiones WD40 forman las β-hélices de 7 y 8 hojas . Al contrario de lo que se había sugerido anteriormente, se encontró que las interacciones laterales entre los pliegues α/β de las moléculas adyacentes de Apaf-1 se utilizan para organizar el eje central, mientras que los CARDs N-terminales se sitúan por encima de este anillo, y están desordenados en ausencia de pc-9 (PDB 3J2T) . Sin embargo, recientes estructuras casi atómicas han demostrado que los CARDs de Apaf-1 forman un disco en la superficie del apoptosoma activo en presencia de los CARDs de pc-9, y esta disposición difiere de la encontrada en CED-4 y Dark (Figs. 1 y 2) . La estabilidad del cubo central se mantiene gracias a una compleja red de interacciones α-hélicas, enlaces de hidrógeno y puentes de sal entre módulos adyacentes NBD y HD1 de moléculas vecinas de Apaf-1 . Los contactos WHD/HD1 en protómeros adyacentes parecen apoyar el ensamblaje del apoptosoma con dominios WHD que tienden puentes entre dominios NBD y HD1 adyacentes . Como ocurre en Dark, la hélice ISM en Apaf-1 (α12) se empareja con la hélice α13 a través de extensas interacciones hidrofóbicas para formar un motivo de hélice-bucle-hélice en cada subunidad, que a su vez, interactúan lateralmente con subunidades adyacentes para formar una valla helicoidal que recubre el poro central del anillo .

En las células sanas, los monómeros de Apaf-1 existen en una conformación cerrada e inactiva con el ADP incrustado en una hendidura en la interfaz del NBD-HD1 (PDB 1Z6T, 3SFZ) . Esta conformación cerrada presagia la necesidad de realizar amplios cambios conformacionales en el monómero para facilitar el ensamblaje del apoptosoma. A diferencia de la formación de apoptosomas en C. elegans y Drosophila, el citocromo c liberado de las mitocondrias durante la señalización de la apoptosis se une al Apaf-1 monomérico, lo que desencadena cambios conformacionales que conducen al intercambio de nucleótidos (el ATP o el dATP pueden sustituir al ADP), y a la posterior oligomerización de un Apaf-1 extendido para formar el apoptosoma (Fig. 3) . Para entender los cambios conformacionales que se producen, se necesitan modelos precisos de los estados inactivo y extendido de Apaf-1. Se han determinado dos estructuras cristalinas de monómeros de Apaf-1 inactivos con ADP unido, una de ellas carece de β-propulsores y la segunda carece de los dominios N-terminal CARD para facilitar la cristalización. Sin embargo, el NOD en estas dos formas cristalinas es prácticamente idéntico y esto ha permitido construir un modelo de consenso para todo el monómero de Apaf-1 con ADP unido. Varios grupos han conseguido estructuras casi atómicas del apoptosoma humano utilizando crio-EM de una sola partícula, para proporcionar información sobre la conformación extendida de Apaf-1 en ausencia y presencia de pc-9 (PDB 3JBT, 5JUY, 5WVE; Fig. 3) . Como se predijo, la conformación de Apaf-1 en el eje central, los brazos HD2 y la región reguladora es esencialmente idéntica tanto en los apoptosomas inactivos como en los activos. Estos estudios han proporcionado importantes detalles de los residuos específicos implicados en los contactos de van der Waals entre dominios dentro de las moléculas individuales de Apaf-1, han revelado los residuos críticos para las interacciones entre dominios que estabilizan el apoptosoma activo y han mostrado las interacciones dentro del dominio sensor en forma de V de las hélices β en tándem de 7 y 8 hojas, que forman la superficie de unión del citocromo c

En el apoptosoma de Apaf-1, el sitio de unión al dATP está situado en la interfaz NBD-HD1, y está formado en parte por el bucle Walker A y el bucle entre HD1 y WHD. Mientras que Apaf-1 puede unir ADP en el estado inactivo, existe una pequeña preferencia por utilizar dATP para el ensamblaje del apoptosoma in vitro (revisado en la ref. ), mientras que el ATP es mucho más abundante in vivo (~ 2 mM para ATP frente a 10 μM para dATP). . Parte de la estabilización se produce a través de interacciones entre un residuo de arginina (Arg265) en el NBD, junto con Ser325 y Tyr359 en el HD1 y la molécula de ATP/dATP unida. Una rotación del par NBD-HD1 sobre la α-hélice 20 en el WHD, posiciona el bucle HD1-WHD en el fondo del bolsillo de nucleótidos , lo que permite que el par NBD-HD1 forme interacciones circunferenciales dentro del cubo central durante el ensamblaje . Esto también rompe las interacciones con el WHD que normalmente estabilizan una configuración cerrada .

Sensores β-propulsores y unión del citocromo c

Los «radios» de la rueda del apoptosoma sobresalen hacia fuera del cubo por los dominios HD2 y cada brazo forma la base de la región en forma de V que contiene los dos dominios sensores β-propulsores. En la isoforma más larga de Apaf-1, (Apaf-1XL) que se expresa en la mayoría de los tejidos, las quince repeticiones WD40 forman hélices β en tándem de 7 y 8 hojas y un reciente estudio de crio-EM indicó que esto tiene un nuevo mecanismo de cierre. Esta topología de las hélices β es similar a la encontrada en la proteína que interactúa con la actina (Aip1p), en la que el enlazador de HD2 forma la hebra d de la última hoja de la hélice β de 8 hojas (indicada por la pequeña región azul presente al principio de la hélice de 7 hojas en la Fig. 1a), antes de cruzar para formar la hélice β de 7 hojas . Esta topología fue verificada por una estructura cristalina de Apaf-1 murino a una resolución de 3,0 Å y parece estar conservada en las β-hélices oscuras.

En el apoptosoma de Apaf-1, las β-hélices en forma de V forman el bolsillo de unión del citocromo c, y la interacción con el citocromo c parece estar estabilizada por enlaces de hidrógeno y puentes salinos . Tanto las formas reducidas como las oxidadas del citocromo c pueden interactuar con el apoptosoma para mediar en su activación . Curiosamente, el citocromo c parece interactuar preferentemente con la hélice β de 8 hojas, mientras que se forma una superficie de contacto más limitada con la hélice β de 7 hojas . El citocromo c se resuelve a una resolución de ~ 6 Å en los nuevos mapas, debido al movimiento local y a que la molécula está girada ~ 90°, en relación con un modelo anterior basado en el acoplamiento molecular en un mapa en el que las hélices no estaban resueltas . La mutagénesis dirigida reveló residuos críticos en el citocromo c necesarios para la asociación estable con los β-propulsores de Apaf-1, y algunos de estos residuos (G56, P76, I81) son importantes para la formación del apoptosoma y la subsiguiente activación de las caspasas.

Las moléculas de Apaf-1 truncadas que carecen de las regiones de repetición WD-40 también pueden ensamblarse para formar apoptosomas que son constitutivamente activos, pero se desensamblan con el tiempo . Esto ha sugerido que las hélices β pueden ser algo inhibidoras del ensamblaje a la vez que estabilizan el apoptosoma Apaf-1 . Sin embargo, las hélices β en el apoptosoma Apaf-1 están situadas en radios altos y no interactúan con subunidades adyacentes, ni tampoco con otros dominios del monómero, a excepción del HD2. Por lo tanto, el mecanismo de desestabilización sigue siendo un misterio. Aunque es especulativo, la falta de β-hélices en los apoptosomas truncados podría debilitar las interacciones de HD2 con el cubo central, lo que llevaría a un desensamblaje dependiente del tiempo.

Ahora está claro que la unión del citocromo c provoca una rotación hacia arriba de la región de las hélices β, que interrumpe la conexión entre las hélices β de 7 hojas y el par NBD-HD1 en el monómero inactivo de Apaf-1 , mientras que las hélices β de 7 hojas giran hacia las hélices β de 8 hojas en un movimiento de sujeción . Estos eventos desestabilizan la conformación autoinhibida de Apaf-1 y facilitan el intercambio de nucleótidos promoviendo cambios conformacionales que exponen el bolsillo de unión al ADP para permitir la unión al ATP/dATP . Esto estabiliza el monómero de Apaf-1 en una conformación extendida de manera que pueda interactuar con los protómeros vecinos. Los experimentos de desplazamiento de banda sugieren que el intercambio de nucleótidos y los cambios conformacionales asociados en Apaf-1 pueden ocurrir en respuesta a la unión del citocromo c porque no se detectaron alteraciones significativas en la conformación de Apaf-1 con la adición de dATP en ausencia de citocromo c . En conjunto, estos datos apoyan un modelo secuencial en el que la unión del citocromo c se produce antes del intercambio de nucleótidos, para facilitar la transición de una conformación de Apaf-1 cerrada a una extendida. Además, estos hallazgos indican que las repeticiones WD40 actúan como sensores que desencadenan el ensamblaje inicial del apoptosoma mediante la unión del citocromo c.

Mecanismos posibles de activación de la procaspasa-9

La procaspasa-9 es reclutada por el apoptosoma para formar una holoenzima que aumenta su actividad catalítica . En solución, la pc-9 es un monómero constitutivo cuando no está unida a Apaf-1, mientras que las caspasas activas en general son dímeros . Sorprendentemente, una interacción dimérica entre dos monómeros de pc-9 en una red cristalina promueve la formación de un sitio activo en una subunidad catalítica, mientras que la segunda subunidad permanece en una configuración inactiva (PDB 1JXQ) y un fenómeno similar ocurre en los dímeros de CED-3 a alta concentración . El CARD N-terminal de pc-9 interactúa con el(los) CARD(s) de Apaf-1 para reclutar la procaspasa apical al apoptosoma y esto promueve la activación del dominio catalítico, que está separado del CARD por un largo enlazador (Fig. 2a) . Además, las subunidades p20 y p10 del dominio catalítico también están conectadas por un enlazador que está sujeto a la autodestrucción . Por lo tanto, para entender cómo se activa la pc-9 necesitamos entender el papel de los CARDs y los enlazadores de la pc-9 en el holo-apoptosoma.

Se han propuesto diferentes modelos que explican los mecanismos de activación de la pc-9 por el apoptosoma . El «modelo de dimerización inducida por proximidad» predice que el reclutamiento de moléculas de pc-9 al apoptosoma Apaf-1 puede facilitar la homodimerización, que se cree que conduce a la autoactivación de pc-9 . Sin embargo, hasta hace poco, ninguna evidencia estructural o bioquímica había demostrado que la pc-9 es homodimérica cuando se une al apoptosoma (véase más adelante). El «modelo de conformación inducida» propuso que el apoptosoma Apaf-1 es una plataforma que se une a la pc-9 para facilitar su conformación activa . Modelos recientes sugieren que la activación de la pc-9 está mediada principalmente por la regulación alostérica de la plataforma del apoptosoma. En todos estos modelos, una función primaria del apoptosoma es ensamblar un complejo multimérico entre Apaf-1 y pc-9 CARDs para facilitar la activación de pc-9 aumentando la concentración local del zimógeno . Además, los datos sobre un pc-9 diseñado que es un dímero constitutivo en solución sugieren que el CARD y su enlazador pueden inhibir los dominios catalíticos . Por lo tanto, la formación de un heterodímero de CARD en el apoptosoma puede liberar esta inhibición, sin embargo, esta idea aún no se ha probado.

Si bien la dimerización puede desempeñar un papel clave en la activación, la forma en que esto ocurre en el apoptosoma ha quedado sin explicar y, de hecho, datos recientes han sugerido la posibilidad de un mecanismo de activación más complicado que implica tanto la homodimerización de las moléculas de pc-9 como la formación de un heterodímero de un único dominio catalítico de pc-9 con el NBD de Apaf-1 . Curiosamente, una conformación inactiva del monómero de Apaf-1 no impide la unión de pc-9 a través de las interacciones CARD-CARD, tal y como demuestran los experimentos de desplazamiento de banda . Así, los heterodímeros pc-9/Apaf-1 pueden ser reclutados al apoptosoma en formación como parte de su activación (Fig. 3). Sigue siendo una cuestión abierta si el ensamblaje de Apaf-1 en presencia de pc-9 está guiado por interacciones adicionales entre CARDs en el disco naciente.

Una estructura cristalina inicial reveló un complejo estable 1:1 entre los dominios CARD de Apaf-1 y pc-9 con una interfaz complementaria (conocida como Tipo I), que es indispensable para la activación de pc-9 . Sin embargo, posteriormente se demostró que este complejo estable 1:1 es insuficiente para activar la pc-9 . En su lugar, los CARDs de Apaf-1 y pc-9 forman complejos oligoméricos de mayor orden, estabilizados principalmente por dos de las tres posibles interfaces (conocidas como TipoI, II y III), que también se encuentran en otros complejos del Dominio de la Muerte . La comparación de las interacciones implicadas en el disco CARD-CARD en los apoptosomas CED-4, Dark y Apaf-1, pone de manifiesto cierta conservación de las interfaces de Tipo II y III, encontrándose las interacciones CARD de Tipo I únicamente en el apoptosoma humano . Una estructura cristalina reciente con una resolución de 2,1 Å reveló un complejo heterotrimérico formado por dos CARDs de Apaf-1 con un CARD de pc-9 intercalado. Las interacciones de tipo II que implican residuos en los CARDs de pc-9 (Arg36/ Arg65) y Apaf-1 (Glu78) han demostrado ser críticas para la activación de pc-9 , junto con las interacciones de tipo I descritas anteriormente . Además, un solo residuo (Glu41 en el CARD de Apaf-1) puede formar una interacción bifurcada con un CARD de pc-9 en una interfaz mínima de tipo III . También se demostró que las interacciones adicionales con Lys58 y Lys62 en el CARD de Apaf-1 son necesarias para la activación de pc-9 y pueden ayudar a posicionar los CARDs de Apaf-1 en la plataforma . Por lo tanto, la formación de un complejo CARD heterotrimérico proporciona un medio para atar múltiples dominios catalíticos de pc-9 a la plataforma del apoptosoma.

Dos estructuras de resolución atómica cercana del apoptosoma activo de Apaf-1 han revelado que la arquitectura general de la disposición del disco de Apaf-1 y pc-9 CARD crea un disco inclinado que se asienta en un por encima del eje central (Figs. 2 y 3) . El desajuste de simetría entre el disco y la plataforma da lugar a un posicionamiento acéntrico del disco CARD cuando se ve desde arriba (Fig. 3) . El disco puede describirse como una espiral de pares de Apaf-1 y pc-9 CARDs con cuatro Apaf-1 CARDs formando una «capa» inferior mientras que tres o cuatro pc-9 CARDs están presentes en la superficie superior (Fig. 2b-d). Además, los Apaf-1 CARDs se mueven más lejos de la superficie del cubo central, ya que ascienden en espiral hacia la izquierda y, por lo tanto, tienen diferentes conformaciones de enlace y diferentes interacciones con sus NBDs afines en el cubo central. Los pares Apaf-1 y pc-9 CARD interactúan a través de interfaces de tipo II, y se unen lateralmente alrededor de la espiral principalmente a través de interacciones de tipo I. Sorprendentemente, sólo cuatro de los siete Apaf-1 CARDs interactúan con los pc-9 CARDs en el disco. Esto se debe a que las tres moléculas restantes de Apaf-1 CARD no encajan fácilmente en el patrón de unión de subunidades de la espiral y no pueden continuar la espiral porque sus enlazadores CARD-NBD son demasiado cortos . Los CARDs de Apaf-1 de subunidades adyacentes en el apoptosoma se localizan en una costura (entre las posiciones 1a y 7a), donde la espiral deja de alargarse verticalmente (Fig. 2c, d) . La formación del disco Apaf-1/pc-9 CARD es necesaria para la activación del apoptosoma y los dominios catalíticos de pc-9 están unidos de forma flexible a los CARDs a través de un linker (Fig. 2a) . En una estructura, se visualizó un disco con cuatro CARDs de Apaf-1 y tres CARDs de pc-9, con una densidad débil que indica que un cuarto CARD de pc-9 podría unirse a la parte superior de la espiral helicoidal con una ocupación menor . En una segunda estructura, la configuración predominante del disco contenía 8 CARDs con la conformación de los CARDs en la espiral siendo muy similar entre las dos estructuras resueltas independientemente (ver superposición, Fig. 2d). Las variaciones en el pH y la concentración de sal pueden explicar la diferente ocupación en la octava posición. Por lo tanto, el ensamblaje del apoptosoma promueve el reclutamiento y la concentración local de los CARDs de pc-9, lo que permite la formación de un nuevo oligómero helicoidal con 7 u 8 CARDs.

Un análisis reciente (por MALS y SAXS) mostró que la formación del complejo CARD es dependiente de la concentración y que cantidades iguales de CARDs de Apaf-1 y pc-9 se asocian como pares a través de la interfaz de tipo I más fuerte, con un complejo predominante 3:3 formado a alta concentración en solución . Este complejo CARD se cristalizó y la estructura se determinó a una resolución de 3,0 Å para revelar una espiral zurda de tres pares Apaf-1/pc-9 CARD con una conformación similar a la observada en el apoptosoma pero con algunas diferencias (PDB 5WVC; Fig. 2e) . Sin embargo, el entorno en el cristal es bastante diferente del que se encuentra en el apoptosoma en ensamblaje, debido en parte a los contactos de la red y a la falta de una superficie de nucleación con restricciones impuestas por los enlazadores CARD-NBD. Esto puede explicar las diferencias observadas entre las estructuras helicoidales CARD. Esto incluye la adición de uno o dos CARDs extra a la espiral en forma de disco en el holo-apoptosoma y el hecho de tener cuatro CARDs de Apaf-1 que forman la base del disco, en lugar de tres como se encuentran en solución y en el cristal. Tras la alineación óptima del disco de 8 CARDs con la espiral de 6 CARDs de la estructura cristalina, hay una buena congruencia entre los CARDs en las posiciones 2p, 3a y 4p, con alguna divergencia en la última mitad de la espiral de 6 CARDs (Fig. 2f, g). En particular, el CARD de Apaf-1 en la posición 7a está mal situado verticalmente en una posición intermedia, en ausencia del CARD de Apaf-1 en la posición 1a (Fig. 2g). Así, las interacciones entre la plataforma y el disco CARD son críticas para nuclearse en las espirales más grandes de 7 y 8 CARD que se encuentran en el apoptosoma.

Durante el ensamblaje del disco, la nucleación de la espiral puede ocurrir de diferentes maneras, incluyendo la formación de un heterotrímero CARD compuesto por dos Apaf-1 CARD y un pc-9 CARD, con un Apaf-1 CARD localizado en la base de la espiral (en la posición 1a). La adición posterior de dos pares Apaf-1/pc-9 CARD que interactúan a través de sus interfaces de tipo I puede producirse entonces con un remate final de la espiral por un pc-9 CARD en la posición 8p en algunos casos. Sin embargo, son posibles otras permutaciones dada la naturaleza flexible del enlazador Apaf-1 CARD-NBD, de manera que tres pares Apaf-1/pc-9 CARD «Tipo I» pueden nuclearse secuencialmente desde el núcleo central, con la adición de un Apaf-1 CARD en la base de la espiral (en la posición 1a), durante las primeras etapas del ensamblaje. Es importante destacar que el ensamblaje del disco puede ser cooperativo para mantener el espaciado adecuado de los cuatro Apaf-1 CARDs en el apoptosoma, que forman la base de la espiral .

Para el apoptosoma activo, una diferencia importante es evidente en el cubo central, cuando se comparan las estructuras publicadas (Figs. 3 y 4) . En resumen, la densidad identificada como dominio catalítico de pc-9 (p20/p10) se localiza en el cubo central en un mapa 3D reciente, y se encontró que esta característica está presente en aproximadamente el 50% de los complejos . Además, se visualizó una densidad similar en un mapa anterior de menor resolución del holo-apoptosoma, que permitió un acoplamiento razonable, aunque preliminar, de las subunidades p20/p10; por tanto, la característica observada es reproducible. Sin embargo, esta nueva densidad sólo se ha visualizado a baja resolución, lo que puede reflejar cierta flexibilidad en la unión de las subunidades p20/p10 al núcleo central. En un mapa de resolución casi atómica determinado por el grupo de Yigong Shi, se resolvió una densidad adicional en forma de hoz a una resolución de ~ 7 Å en el cubo central, adyacente al disco CARD. Esta densidad contiene claramente un CARD pc-9 adicional en el centro, que interactúa con dos CARDs Apaf-1 situados a ambos lados, de forma similar a la observada en dos estructuras cristalinas . Sin embargo, esta configuración heterotrimérica sólo pudo resolverse en un 10% de las partículas. Por lo tanto, parece que las condiciones experimentales durante la preparación de la muestra y la congelación de la rejilla pueden influir en la forma en que la pc-9 interactúa con los sitios de unión potenciales en el cubo central, incluyendo la formación de una espiral en forma de disco con un número variable de pc-9 CARDs y en el uso de los sitios de unión que se encuentran adyacentes al disco acéntrico. Cuando las dos estructuras asimétricas recientes del holo-apoptosoma se alinean en base a sus discos CARD, los nuevos picos de densidad localizados en el cubo central se encuentran en ubicaciones bastante distintas (Fig. 4). Mientras que el dominio catalítico del pc-9 (p20/p10) puede estar localizado en dos posiciones (con la más probable mostrada en la Fig. 4c) , la densidad de los tres CARDs está rotada y tiene un perfil diferente visto de lado (no mostrado), cuando se compara con la del dominio catalítico del pc-9 (Fig. 4b, d). El patrón de densidades de los enlazadores CARD-NBD de Apaf-1 permite un mapeo preciso de todos los enlazadores CARD-NBD relevantes en el holoapoptosoma de tres CARDs con seis CARDs ordenados de Apaf-1 (Fig. 4d) . La longitud del enlazador (~ 25-30 Å) y las posiciones relativas de los enlazadores pueden impedir la unión de un módulo de tres CARDs a la posición 1 o 2 del núcleo central. Por lo tanto, parece que hay múltiples sitios en el cubo central que pueden ser utilizados de distintas maneras para unir un pc-9 CARD o un dominio catalítico.

Se ha estimado que la procaspasa-9 se une al apoptosoma con proporciones entre 2-5 zimógenos por 7 moléculas de Apaf-1 , por lo que parece que el número exacto de moléculas de pc-9 unidas al apoptosoma puede variar dependiendo de las condiciones durante el ensamblaje, lo que puede reflejar la naturaleza dinámica de esta máquina proteolítica. Por extensión, parece claro que una sexta o una séptima pc-9 CARD no está unida a sus homólogos de Apaf-1, en relación con los sitios ya documentados en el apoptosoma, lo que puede reflejar una limitación estérica o la necesidad de un oligómero más grande para estabilizar las pc-9 CARD unidas. Es importante destacar que algunos dominios catalíticos de la pc-9 no se ven en los actuales mapas de densidad de crio-EM, debido a su unión flexible a través de largos enlazadores CARD-p20, lo que dificulta el desciframiento y la comprensión de los mecanismos precisos de activación, al tiempo que pone de manifiesto la necesidad de realizar más estudios de moléculas individuales.

La función principal del apoptosoma es activar la pc-9 para que pueda ejecutar la apoptosis. Mientras que los estudios estructurales han proporcionado información sobre el reclutamiento y los requisitos para la activación de la pc-9, una serie de ensayos bioquímicos han demostrado ahora que tanto la dimerización inducida por la proximidad como la regulación alostérica de la pc-9 monomérica son fundamentales para regular la función del apoptosoma y también pueden gobernar la duración de la actividad del apoptosoma. En primer lugar, el reclutamiento de la pc-9 por el apoptosoma aumenta su concentración local para permitir la homodimerización, lo que aumenta su afinidad por el complejo. Curiosamente, una pc-9 no salvable tiene una mayor propensión a la homodimerización y muestra una mayor actividad de la proteasa (escisión de la caspasa-3) dentro del apoptosoma, que la caspasa-9 escindida. Como consecuencia, la escisión del enlace entre subunidades p20/p10 del dominio catalítico reduce la afinidad de la pc-9 por el apoptosoma y, una vez procesada, la caspasa-9 se libera y no se vuelve a unir al apoptosoma. Es importante destacar que estos estudios han demostrado que la homodimerización de la pc-9 es el evento clave requerido para la activación y que el apoptosoma actúa para facilitar este evento . Esto es coherente con los estudios bioquímicos de otras caspasas CARD, como la caspasa-2 y la Dronc, donde la activación inicial requiere la dimerización, en lugar de la escisión del zimógeno . La estabilización de la unión de la pc-9 al apoptosoma no sólo requiere interacciones CARD-CARD, sino interacciones de la subunidad pequeña de la pc-9 (p10) a través de su motivo GCFNF404 para formar homo- y heterodímeros . Lo que no está claro en este momento, es cómo la formación del homodímero de pc-9 afecta a la estabilidad del disco CARD-CARD, ya que los dímeros del dominio catalítico parecen ser bastante flexibles, ya que pueden ser liberados del holo-apoptosoma por trombinólisis dirigida al sitio y no se resuelven en los mapas de crio-EM refinados sin simetría . El motivo GCFNF de la pc-9 también interactúa con un NOD de Apaf-1 para formar heterodímeros pc-9/Apaf-1 que escinden eficazmente la caspasa-3 . Estos datos sugieren que un dominio catalítico de la pc-9, que interactúa directamente con el apoptosoma, puede ser activo. Este sitio activo putativo para la escisión de la caspasa-3 puede corresponder a la nueva densidad observada en el cubo central que se ha interpretado como una molécula p20/p10 y se necesitan más estudios sobre este punto. En conjunto, estos resultados indican que la pc-9 puede tener dos conformaciones activas diferentes dentro del apoptosoma, con uno o posiblemente dos homodímeros unidos al disco CARD y un heterodímero pc-9/Apaf-1 unido al cubo central. Si se tienen en cuenta los holoapoptosomas con tres módulos CARD unidos al cubo central, entonces son posibles al menos seis permutaciones para la disposición de tres a cinco dominios catalíticos pc-9 (Fig. 5). Así, el número de posibles dominios catalíticos pc-9 activos (como homodímeros y heterodímeros) variará en función del número de moléculas pc-9 reclutadas en el apoptosoma, ya que rellenan los posibles sitios de unión mediados por los CARDs de Apaf-1.

Por último, la escisión completa de pc-9 por la caspasa-3 elimina el enlazador entre subunidades y restablece la actividad completa de la caspasa-9, lo que indica que la caspasa-3 también tiene una retroalimentación proteolítica sobre pc-9 que puede amplificar la señal apoptótica . Se ha propuesto un mecanismo similar para la caspasa-2 . Estos estudios bioquímicos han presentado además un modelo de temporizador molecular en el que la velocidad de disociación de la caspasa-9 del apoptosoma viene determinada por una escisión inicial del enlace p20-p10 que reduce su afinidad de unión al apoptosoma . Sin embargo, la disociación completa de la caspasa-9 escindida del holoapoptosoma requeriría la liberación de su CARD del disco o del módulo de tres CARD. Por lo tanto, puede haber una jerarquía para la liberación de las moléculas de caspasa-9 activas que depende del entorno local de sus CARDs. El diseño del disco CARD, con todos los CARDs de pc-9 situados en la superficie superior, también puede facilitar la liberación de la caspasa-9.