Péptidos antimicrobianos: Su función como rastreadores selectivos de infecciones para la obtención de imágenes moleculares

Abstract

Los péptidos antimicrobianos (AMP) son una clase heterogénea de compuestos que se encuentran en diversos organismos, incluido el ser humano, y, hasta ahora, se han aislado y caracterizado cientos de estas estructuras. Pueden describirse como microbicidas naturales, selectivamente citotóxicos para las bacterias, al tiempo que muestran una citotoxicidad mínima hacia las células de mamíferos del organismo anfitrión. Actúan por su atracción electrostática relativamente fuerte hacia las células bacterianas cargadas negativamente y una interacción relativamente débil hacia las células eucariotas del huésped. La capacidad de estos péptidos para acumularse en los focos de infección, combinada con la mínima citotoxicidad del hospedador, motivó esta revisión para destacar el papel y la utilidad de los AMPs para la TEP, con énfasis en su mecanismo de acción y las diferentes interacciones con la célula bacteriana. Estos detalles son información clave para sus propiedades selectivas. También describimos la estrategia, el diseño y la utilización de estos péptidos como potenciales radiofármacos, ya que su combinación con modalidades de medicina nuclear como la SPECT o la PET permitiría un examen no invasivo de todo el cuerpo para la detección de una infección oculta que cause, por ejemplo, fiebre de origen desconocido.

1. Introducción

En comparación con otras tecnologías convencionales, la imagen tomográfica puede evaluar los procesos de la enfermedad en la profundidad del cuerpo, de forma no invasiva y relativamente rápida. Por lo tanto, no es de extrañar que la imagen molecular ha aumentado poderosamente la investigación de diversos procesos de la enfermedad y se ha convertido en una herramienta esencial en el campo de la oncología, tanto para la investigación y la atención al paciente . Otra de las principales ventajas de la imagen es su capacidad para proporcionar una evaluación holística y tridimensional de todo el órgano o cuerpo, que es menos probable que se vea limitada por errores de muestreo y, por tanto, se correlaciona bien con el proceso general de la enfermedad. Aunque los continuos avances en el campo de la imagen molecular han proporcionado oportunidades inmejorables para perfeccionar los métodos de seguimiento de las enfermedades, las herramientas para evaluar la infección y la inflamación siguen siendo limitadas. Dos métodos de imagen, ampliamente utilizados en las clínicas actualmente, incluyen la tomografía computarizada (TC) de alta resolución que mide los cambios anatómicos (y, por tanto, tardíos) o la tomografía por emisión de positrones (PET) marcada con 2-fluoro-deoxi-D-glucosa (18F-FDG), que es un marcador general de la actividad metabólica. Como la 18F-FDG también se acumula en los focos de infección e inflamación debido al elevado metabolismo de la glucosa en estos lugares, no es específica para la infección. Por lo tanto, cada vez es más importante desarrollar agentes de imagen de infección más específicos y selectivos. El marcaje directo, ex vivo, de los leucocitos se considera el «patrón de oro» para la obtención de imágenes de la infección mediante PET. Desgraciadamente, este proceso es muy laborioso y requiere mucho tiempo, así como la manipulación de productos sanguíneos. Como alternativa, se pueden etiquetar indirectamente los leucocitos utilizando moléculas radiomarcadas, como péptidos quimiotácticos o citocinas, que se unen a los receptores de los leucocitos. Por desgracia, los efectos biológicos de algunos de los compuestos que se unen a los receptores de los leucocitos han limitado su uso clínico como agentes de imagen molecular específicos para la infección. Aunque los leucocitos más comúnmente marcados, neutrófilos y linfocitos, son bastante selectivos para la infección, hay casos en los que pueden no detectar una infección o acumularse en sitios no infectados. Si la infección no provoca una respuesta inmunitaria, los leucocitos marcados no se acumularán en los loci infectados, lo que puede ocurrir en un individuo gravemente inmunodeprimido o en el caso de una infección por determinados patógenos, como Mycobacterium tuberculosis o Pneumocystis carinii. Algunas afecciones inmunitarias no infecciosas, como la artritis reumatoide, también pueden provocar una respuesta inmunitaria y acumular el trazador . Mediante el uso de diferentes trazadores, son posibles diferentes estrategias de orientación para obtener imágenes de la infección mediante PET.

Los trazadores que interactúan directamente con los microbios patógenos responsables de la infección son, por naturaleza, altamente específicos para la infección y, a diferencia de los leucocitos marcados, no deberían acumularse en inflamaciones estériles. Estos tipos de trazadores incluyen antibióticos radiomarcados y péptidos antimicrobianos. La ciprofloxacina marcada con tecnecio-99m (-ciprofloxacina) ha sido el trazador basado en antibióticos más ampliamente estudiado para la obtención de imágenes de infección por SPECT, dirigido a la ADN girasa, una enzima presente en todas las bacterias en división, y se cree que no se acumula en las bacterias muertas ni en las inflamaciones estériles. Su uso como trazador en la obtención de imágenes de infección por SPECT ha planteado algunos problemas relacionados con su escasa pureza y estabilidad radioquímica. Más recientemente se ha informado de que la localización en los focos infectados tiene lugar principalmente a través de una mayor extravasación y estasis. Este proceso también se produce en los focos no infectados con una mayor permeabilidad vascular y la -ciprofloxacina puede acumularse en los focos de inflamación estéril, reduciendo así su especificidad para la infección.

Los péptidos antimicrobianos (AMP) han despertado interés como posibles vectores de orientación para el desarrollo de trazadores PET diseñados para la detección de infecciones. Estos péptidos se encuentran en diversos organismos, incluido el ser humano, y, hasta ahora, se han aislado y caracterizado cientos de ellos. Se cree que estos péptidos funcionan como microbicidas de amplio espectro y forman parte del sistema inmunitario innato de muchos eucariotas, incluido el ser humano. Independientemente de su origen, comparten muchas propiedades comunes, como tener una carga neta positiva, ser anfipáticos y, en la mayoría de los casos, ser activos de membrana. Debido a su papel en el cuerpo como microbicida natural, estos péptidos antimicrobianos son selectivamente citotóxicos para las bacterias, mientras que muestran una citotoxicidad mínima hacia las células del organismo anfitrión. Se cree que la naturaleza catiónica neta de los péptidos da lugar a una atracción electrostática relativamente fuerte hacia las células bacterianas cargadas negativamente y una atracción relativamente débil hacia las células huésped eucariotas, que suelen estar menos cargadas negativamente que las procariotas, y se cree que es la base de esta discriminación por tipo de célula. La capacidad de estos péptidos para acumularse en los focos de infección, combinada con su casi insignificante citotoxicidad o atracción por las células huésped, hace que estos péptidos resulten atractivos como vectores de orientación para la obtención de imágenes PET de la infección .

2. Visión general de los péptidos antimicrobianos

Los péptidos antimicrobianos son biomoléculas evolutivamente conservadas que forman parte de los mecanismos de defensa de muchos organismos , desde los procariotas hasta los animales pluricelulares como los humanos . Forman parte de la primera línea de defensa contra los microbios patógenos en los animales superiores y en muchas formas de vida inferiores; son la única forma de defensa contra los microbios patógenos y saprofitos . La citotoxicidad selectiva de estos péptidos, en la que atacan a los microbios patógenos y dejan indemnes a las células del huésped, se debe a las diferencias fundamentales en la composición y estructura de las células del huésped con las de las bacterias y levaduras patógenas. A pesar de que algunos AMPs muestran efectos inmunomoduladores y/o un comportamiento quimiotáctico, una característica común de estos péptidos antimicrobianos es que son anfipáticos pero poseen una carga global positiva . Se han caracterizado aproximadamente 1500 péptidos antimicrobianos en una amplia gama de organismos y la clasificación de estos péptidos puede ser complicada debido al alto grado de disimilitud de secuencia entre los distintos péptidos. Sin embargo, se ha intentado una clasificación basada en la composición de aminoácidos y en las estructuras secundarias.

Se han identificado tres grandes grupos (Tabla 1), a saber, los péptidos α-helicoidales, los péptidos de hoja β que contienen cisteína y los péptidos flexibles ricos en aminoácidos específicos como prolina, triptófano, histidina, arginina y glicina .

2.1. Péptidos antimicrobianos α-hélicos

Aproximadamente del 30 al 50% de todos los péptidos antimicrobianos identificados y estudiados hasta la fecha contienen estructuras α-hélicas predominantes. Esto puede deberse a la relativa facilidad con la que estos péptidos se sintetizan químicamente, lo que permite una amplia caracterización en el laboratorio. Estos péptidos suelen estar formados por 12-40 residuos de aminoácidos y contienen abundantes residuos estabilizadores de la hélice, como alanina, leucina y lisina, pero nunca cisteína. En soluciones acuosas, estos péptidos suelen estar desestructurados, pero adoptan sus conformaciones α-helicoidales anfipáticas cuando se asocian con una membrana celular o en un entorno mimético de membrana. A menudo, estos péptidos no son estrictamente α-hélicos y pueden contener un pliegue interno.

2.2. Péptidos antimicrobianos de hoja β

El otro grupo principal de péptidos antimicrobianos son los que suelen contener de dos a diez residuos de cisteína que forman de uno a cinco enlaces disulfuro entre cadenas. Esta interacción de enlace permite a estos péptidos adoptar la conformación de hoja β. La mayoría de los péptidos antimicrobianos de hoja β forman parte de la familia de las defensinas y estos péptidos se conservan evolutivamente en plantas, hongos, insectos, moluscos y animales vertebrados. Las defensinas suelen estar formadas por dos o tres láminas β antiparalelas estabilizadas por tres o cuatro enlaces disulfuro intramoleculares; sin embargo, en algunos casos se encuentra un segmento α-helicoidal o no estructurado en el extremo N o C. A diferencia de los péptidos antimicrobianos α-helicoidales, que están desestructurados en soluciones acuosas, las defensinas mantienen una estructura globular compacta en tales condiciones. Aparte de la similitud general en la estructura secundaria, la mayoría de las α-defensinas derivadas de mamíferos poseen dos características comunes adicionales, a saber, un bucle saliente resultante de un puente salino conservado de arginina/glutamato y un bulto β causado por un motivo conservado de glicina-X-cisteína (X: cualquier aminoácido) entre el primer y el segundo residuo de cisteína.

2.3. Péptidos antimicrobianos flexibles ricos en aminoácidos específicos

Una minoría de péptidos antimicrobianos contienen una alta proporción de ciertos aminoácidos como prolina, triptófano, histidina, arginina y glicina. Entre los miembros representativos de esta clase se encuentran la indolicidina bovina rica en triptófano y la tritrpticina porcina, las histatinas humanas ricas en histidina y el PR-39 porcino rico en arginina y prolina. Debido a su composición inusual de aminoácidos, estos péptidos tienen estructuras secundarias muy variables. La indolicidina de 13 aminoácidos (ILPWKWPWPWRR), por ejemplo, adopta una conformación ampliamente extendida en presencia de micelas zwitteriónicas compuestas por sustancias como la dodecilfosfocolina o el sulfato de sodio-dodecilo aniónico .

3. Mecanismos de especificidad y selectividad celular de los péptidos antimicrobianos

Las diferencias inherentes a la composición y arquitectura de la membrana de la célula microbiana frente a la del huésped contribuyen a la selectividad de los péptidos antimicrobianos. También se cree que la regulación de la expresión o la localización de los péptidos evita las interacciones no deseadas con las células vulnerables del huésped.

3.1. Especificidad de la diana y selectividad celular Especificidad de la diana y toxicidad celular selectiva

Una membrana biológica puede considerarse simplemente un mosaico fluido formado por fosfolípidos intercalados con proteínas. En diferentes organismos, los glicéridos y los esteroles también pueden contribuir a la arquitectura bioquímica y a la topología de la superficie de dichas membranas. Sin embargo, existen diferencias fundamentales entre las membranas de las células microbianas y las de los animales que permiten a los péptidos antimicrobianos distinguir entre estas células y dirigirse selectivamente a una sobre la otra, como se esboza en la Figura 1 .

Figura 1

Dirección de la membrana de los péptidos antimicrobianos y base de su selectividad (adaptado de ).

3.2. Composición de la membrana. Composición de la membrana, carga e hidrofobicidad

El componente central de casi todas las biomembranas naturales es la bicapa de fosfolípidos. Estas bicapas son anfipáticas, lo que significa que tienen regiones tanto hidrofóbicas como hidrofílicas. Sin embargo, las membranas de las células eucariotas y procariotas difieren significativamente en cuanto a la composición exacta y la energía celular (Figura 2). La fosfatidilcolina (PC) y su análogo, la esfingomielina (SM), así como la fosfatidiletanolamina (PE) no tienen carga en condiciones fisiológicas. El colesterol y otros esteroles, como el ergosterol, que se encuentran abundantemente en las membranas eucariotas, pero muy raramente en las procariotas, también suelen tener carga neutra (Figura 2). Los fosfolípidos hidroxilados como el fosfatidilglicerol (PG), la cardiolipina (CL) y la fosfatidilserina (PS) poseen una carga neta negativa en condiciones fisiológicas. Se puede observar cómo la carga de la membrana se debe principalmente a la proporción y a la localización de los distintos fosfolípidos, siendo las membranas celulares compuestas mayoritariamente por PG, CL y PS, como es el caso de la mayoría de las bacterias patógenas, muy electronegativas, mientras que aquellas membranas ricas en PC, PE o SP tienden a tener una carga neta neutra, como es el caso de las membranas celulares de los mamíferos .

Figura 2

Arquitectura lipídica comparativa de las membranas citoplasmáticas microbianas y humanas. Las membranas citoplasmáticas de patógenos bacterianos (Escherichia coli, Staphylococcus aureus o Bacillus subtilis) y fúngicos (Candida albicans) se comparan con la del eritrocito humano en cuanto a la composición relativa y la distribución entre las hojas de la membrana interna y externa. Los constituyentes de la membrana que van de aniónicos (izquierda) a neutros (derecha) son CL, PG, PE, PC, SM y esteroles (colesterol o ergosterol, ST). Nótese que la marcada diferencia entre los patógenos microbianos y los eritrocitos humanos reside en la composición y asimetría de los fosfolípidos. Se cree que estas diferencias explican la afinidad selectiva del péptido antimicrobiano por las células microbianas frente a las del huésped, en la medida en que existe para un determinado péptido antimicrobiano. Claves: abierto, E. coli; sombreado horizontal, S. aureus; sombreado, B. subtilis; a cuadros, C. albicans; sólido, eritrocito humano (adaptado de ).

3.3. Asimetría de la membrana Asimetría de la membrana

Aunque las membranas celulares no son simétricas ni estáticas, las diferencias entre las bicapas de fosfolípidos de los mamíferos y de los microbios pueden servir como objetivos potenciales para los péptidos antimicrobianos. En algunas células, como el eritrocito bovino, sólo el 2% del contenido total de PE se localiza en la hoja de la membrana externa . Las diferencias en la simetría de la membrana, la saturación de las bicapas de fosfolípidos y la estequiometría de la composición influirán en la fluidez de la membrana y en la transición de fase. De manera similar, la carga de los folletos interior y exterior de la bicapa celular también puede ser diferente.

3.4. Ligandos y receptores microbianos como objetivos de los péptidos antimicrobianos

Los experimentos han demostrado que las versiones de aminoácidos D y L de los péptidos antimicrobianos presentan afinidades de unión similares a las células objetivo, lo que sugiere que los receptores estereoespecíficos no participan en la orientación de las células patógenas . Sin embargo, varios estudios parecen refutar esto y sugieren que ciertas proteínas localizadas en la membrana de las células microbianas pueden servir como objetivos de unión para ciertas clases de péptidos antimicrobianos, como las histatinas. Esto apoyaría los hallazgos por los que las histadinas están implicadas en los mecanismos de defensa local con determinados tipos de patógenos y se han recuperado en heridas dentales o cutáneas. Algunos investigadores también postulan que los componentes aniónicos de las membranas celulares, por ejemplo, el CL, el PG o el lipopolisacárido (LPS), pueden servir como pseudorreceptores, permitiendo la interacción inicial entre el péptido antimicrobiano y la célula microbiana diana… De ahí que los receptores de unión a los antimicrobianos puedan ser una vía alternativa de interacción de los PAM con la envoltura celular bacteriana.

3.5. Potencial de transmembrana

El potencial de transmembrana es otra forma en la que varían las células microbianas y las de los mamíferos y está en la separación de cargas que existe entre las capas interna y externa de la membrana citoplasmática. El gradiente electroquímico, resultante de las diferentes tasas de intercambio de protones a través de la membrana celular, se denomina potencial transmembrana (Δψ). Una célula normal de mamífero tiene un Δψ de entre -90 y -110 mV. Las bacterias patógenas, sin embargo, suelen presentar un Δψ en el rango de -130 a -150 mV. Esta diferencia significativa en el potencial electroquímico puede ser otro factor que permite a los péptidos antimicrobianos distinguir entre las células huésped y las células objetivo.

4. Toxicidad selectiva basada en el diseño del péptido antimicrobiano

En el entorno intercelular acuoso, se cree que muchos péptidos antimicrobianos adoptan conformaciones extendidas o desestructuradas, aunque esto puede no ser así si hay enlaces intramoleculares presentes, que asegurarán una conformación específica en una variedad de entornos debido a la rigidez inducida. Una vez que el péptido antimicrobiano se une a la membrana celular de un microbio patógeno, puede sufrir un cambio conformacional significativo y adoptar una conformación específica, como una α-hélice. Los estudios sugieren que las conformaciones dinámicas y/o inherentes de los péptidos antimicrobianos tienen un efecto en su citotoxicidad selectiva . Además, los péptidos antimicrobianos pueden sufrir una transición conformacional, una autoasociación o una oligomerización dentro de la membrana del patógeno objetivo, pero no de la membrana de la célula huésped para aumentar la toxicidad específica de la célula . Zhang y sus colaboradores emplearon péptidos sintéticos de prueba que eran uniformemente catiónicos pero que variaban en su conformación e incluían estructuras extendidas, cíclicas, α-helicoidales y β-hojas. Se determinó que todos los péptidos de prueba eran capaces de interactuar con monocapas lipídicas compuestas por PG, un fosfolípido cargado negativamente, y de penetrar en ellas. Sin embargo, sólo los péptidos α-helicoidales y extendidos fueron capaces de interactuar con la membrana de PC, de carga más neutra. En el mismo estudio también se descubrió que los péptidos β-hoja eran capaces de translocar fosfolípidos de la hoja interior a la exterior a concentraciones inferiores a las necesarias para permeabilizar la membrana. Del mismo modo, Kol y colaboradores demostraron que péptidos con una conformación comparable, pero ricos en histidina y lisina y carentes de triptófano, también eran capaces de inducir niveles significativos de translocación de fosfolípidos. De estos estudios puede concluirse que los péptidos antimicrobianos no sólo interactúan con membranas de fosfolípidos de composición y simetría específicas, sino que también son capaces de afectar a la remodelación de las membranas en células específicas.

4.1. Afinidad preferente in vivo In Vivo Afinidad preferencial por las células microbianas frente a las de mamíferos

Welling y sus colegas llevaron a cabo un experimento in vivo en el que comprobaron la afinidad de unión de un fragmento radiomarcado del péptido antimicrobiano catiónico ubiquicidina -UBI 29-41 por las células microbianas en comparación con las células del huésped. En el estudio, se infectaron animales con Candida albicans, Klebsiella pneumonia o Staphylococcus aureus. También se indujeron inflamaciones estériles en los músculos del muslo de los animales mediante la inyección de microorganismos muertos por calor o LPS purificado, para que sirvieran de control. Los péptidos radiomarcados se acumularon en una medida significativa en los lugares infectados en relación con las partes del cuerpo estériles o no infectadas. Este experimento in vivo demostró que los péptidos podían distinguir entre las células del huésped y las microbianas y que también se acumulaban en los lugares infectados. Mediante mediciones gammagráficas se determinó que los péptidos radiomarcados se acumulaban en los tejidos infectados a un ritmo rápido y que había un aumento de hasta cinco veces en las tasas de acumulación en los tejidos infectados en relación con los tejidos no infectados. Esta rápida localización se interpretó como que los péptidos tenían una afinidad mayor o preferente por la superficie de la célula diana en relación con la de la célula huésped.

4.2. Localización de los péptidos citotóxicos La localización de los péptidos antimicrobianos citotóxicos limita la exposición de los tejidos vulnerables del hospedador

Es posible que la citotoxicidad de las células del hospedador se reduzca en muchos organismos multicelulares debido a su localización en tejidos que no son vulnerables a sus efectos citotóxicos. En la mayoría de los animales, estos péptidos son secretados por las células en superficies relativamente inertes y robustas, como los epitelios de los intestinos o los pulmones, o en los anfibios, en la piel. Estos lugares son los más propensos a interactuar con microbios potencialmente dañinos con mayor frecuencia, y la expresión de la mayoría de los péptidos antimicrobianos es constitutiva o rápidamente inducible, para permitirles formar parte de las primeras defensas contra los patógenos . Otro medio de proteger los tejidos sensibles del huésped de los péptidos antimicrobianos es contenerlos dentro de los gránulos de los leucocitos fagocitadores, que engullen a los patógenos y los exponen a concentraciones letales de péptidos antimicrobianos y agentes oxidantes. La clase de péptidos antimicrobianos defensina se despliega de esta manera, ya que son algunos de los más tóxicos y menos selectivos de los péptidos antimicrobianos producidos por el huésped. El microambiente ligeramente ácido dentro del fagolisosoma maduro es también el entorno más eficaz para las defensinas, ya que muestran la máxima citotoxicidad en estas condiciones.

5. Mecanismos de acción de los péptidos antimicrobianos

Las estructuras generalmente conservadas de los péptidos antimicrobianos, en una amplia variedad de organismos, dan algunas pistas sobre sus mecanismos de acción. Son casi exclusivamente anfipáticos y catiónicos en condiciones fisiológicas, y se cree que esto ayuda a su selectividad celular. El péptido antimicrobiano ideal debería tener una baja citotoxicidad en las células huésped, pero ser tóxico para una amplia gama de microbios patógenos. Los determinantes antimicrobianos deben ser fácilmente accesibles y no deben ser propensos a cambios o alteraciones. En general, los péptidos antimicrobianos tienen estructuras anfipáticas que les permiten interactuar con las membranas de fosfolípidos, estructuras que son esenciales para todos los patógenos . Parámetros como la conformación (), la hidrofobicidad (), el momento hidrofóbico (), la carga (), el ángulo polar () y la anfipatía () son importantes para el funcionamiento de los péptidos antimicrobianos. Además, todos estos determinantes están interrelacionados y la modificación de una de estas características conducirá a la alteración de las demás.

5.1. Conformación Conformación ()

Aunque los péptidos antimicrobianos pueden encontrarse en una amplia gama de organismos huéspedes y tienen diferentes secuencias de aminoácidos, pueden clasificarse en unos pocos grupos discretos basados en su estructura secundaria. Los dos grupos más grandes incluyen péptidos que poseen una estructura secundaria β-hoja o α-helicoidal. La mayoría de los péptidos antimicrobianos restantes son los que tienen una proporción inusualmente alta de uno o más aminoácidos como el triptófano o la prolina y la arginina. Los péptidos α-helicoidales se encuentran con frecuencia en el líquido intercelular de los insectos y los anfibios y, por lo general, adoptan una conformación no estructurada o extendida en solución acuosa, y sólo adoptan su estructura helicoidal al interactuar con una membrana de fosfolípidos . Esto se debe a que el enlace de hidrógeno intramolecular necesario para una conformación α-hélica se interrumpe en un disolvente polar como el agua. En una membrana, los grupos polares de enlace de hidrógeno están protegidos del entorno lipofílico (apolar) de la membrana mediante la formación α-hélica. La conformación helicoidal también expone las cadenas laterales apolares al entorno lipídico neutro dentro de la membrana. Aunque la estructura primaria de la clase de péptidos β-hoja muestra un nivel de disimilitud en la secuencia de aminoácidos, todos ellos comparten características comunes con respecto a la estructura anfipática, poseyendo dominios hidrofílicos e hidrofóbicos distintos .

5.2. Carga ()

La mayoría de los péptidos antimicrobianos son en general catiónicos y tienen cargas que van de +2 a +9, y muchos de ellos poseen dominios muy definidos con carga negativa. Esta carga positiva es importante para la atracción inicial y la interacción con las membranas celulares aniónicas de las bacterias y otros microorganismos patógenos. Del mismo modo, las membranas relativamente menos aniónicas del huésped no atraen electrostáticamente a los péptidos antimicrobianos y pueden conferir cierta selectividad celular a los péptidos. Las bacterias patógenas suelen ser ricas en fosfolípidos ácidos como el CL, el PG y el PS. Además, los ácidos teicoico y teichurónico de las paredes celulares de las bacterias Gram-positivas y los LPS de las bacterias Gram-negativas confieren una carga electronegativa adicional a la superficie celular bacteriana. Se ha determinado que la Δψ de las bacterias es típicamente un 50% mayor que la de las células de los mamíferos y se ha propuesto que los péptidos antimicrobianos pueden concentrarse en la superficie de los microbios patógenos de forma electroforética . Aunque muchos estudios han podido correlacionar la cationicidad de los péptidos antimicrobianos con su actividad antimicrobiana, no existe una relación estrictamente lineal. Dathe y sus colaboradores demostraron en estudios con análogos de la magainina que el aumento de la cationicidad de +3 a +5 daba lugar a un incremento de la actividad antibacteriana contra especies tanto Gram-positivas como Gram-negativas. Sin embargo, observaron que había un límite para la cationicidad, después del cual cualquier aumento de la carga positiva dejaba de aumentar la actividad antibacteriana. Se cree que esta disminución de la actividad antibacteriana puede deberse a que los péptidos se unen tan fuertemente al grupo de cabeza del fosfolípido cargado negativamente que la translocación del péptido al interior de la célula era imposible. La anfipatía () y el momento hidrofóbico ()

La anfipatía es una característica casi universal entre los péptidos antimicrobianos y se consigue a través de una serie de estructuras peptídicas diferentes. La hélice α anfipática es una de las características más comunes y sencillas. Alternando residuos de aminoácidos aniónicos y catiónicos cada tres o cuatro posiciones, el péptido es capaz de adoptar una estructura secundaria que permite una interacción electrostática óptima con las membranas de fosfolípidos anfipáticos (Figura 3). Esta característica permite que el péptido ejerza una actividad citotóxica no sólo hacia las membranas celulares con carga negativa, sino también hacia aquellas con carga neutra o de naturaleza anfipática .

Figura 3

Análisis estadístico de la distribución de residuos en los AMPs de tramo N-terminal de 20 residuos de fuentes naturales. Se muestra una representación gráfica de la frecuencia de diferentes tipos de residuos en cada posición en una proyección de rueda helicoidal. La distribución desigual de péptidos hidrofóbicos y cargados contribuye a la naturaleza anfipática del péptido (adaptado de Tossi et al. ).

La anfipatía de un péptido puede describirse por su momento hidrofóbico () que puede calcularse como la suma vectorial de las hidrofobicidades de los aminoácidos individuales, normalizada a una hélice ideal. Un aumento del momento hidrofóbico se correlaciona con una mayor permeabilización de la membrana de la célula objetivo. Esto es especialmente significativo en las interacciones con membranas lipídicas con carga neutra, en las que es poco probable que los factores de carga provoquen la atracción e interacción necesarias con la membrana celular objetivo. Al igual que los péptidos antimicrobianos α-helicoidales, los péptidos de defensa del huésped β-hoja también presentan anfipatía. Esto se manifiesta como un número variable de hebras β organizadas para formar superficies hidrofóbicas e hidrofílicas. Las hebras β, que a menudo son antiparalelas, se estabilizan mediante enlaces disulfuro regularmente espaciados o mediante la ciclización de la columna vertebral del péptido. Esta unión intramolecular permite que los péptidos antimicrobianos de hoja β mantengan una conformación rígida incluso en el líquido extracelular acuoso y también facilita la multimerización, ya que las superficies hidrofóbicas se agruparán para evitar la exposición al medio acuoso. Aunque los mecanismos exactos por los que los péptidos antimicrobianos anfipáticos provocan la disrupción de la membrana en la membrana de la célula diana son indeterminados en la actualidad, en gran medida porque se desconoce la conformación exacta de los péptidos en las membranas, los estudios han demostrado que la anfipaticidad segregada tanto en los péptidos antimicrobianos α-helicoidales como en los de hoja β tiene un profundo efecto en la disrupción de las biomembranas naturales por parte del péptido.

5.4. Hidrofobicidad Hidrofobicidad ()

La hidrofobicidad de un péptido puede definirse como el porcentaje de residuos de aminoácidos hidrofóbicos que componen su estructura primaria. Para la mayoría de los péptidos antimicrobianos, la hidrofobicidad se sitúa en torno al 50% y es esencial para el funcionamiento del péptido, ya que le permite interactuar con la bicapa de fosfolípidos y penetrar en ella. Aunque una cierta cantidad de hidrofobicidad es esencial para el funcionamiento del péptido antimicrobiano, una hidrofobicidad excesiva aumentará su probabilidad de destruir las células del huésped y reducirá su especificidad para las células microbianas . Wieprecht y sus colaboradores estudiaron la relación entre la hidrofobicidad de los péptidos y su capacidad para permeabilizar las biomembranas. Utilizando análogos de la magainina como péptidos antimicrobianos modelo, pudieron mantener casi constantes factores como el momento hidrofóbico, la helicidad y la carga, al tiempo que producían análogos de hidrofobicidad variable. Sus experimentos demostraron que la hidrofobicidad tenía poco o ningún efecto sobre la capacidad del péptido para unirse o permeabilizar la membrana cuando ésta estaba formada exclusivamente por PG. Sin embargo, en las membranas compuestas por una proporción de 3 : 1 de PC : PG, los péptidos con la mayor hidrofobicidad tenían una capacidad de permeabilización aproximadamente 60 veces mayor que el péptido menos hidrofóbico, y en las membranas compuestas sólo por PC había una diferencia de 300 veces.

5.5. Ángulo polar ()

El ángulo polar de un péptido se refiere a la proporción relativa de facetas polares a no polares del péptido conformado en una hélice anfipática. Un péptido helicoidal con una faceta compuesta totalmente por residuos de aminoácidos polares y la otra faceta compuesta totalmente por residuos no polares tendría un ángulo polar de 180°. Una menor segregación entre los dominios, o una sobreabundancia de residuos hidrofóbicos, conduciría a un ángulo polar menor. Los estudios realizados por Uematsu y Matsuzaki en péptidos tanto sintéticos como naturales han demostrado que un ángulo polar más bajo y, por tanto, una faceta más hidrofóbica, favorece más la permeabilización de la membrana. El ángulo polar también se ha correlacionado con la estabilidad de los poros inducidos por el péptido en las biomembranas. También demostraron que los péptidos antimicrobianos con ángulos polares más pequeños eran capaces de inducir grados más altos de permeabilización de la membrana y translocación a tasas más altas que los péptidos con ángulos polares mayores. Sin embargo, los poros formados por los péptidos con ángulos polares más pequeños eran menos estables que los formados por péptidos con ángulos polares mayores. Se puede ver que las propiedades hidrofóbicas e hidrófilas de los péptidos antimicrobianos desempeñan papeles vitales en las interacciones con las membranas celulares de fosfolípidos y en su permeabilización.

5.6. Características estructurales comunes de los péptidos antimicrobianos

Aunque existe una gran variedad de péptidos antimicrobianos en la naturaleza, se ha observado la conservación de características clave y estructuras secundarias. Los extremos de características como la anfipatía, la carga, el momento hidrofóbico o el ángulo polar no son beneficiosos, ya que tienden a comprometer la actividad antimicrobiana o a provocar un aumento de la citotoxicidad de la célula huésped. La carga mínima que pueden poseer los péptidos para ejercer cualquier tipo de actividad antimicrobiana parece ser +2. Esta cationicidad mínima es importante porque permite la atracción electrostática inicial a la membrana bacteriana, que está cargada negativamente. También permite el desplazamiento de cualquier otro catión que pueda estar ya unido a la membrana de la célula objetivo y la translocación al interior de la bicapa de la membrana. Del mismo modo, la hidrofobicidad del péptido debe ser moderada, ya que los péptidos antimicrobianos muy hidrofóbicos se dirigirían a membranas con una carga neta neutra, como las células del huésped, lo que llevaría a una reducción de la selectividad de la diana y al daño del organismo huésped. Puede verse que la selección de microbios patógenos se debe en gran medida a un equilibrio entre la electronegatividad y la hidrofobicidad de los péptidos antimicrobianos.

6. Interacciones iniciales con la membrana celular objetivo

La interacción inicial entre el péptido antimicrobiano y la membrana fosfolipídica de la célula es importante ya que determina la selectividad de la célula objetivo y también influye en cualquier interacción posterior con la célula objetivo. Las interacciones iniciales están determinadas en gran medida por las características físicas y químicas tanto del péptido antimicrobiano como de la membrana de la célula diana.

6.1. Interacciones electrostáticas Interacciones electrostáticas

Se cree ampliamente que las interacciones electrostáticas son responsables de la orientación inicial de la célula microbiana. Un estudio de Matsuzaki correlacionó la cationicidad del péptido antimicrobiano con la capacidad de unión a la membrana, y el hecho de que la cationicidad sea una característica conservada de casi todos los péptidos antimicrobianos en una amplia gama de organismos apoya aún más este argumento. Las fuerzas electrostáticas actúan a gran distancia y la abundancia de residuos de lisina y arginina en los péptidos antimicrobianos, que son atraídos por los grupos de fosfato cargados negativamente de las biomembranas, da más credibilidad a la teoría de que estas interacciones son responsables de la atracción inicial a la membrana de la célula objetivo . En las bacterias Gram negativas se cree que los péptidos antimicrobianos desplazan a los cationes que normalmente se asocian con el LPS, ya que los péptidos antimicrobianos poseen una afinidad de unión con el LPS que es aproximadamente tres órdenes de magnitud mayor que la de los cationes divalentes que suelen asociarse con esta moiety. Las cepas de bacterias en las que el LPS está muy sustituido por 4-amino-4-deoxi-L-arabinosa o está muy acilado muestran una mayor resistencia a los péptidos antimicrobianos cargados positivamente, lo que da más credibilidad a la teoría de que la carga electrostática es importante para la interacción con la membrana celular objetivo. Las bacterias Gram-positivas carecen de LPS o membrana celular externa, pero tienen una gruesa pared celular formada por polímeros de ácido teichurónico o teicoico. Estas estructuras altamente aniónicas son objetivos ideales para los péptidos antimicrobianos catiónicos. Las cepas de Staphylococcus aureus en las que los ácidos teicoicos han sido modificados, dando lugar a una mayor carga aniónica, son más susceptibles a los péptidos antimicrobianos catiónicos . También se cree que el hecho de que la mayoría de las bacterias tengan un fuerte gradiente electroquímico (Δψ) en relación con las células de los mamíferos aumenta la selectividad de la diana de los péptidos antimicrobianos .

6.2. Interacciones receptor-ligando con la membrana

Algunos estudios han demostrado que tanto los péptidos naturales como los sintéticos interactúan con la membrana igual de bien independientemente de si se utilizan D-aminoácidos o L-aminoácidos . Esto sugeriría que las interacciones con las biomembranas no dependen de los mecanismos receptor-ligando; sin embargo, otros estudios han demostrado que este puede no ser el caso con todos los péptidos antimicrobianos. Se ha descubierto que la nisina, un péptido cíclico de origen natural con una potente acción antimicrobiana, se une específicamente al lípido II ligado a la membrana bacteriana. Del mismo modo, se ha demostrado que la taquipesina tiene una afinidad específica por el LPS. Los datos de estos estudios sugieren que la unión mediada por el receptor es importante para la orientación celular en un pequeño número de péptidos antimicrobianos.

7. Acontecimientos posteriores a la unión inicial a la membrana

La determinación experimental de la atracción inicial de los péptidos y su interacción con las membranas celulares suele ser más sencilla que la determinación de las interacciones posteriores. Para dilucidar las interacciones péptido-membrana se han utilizado diversas metodologías, como el dicroísmo circular, la cristalografía de rayos X, la resonancia magnética nuclear, la cromatografía líquida de fase inversa y la resonancia de plasmón superficial, entre otras técnicas. Sin embargo, se sugiere que la eficacia y los mecanismos antimicrobianos son extremadamente sensibles a condiciones como el pH, la fuerza osmótica, la viscosidad de la solución y la temperatura, por lo que cualquier dato obtenido por las técnicas mencionadas debe considerarse en relación con estas condiciones. Después de la unión inicial a la membrana, los péptidos antimicrobianos penetran en la membrana fosfolipídica exterior, una fase denominada concentración umbral, y al hacerlo son capaces de ejercer sus efectos citotóxicos en el interior de la célula. La entrada de los péptidos en la célula requiere un número mínimo, o una concentración umbral de péptidos antimicrobianos para acumularse en la superficie de la membrana lipídica. Este acontecimiento puede verse afectado por factores distintos de la concentración, como la capacidad de los péptidos para multimerizarse y también las características de la propia membrana fosfolipídica, como su composición lipídica, el tamaño del grupo de cabeza y la fluidez . El potencial transmembrana de la bicapa también puede influir en la forma en que el péptido entra en la membrana, ya que un potencial transmembrana altamente negativo facilitará la formación de poros al atraer al péptido cargado positivamente hacia la membrana.

8. Cambios en la conformación del péptido al interactuar con la membrana

Muchos péptidos antimicrobianos, especialmente los que tienen estructuras secundarias α-helicoidales, sufren una importante reorganización conformacional al entrar en el entorno no polar de la membrana interna. Los péptidos antimicrobianos α-helicoidales están normalmente desordenados en el entorno extracelular, mostrando estructuras al azar en forma de espiral o extendidas, pero se conforman rápidamente en una α-hélice estructurada cuando se asocian con la biomembrana . Algunos péptidos antimicrobianos sólo pueden experimentar este cambio conformacional en asociación con una membrana bicapa cargada negativamente. Esto puede deberse a la disposición de los lípidos en dichas membranas, ya que los grupos de cabeza de los fosfolípidos inducen una periodicidad óptima de los residuos de aminoácidos catiónicos en el péptido, lo que a su vez promueve la conformación correcta en la estructura secundaria helicoidal . Se ha sugerido que esta característica garantiza que los péptidos antimicrobianos sólo se «activarán» en la forma citotóxica en presencia de la membrana de la célula objetivo, en este caso una bacteria cargada negativamente, y no dañarán indiscriminadamente las células huésped no objetivo. Los enlaces disulfuro intramoleculares que se encuentran en los péptidos de hoja β garantizan que mantengan su estructura secundaria incluso en entornos acuosos, por lo que no sufren los drásticos reajustes conformacionales que se observan en los péptidos α-helicoidales, aunque las estructuras peptídicas cuaternarias pueden disociarse al entrar en la membrana, lo que podría facilitar la toxicidad selectiva . Tras la interacción inicial con la membrana celular, muchos péptidos pueden sufrir una autoasociación que, combinada con las interacciones lípido-péptido, puede conducir a la creación de estructuras complejas que contribuyen a los efectos citotóxicos del péptido. La secuencia de aminoácidos del péptido antimicrobiano y su conformación en forma de monómero dictarán su capacidad para formar estas estructuras. En los péptidos anfipáticos, los dominios hidrofóbicos son capaces de interactuar con la región central hidrofóbica no polar de la bicapa lipídica, lo que hace que el péptido se adentre en la membrana. Alternativamente, también podrían interactuar con las facetas hidrofóbicas de otros péptidos, promoviendo la multimerización en un intento de evitar la exposición de estas facetas al entorno acuoso. Este tipo de multimerización e interacción con el interior de la bicapa lipídica puede dar lugar a la formación de poros o canales revestidos de péptidos en la biomembrana, lo que provoca la pérdida de integridad y la permeabilización. Dado que las biomembranas son muy variables en cuanto a su composición y estructura, es posible que un péptido se comporte de distintas maneras cuando se asocia con diferentes membranas celulares. Se han propuesto varios modelos para describir la formación de poros observada en membranas que han sido expuestas a péptidos antimicrobianos.

8.1. Este mecanismo de formación de poros de membrana se denomina así porque los péptidos transmembrana, o los complejos peptídicos, que recubren el canal están colocados en un anillo en forma de barril, con los péptidos formando duelas transmembrana. Los péptidos anfipáticos están orientados de manera que los dominios hidrofóbicos interactúan con las colas hidrocarbonadas no polares situadas en el interior de la membrana lipídica, mientras que los dominios hidrofílicos están orientados de manera que se enfrentan al canal acuoso del poro y forman su revestimiento . Inicialmente, los péptidos monoméricos se acumulan en la superficie de la célula y sufren un reajuste conformacional cuando entran en contacto con la membrana (Figura 4). Se cree que esto obliga a los grupos de cabeza de los fosfolípidos a apartarse e induce el adelgazamiento de la membrana. Esto permite que la parte hidrofóbica del péptido entre en el interior no polar de la membrana, mientras que los aminoácidos catiónicos del péptido antimicrobiano interactúan con los grupos de cabeza cargados negativamente. Cuando se alcanza el umbral de concentración de los péptidos, los monómeros del péptido son capaces de agregarse para formar multímeros que fuerzan aún más a los péptidos a entrar en el centro hidrofóbico de la membrana, ya que la agregación impide que las partes hidrofílicas del péptido queden expuestas a las partes hidrofóbicas de la membrana interior (Figura 4(a)). A medida que se agrega un número cada vez mayor de monómeros peptídicos, el poro de la membrana se expande .

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figura 4

Resumen del posible mecanismo de interacción tras la interacción del péptido con la membrana celular bacteriana , es decir, (a) modelo barril-estaca (formación de poros), (b) modelo toroidal (formación de poros), y (c) modelo alfombra (ruptura de la membrana). Regiones peptídicas coloreadas en rojo: hidrofílicas; regiones peptídicas coloreadas en azul: hidrofóbicas.

8.2. El mecanismo de poros toroidales o agujeros de gusano

Este mecanismo de formación de poros ha sido bien estudiado utilizando los péptidos α-helicoidales de magainina. Al entrar en contacto con la membrana celular cargada, los péptidos desorganizados adoptan la estructura α-helicoidal. Inicialmente, las hélices se orientan de forma paralela a la superficie de la membrana. Los grupos de cabeza de los fosfolípidos polares se desplazan y la superficie de la membrana se debilita, lo que da lugar a una tensión de curvatura positiva en la membrana. Como resultado de esta tensión y adelgazamiento, la membrana se desestabiliza y se vuelve más susceptible a nuevas interacciones peptídicas. Una vez que se alcanza un umbral de concentración de péptidos, éstos se reorientan de manera que quedan perpendiculares a la membrana y comienzan a multimerizarse de manera que las partes hidrofílicas de los péptidos no están en contacto con las partes hidrofóbicas de la membrana (Figura 4(b)). El poro toroidal recién formado es inestable y al desintegrarse algunos de los péptidos son forzados a entrar en el folleto interior de la membrana celular. Por lo tanto, se cree que el paso de desintegración de estos poros transitorios es importante, ya que permite a los péptidos translocarse al espacio intracelular, donde pueden actuar sobre otras dianas.

8.3. El modelo de la alfombra

El modelo de la alfombra de permeabilización de la membrana se basa en la acción difusa de muchos péptidos monoméricos sobre la membrana celular. Cuando hay concentraciones suficientemente altas de ciertos péptidos antimicrobianos en la membrana celular, algunos de los fosfolípidos de la membrana se desplazan, lo que da lugar a cambios en la fluidez de las membranas o provoca debilidades en las propiedades de barrera de la membrana. El efecto acumulativo de estos desplazamientos es que la membrana se debilita y pierde su integridad. Como se ha sugerido anteriormente, la atracción inicial de los péptidos antimicrobianos a la membrana se produce mediante fuerzas de atracción electrostáticas. No se forman canales o poros específicos, y se cree que la permeabilización y la pérdida de la integridad de la membrana se deben a las propiedades energéticas desfavorables que provoca la dispersión de los fosfolípidos (Figura 4(c)).

9. Impacto de las infecciones bacterianas en la salud humana y métodos tradicionales de diagnóstico de infecciones

Se calcula que hasta el 85% de los pacientes que están gravemente enfermos en el hospital tienen fiebre pero no muestran ningún otro signo externo de infección. Dado que los episodios prolongados de fiebre pueden ser mortales, es esencial que cualquier infección subyacente se detecte lo antes posible, para poder iniciar el régimen de tratamiento correcto. Los métodos tradicionales de diagnóstico pueden incluir el examen de biopsias de tejido y el intento de cultivo de los patógenos, una tarea a menudo inexacta y que requiere mucho tiempo y que puede retrasar el inicio del tratamiento. También se emplean procedimientos de diagnóstico por imagen que pueden incluir la tomografía computarizada (TC) o la resonancia magnética (RM). Sin embargo, estas técnicas no suelen ser capaces de detectar las infecciones en su fase inicial, ya que requieren que se produzcan cambios morfológicos en los tejidos, una característica que suele asociarse a las infecciones avanzadas . Además, suelen centrarse en partes específicas del cuerpo, lo que significa que es posible que no se detecte la infección o el verdadero alcance de la misma. Los anticuerpos o inmunoglobulinas marcados con galio o complejos como el 67/68Ga-citrato pueden emplearse para resaltar las regiones donde se produce el tráfico de leucocitos mediante SPECT o PET. Sin embargo, estas tecnologías no pueden distinguir definitivamente entre los tejidos infectados y los inflamados pero estériles, ya que el tráfico de leucocitos se produce en ambos casos. Dada la alta afinidad específica de los péptidos antimicrobianos naturales por las bacterias u hongos patógenos, en contraposición a las células del organismo huésped, se previó que podrían emplearse para ayudar a la resolución de los procesos de diagnóstico por imagen .

9.1. El uso de péptidos antimicrobianos como radiofármacos

En principio, un radiofármaco empleado para la obtención de imágenes de infecciones debería permitir la detección rápida de bacterias y la eliminación rápida de los sitios no infectados. También debe mostrar una captación elevada y específica en el lugar infectado, con cantidades mínimas que se acumulen en el tejido estéril o no objetivo. El compuesto también debe tener una baja toxicidad y no inducir una respuesta inmunitaria. Y lo que es más importante, debe ser capaz de distinguir entre una inflamación estéril y una infectada. Dado que los péptidos antimicrobianos suelen mostrar un amplio espectro de actividad contra una gran variedad de levaduras y bacterias patógenas, son moléculas objetivo ideales para infecciones en las que no se ha identificado el presunto patógeno. Además, su modo de acción requiere que se asocien físicamente con el patógeno, por lo que podrían llevar una fuente emisora de rayos gamma o positrones, como el tecnecio-99m (99mTc) o el galio-67 (67Ga), al lugar exacto de la infección. Su falta de afinidad por las células del organismo anfitrión también significa que no se acumularían en los tejidos inflamados estériles. Los péptidos antimicrobianos radiomarcados también son atractivos porque se eliminan rápidamente del sistema circulatorio y son excretados por el organismo. Además, también son capaces de penetrar en los tejidos extravasculares y, por tanto, de acumularse en los lugares infectados en un espacio de tiempo muy corto. Idealmente, el procedimiento de radiomarcaje de una molécula de orientación debería permitir la fijación firme de un radionúclido a la molécula sin que ello afecte negativamente a su capacidad de orientación o a la farmacocinética de la molécula. Los enfoques de etiquetado pueden ser directos o indirectos, como se indica a continuación (i) Un enfoque de etiquetado directo (Figura 5(a)) implica la incorporación del radionúclido a la molécula diana a través de un enlace covalente. En el caso de las moléculas peptídicas, puede formarse un enlace covalente entre el radionúclido y un residuo amídico libre adecuado de Lys y Arg. El uso del residuo de tirosina puede causar problemas asociados con el etiquetado, incluyendo la unión inespecífica o deficiente, la inestabilidad in vivo del complejo y las alteraciones no deseadas de la estructura del péptido, como la ruptura de los enlaces disulfuro internos, que pueden alterar su funcionamiento .(ii)Se puede utilizar una estrategia de etiquetado indirecto mediante la adición de agentes quelantes a la molécula diana (Figura 5(b)) . Se han utilizado quelatos bifuncionales para marcar moléculas portadoras de péptidos con radionúclidos. El agente quelante puede ser precargado con el radionúclido antes de ser unido a la molécula portadora, o puede ser unido primero a la molécula portadora y luego expuesto al nucleido para su quelación en un proceso conocido como post-etiquetado. El post-marcado tiene la ventaja de que la molécula portadora puede almacenarse durante un largo periodo de tiempo hasta que se necesite, y el radionúclido, que sufre una desintegración, puede añadirse poco antes de que se administre el radiofármaco. Esto beneficia la comercialización de la molécula portadora y facilita el uso de la tecnología en hospitales o clínicas .

(a)

(b)

(a)
(b)

9.2. La ubiquicidina ejemplifica un enfoque para radiofármacos derivados de péptidos antimicrobianos

El péptido antimicrobiano ubiquicidina (UBI), de 59 aminoácidos, es un péptido de 6,7 kDa que se descubrió por primera vez en extractos citosólicos del macrófago murino (Figura 6). Este péptido demostró tener efectos antimicrobianos contra Salmonella typhimurium y Listeria monocytogenes. Posteriormente se encontró en una amplia gama de otros organismos, incluidos los humanos. Dado que se encuentra de forma natural en el hombre, la ubiquicidina no es una entidad inmunogénica, lo que la hace adecuada para su administración como herramienta de diagnóstico. Además, tiene una gran afinidad por las células bacterianas, pero no se dirige a las células de los mamíferos, por lo que no es tóxica para el paciente y es selectiva, ya que es poco probable que se acumule en los focos de inflamación estériles . Se han realizado varios estudios sobre fragmentos de ubiquicidina tanto in vitro como in vivo para evaluar su capacidad de unirse a las células bacterianas.

Figura 6

Estructura primaria de la ubiquicidina tal y como informaron originalmente Hiemstra y colaboradores .

Welling y colaboradores evaluaron la ubiquicidina entera etiquetada y varios fragmentos radiomarcados del péptido, incluyendo UBI1-18 (KVHGSLARAGKVRGQTPK), UBI29-41 (TGRAKRMQYNRR), UBI18-29 (KVAKQEKKKKT), UBI 18-35 (KVAKQEKKKKTGRAKRR), UBI31-38 (RAKRMQY) y UBI22-35 (QEKKKKTGRAKRR) por su capacidad de unión a células bacterianas y/o leucocitos humanos in vitro. Descubrieron que los fragmentos peptídicos de ubiquicidina UBI 18-35, UBI 31-38, UBI 22-35 y UBI 29-41 mostraban afinidades de unión considerablemente mayores para las células bacterianas que para los leucocitos humanos. Los resultados in vivo, obtenidos mediante gammagrafía de ratones infectados experimentalmente tras la administración intravenosa de los distintos péptidos radiomarcados, mostraron que los péptidos UBI18-35 y UBI29-41 parecían ser los candidatos más prometedores. Tras un periodo de posadministración de 2 h y 24 h, las proporciones de unión de leucocitos a bacterias fueron de 1 : 36, 1 : 166, y 1 : 73, 1 : 220 para UBI18-35 y UBI29-41, respectivamente. Los investigadores concluyeron que UBI29-41 y UBI18-35 eran los péptidos óptimos para distinguir las infecciones de las inflamaciones estériles.

9.3. Ensayos clínicos en humanos de la -Ubiquicidina 29-41 como agente de imagen de infecciones

Akhtar y colaboradores estudiaron la eficacia de la -UBI 29-41 como agente de imagen de infecciones en dieciocho pacientes con sospecha de infecciones protésicas o de tejidos blandos. Utilizando la gammagrafía para monitorizar el péptido radiomarcado, los investigadores pudieron controlar la relación entre el objetivo y el no objetivo (T/NT) del agente de imagen. La infección en los pacientes se confirmó mediante el cultivo de bacterias del lugar infectado o, cuando no fue posible, mediante un examen de sangre completo. En el estudio se comprobó que todos los pacientes toleraron bien el péptido radiomarcado, no se observaron cambios significativos en sus constantes vitales y no se observaron efectos secundarios relacionados tras la administración del -UBI 29-41. La relación T/NT se determinó a los 30, 60 y 120 minutos, y la gammagrafía de los 30 minutos mostró el valor medio más alto de T/NT. La gammagrafía anterior de todo el cuerpo (Figura 7) proporcionó información sobre la biodistribución del trazador y sus vías de eliminación por el organismo. Se puede observar que el trazador se elimina principalmente por el sistema urinario y también se observó cierta actividad hepática dependiente de la perfusión. Se comprobó que el agente de imagen tenía una sensibilidad del 100% y una especificidad del 80%. Los investigadores concluyeron que el -UBI 29-41 tenía un valor predictivo positivo del 92,9%, un valor predictivo negativo del 100% y una precisión diagnóstica global del 94,4%. El péptido radiomarcado mostró eficacia contra una serie de bacterias diferentes, como Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes. En opinión de los investigadores, -UBI 29-41 es un agente de imagen altamente sensible y específico para detectar infecciones de tejidos blandos y huesos en humanos.

Figura 7

Imagen anterior de cuerpo entero tomada a los 30 minutos de la inyección del trazador que muestra los riñones (flecha punteada), el hígado (flecha sólida) y la vejiga urinaria (flecha de bola) (adaptada de ).

10. Discusión y perspectiva

El uso de modalidades de medicina nuclear como la SPECT o la PET permite a los clínicos el examen no invasivo de todo el cuerpo de procesos fisiológicos como la infección oculta a nivel celular y, además de ser una herramienta útil para la investigación fisiológica y médica, estas tecnologías altamente sensibles son capaces de detectar enfermedades sin, o antes de, un cambio anatómico (fiebre de origen desconocido). Hasta la fecha, se utilizan leucocitos radiomarcados, anticuerpos monoclonales contra citoquinas/leucocitos y trazadores asociados a objetivos moleculares o procesos metabólicos específicos. Los leucocitos radiomarcados presentan una serie de limitaciones (alteración de la función de los leucocitos debido al daño causado por la radiación), es decir, tienen una farmacocinética engorrosa y además son relativamente inespecíficos. Además, los leucocitos marcados y los trazadores de alto peso molecular, como los anticuerpos, también pueden tener una penetración limitada en los tejidos infectados o enfermos. Este último panorama presentado aclara el amplio potencial de los AMPs para ser evaluados como sondas de imagen, dada su singular implicación selectiva con las bacterias. Una simple consulta bibliográfica, buscando «péptidos antimicrobianos», dio como resultado unas 6.000 publicaciones. Sin embargo, en cuanto se combina la búsqueda con el término «imaging», sólo se obtienen 63 publicaciones, de las cuales sólo 17 tienen relevancia clínica (-UBI-29-41 estudios/ensayos relacionados). Se trata de una observación importante, ya que este fragmento de ubiquicidina puede representar un portador casi perfecto para dirigir moléculas para la detección de infecciones. Los ensayos clínicos en humanos llevados a cabo por Akhtar y colaboradores con -UBI 29-41 no encontraron ninguna evidencia de citotoxicidad en los pacientes, lo que apoya los hallazgos del presente estudio. A pesar de que se afirmó que la relación señal/ruido es baja, se ha utilizado con éxito durante 10 años. En 2010 los ensayos clínicos hasta la fecha fueron justificados por de Murphy et al. hacia su valor diagnóstico en el periodo inicial de 7 años. -UBI 29-41 meta-análisis devolvió valores altos de sensibilidad (96,3%), especificidad (94,1%) y precisión (95,3%) con altos valores predictivos positivos (95,1%) y negativos (95,5%) . A partir de 2011, se han llevado a cabo con éxito siete estudios clínicos adicionales (en los que se han inscrito más de 160 pacientes) y todos ellos han demostrado que la -UBI29-41-SPECT es una herramienta de diagnóstico altamente precisa y selectiva para la infección ósea en el pie diabético, las prótesis de cadera u otras infecciones relacionadas con los implantes; además, también detecta la osteomielitis y la endocarditis infecciosa. Se puede afirmar que este campo de aplicaciones para la obtención de imágenes con -UBI29-41 seguirá creciendo también porque la investigación con radioisótopos alternativos puede dar lugar a un nuevo grupo de agentes radiofarmacéuticos para la obtención de imágenes de diagnóstico médico mediante PET/CT o PET/MRI en el futuro. Los nuevos radioisótopos, como el 68Ga, el 82Rb o el 62Cu, pueden producirse bajo demanda a partir de un generador de radioisótopos sin necesidad de un ciclotrón in situ y pueden servir como radionúclidos para la PET. El 68Ga ha despertado interés como emisor de positrones para la obtención de imágenes moleculares debido a algunas de las ventajas que ofrece en un trazador. Tiene una vida media radiactiva de 67,71 minutos, lo que lo hace compatible con la biocinética de la mayoría de los radiofármacos de bajo peso molecular, como péptidos, oligonucleótidos, aptámeros o fragmentos de anticuerpos. La desintegración nuclear del isótopo se produce principalmente por emisión de positrones (89%), con una energía media de positrones de 740 keV. Además, la química de coordinación del Ga3+ se conoce bien, lo que resulta útil para diseñar agentes quelantes que puedan utilizarse para vincular este radionúclido a un vector de orientación. Recientemente, el UBI29-41 se conjugó con el macrociclo ácido 1,4,7-triazaciclononano-1,4,7-triacético (NOTA) y posteriormente se marcó con 68Ga . Este enfoque se utilizó inicialmente con el ácido 1,4,7,10-tetraaciclododecano-N′,N′′,N′′,N′′′′ ′-tetraacético (DOTA) para producir derivados peptídicos como DOTA-TOC o DOTA-TATE para la complejación con 68Ga que posteriormente permitió la obtención de imágenes PET basadas en receptores tumorales. En un estudio preclínico en el que se utilizó 68Ga-NOTAUBI29-41-PET se demostró que la conjugación de macrociclos no comprometía la capacidad del péptido para unirse selectivamente a las bacterias in vivo. Aparte del UBI, hay otros compuestos evaluados para la obtención de imágenes de la infección y la inflamación, pero la mayoría de los péptidos antimicrobianos disponibles siguen estando poco investigados en cuanto a la obtención de imágenes de la infección. En el año 2000, los péptidos de neutrófilos humanos (HNP1-3) se consideraron, entre otros péptidos, como agentes útiles para la obtención de imágenes de la infección; como parte del mecanismo de defensa en los cultivos de monocitos/linfocitos, los HNP desempeñan un papel quimiotáctico como moléculas mediadoras. Este papel ambiguo puede ser un inconveniente en el desarrollo de las HNP para la obtención de imágenes; de ahí que el uso de determinados péptidos como vectores de orientación pueda tener algunas limitaciones secundarias, a pesar de sus propiedades celulares favorables. Como los radiofármacos se administran principalmente por inyección i.v., los péptidos pueden ser propensos a la degradación enzimática o a la desestabilización del radioisótopo, como se ha informado para el 18F-UBI29-41 . El péptido derivado de la lactoferrina hLF(1-11) mostró una gran sensibilidad como agente de infección dirigido a cepas de Acinetobacter baumannii multirresistentes; sin embargo, la unión a Candida albicans, un hongo, y la excreción hepatobiliar lo hicieron menos favorable para la obtención de imágenes. Además, el hLF mostró efectos inmunoactivos o bactericidas en función de la dosis administrada, es decir, se encontró con un mecanismo de retroalimentación negativa por modulación de la interleucina 10 . Otro ejemplo, el AMP Latarcin-2a, extraído del veneno de la araña de Asia Central Lachesana tarabaevi, tiene una actividad lítica indeseable contra las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, los eritrocitos y las levaduras a concentraciones micromolares y, por tanto, es menos considerado para la detección bacteriana con PET . Además, la mayoría de las bacterias son capaces de producir ambas, proteasas unidas a la superficie y/o secretoras, una estrategia de defensa que puede degradar o inactivar los AMPs. En consecuencia, el uso de compuestos derivados de AMP como agentes de imagen daría lugar a diagnósticos falsos negativos en los que una infección persistente podría ser fácilmente juzgada de forma errónea o ignorada por completo. Mediante la comprensión de estos mecanismos de defensa específicos de las bacterias, se puede evitar el uso de estructuras vulnerables derivadas de AMP como agentes de imagen de la infección. También hay que tener en cuenta que, a excepción de unas pocas estructuras, la investigación no ha revelado una diana similar a un receptor específico de las bacterias que complemente los posibles péptidos como ligandos o moduladores alostéricos. Las células tumorales, por el contrario, expresan receptores específicos ligandos o antagonistas de la integrina, la bombesina o la somatostatina a los que se dirigen los trazadores SPECT o PET . Además, el sistema inmunitario del huésped, al reaccionar frente a las infecciones, tiene vías patológicas que pueden visualizarse mediante PET. Los macrófagos activados pueden actuar como un objetivo equivalente dependiente del huésped que puede visualizarse mediante 18F-FDG de forma inespecífica, pero la carga bacteriana real permanece oculta. Por el contrario, los péptidos derivados de AMP actúan en un mecanismo independiente del huésped: los péptidos radiomarcados se unirán a las bacterias libres y a las adheridas a las células, pero no a las fagocitadas, por lo que las bacterias se vuelven invisibles para -UBI29-41-SPECT una vez que son incorporadas por los macrófagos. El uso de esta modalidad permite potencialmente la detección temprana de la infección antes de que se produzcan cambios morfológicos en el organismo. También permite distinguir una infección de una inflamación estéril, que puede parecer superficialmente similar, ya que ambas pueden presentarse como zonas enrojecidas, hinchadas e inusualmente calientes. Esto se debe al aumento del flujo sanguíneo, a la mayor permeabilidad vascular y a la afluencia de glóbulos blancos que son comunes en ambas situaciones. Este último enfoque enfatizaría un régimen de imagen de doble trazador en futuros estudios clínicos o incluso la administración de doble trazador (si las respectivas propiedades radioisotópicas y farmacocinéticas complementan el enfoque). En resumen, el trazador ideal para la obtención de imágenes PET clínicas de la infección debería cumplir varios criterios. (1) Debe mantener una degradación sanguínea sustancial y tener un grado razonable de lipofilia; (2) debe acumularse y retenerse en el lugar de la infección (idealmente por internalización y posterior amplificación), con una acumulación mínima en los lugares no infectados; (3) debe tener una rápida eliminación de la captación de actividad no específica de las regiones circundantes para obtener una alta relación señal/ruido; y (4) debe tener efectos secundarios mínimos y debe ser fácil de preparar, a bajo coste. El UBI29-41 ha demostrado su utilidad para la obtención de imágenes de infecciones genéricas y, sin duda, le seguirán otros radiofármacos adecuados basados en AMPs.

Abreviaturas

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

El trabajo relacionado con esta revisión fue financiado y amablemente apoyado por la Fundación Nacional de Investigación (NRF), el Instituto de Medicina Celular y Molecular y la Iniciativa de Tecnologías Nucleares en Medicina y Biociencias (NTeMBI), una plataforma tecnológica nacional desarrollada y gestionada por la Corporación de Energía Nuclear de Sudáfrica (Necsa) y financiada por el Departamento de Ciencia y Tecnología (DST).