PLOS ONE
Discusión
La mayoría de los fármacos quimioterapéuticos están diseñados específicamente para interferir en la síntesis del ADN, el metabolismo celular y la división celular. Debido a este modo de acción, se espera que estos fármacos causen varios tipos de mutaciones . La mutagenicidad de los fármacos quimioterapéuticos en las células normales es uno de los problemas más graves de la quimioterapia debido a la posibilidad de inducir neoplasias secundarias y resultados reproductivos anormales como los síndromes de Down, Klinefelter y Turner. Por lo tanto, es imperativo determinar el efecto mutagénico de los fármacos quimioterapéuticos en las células normales. La prueba de micronúcleos se ha utilizado ampliamente para medir los daños no reparados en el genoma, y el aumento de la frecuencia de MN predice el riesgo de cáncer en los seres humanos . Dado que los MN pueden ser el resultado de una rotura cromosómica (clastogenicidad) o de cromosomas rezagados (aneugenicidad), la detección de MN tiene el potencial de ser utilizada como una pantalla para la inducción de aberraciones cromosómicas numéricas si se incluyen ensayos que permiten la identificación de cromosomas enteros dentro de los MN, como el ensayo FISH.
La actividad clastogénica de la epirubicina durante la mitosis in vivo fue reportada por el ensayo de MN en la médula ósea . En la actualidad, el origen de la MN inducida por la epirubicina aún no se ha determinado. Por lo tanto, el presente estudio fue diseñado para investigar la capacidad de la epirubicina para inducir la aneuploidía en las células somáticas y germinales de ratones macho. Para determinar la eficacia del método, se utilizaron como controles positivos dos mutágenos modelo, la colchicina y la mitomicina C, conocidos por su acción aneugénica y clastogénica, respectivamente. Los resultados observados del MNPCE y la distribución de señales por MN en el control y los dos mutágenos positivos en el presente estudio se corresponden bien con los datos publicados , . Estos datos confirmaron la sensibilidad del protocolo experimental seguido en la detección de los efectos genotóxicos.
Los resultados del ensayo de MN han demostrado que la epirubicina produce aumentos dependientes de la dosis en la formación de MN en la médula ósea de ratones in vivo (Fig. 1) y un aumento de MN teñidos centroméricamente negativos y centroméricamente positivos, lo que indica la inducción tanto de clastogenicidad como de aneugenicidad (Fig. 2). Tanto el potencial clastogénico como aneugénico de la epirubicina en las células somáticas puede dar lugar al desarrollo de tumores secundarios. Los resultados de la clastogenicidad confirman los hallazgos de estudios anteriores in vivo, en los que se observaron aumentos en la formación de MN y aberraciones cromosómicas estructurales en células somáticas de ratón en un rango de dosis similar tras el tratamiento con epirubicina . Los resultados de estos estudios también concuerdan con la inducción de micronúcleos por epirubicina en células cancerosas murinas in vitro , en los eritrocitos de huevos de gallina incubados y en la línea celular linfoblastoide humana TK6 , previamente comunicada. Además, la inducción de aberraciones cromosómicas estructurales y numéricas también se notificó anteriormente en pacientes con cáncer que recibían quimioterapia con epirubicina . Estudios anteriores también han demostrado que la epirubicina induce aberraciones cromosómicas estructurales en células HeLa cultivadas , aberraciones cromosómicas tanto estructurales como numéricas e intercambios de cromátidas hermanas en una línea celular de hámster chino , y aberraciones cromosómicas en cultivos de linfocitos de sangre periférica de mujeres con cáncer de mama tratadas con un régimen que contiene epirubicina in vitro .
Estudios en humanos han demostrado que ciertos regímenes de quimioterapia aumentan la frecuencia de aneuploidía en las células germinales , , lo que sugiere que tales pacientes pueden tener un mayor riesgo de resultados reproductivos anormales, particularmente en las edades reproductivas. Por lo tanto, es de interés general disminuir el riesgo de producción de aneuploidía, detectar los aneugenes de las células germinales y comprender los mecanismos causales. En el presente estudio, se determinó la aneuploidía en las células germinales mediante el ensayo de FISH de espermatozoides con sondas de ADN específicas para los cromosomas 8, X e Y de ratón, cada una etiquetada con un color diferente. Para determinar la fiabilidad de los métodos, se utilizó como sustancia de control positivo la colchicina, de la que se sabe que es predominantemente aneugénica, y los resultados del control positivo y negativo estuvieron en el mismo rango que los de estudios anteriores , -. Estos datos confirmaron la sensibilidad del protocolo experimental en la detección de los efectos aneuploidogénicos de los compuestos ensayados.
La epirubicina es más activa en las fases S y G2 del ciclo celular; sin embargo, tiene cierta actividad detectable en todas las fases del ciclo celular . A menudo se ha informado de que las sustancias químicas con propiedades aneugénicas pueden alterar la progresión de la división celular tanto en las células meióticas como en las mitóticas . En el presente estudio, se evaluó el tiempo de desarrollo de las divisiones meióticas en los espermatocitos hasta los espermatozoides del epidídimo mediante el ensayo de incorporación de BrdU. Los resultados indican claramente que la epirubicina prolongó la duración de las divisiones meióticas en los espermatocitos de ratón durante 48 h (Fig. 3). Por lo tanto, estas observaciones confirman los hallazgos anteriores de que la inhibición de la función de la topoisomerasa II inducida por la epirubicina durante diferentes fases del ciclo celular ralentiza la progresión del ciclo celular y hace que las células se detengan en la fase G2/M . Dicha detención en G2/M puede deberse a la inducción de la maquinaria del punto de control G2, que permite reparar el ADN dañado antes de que las células pasen a la siguiente fase del ciclo celular.
La información in vivo sobre los efectos de la epirubicina en la no disyunción durante la meiosis es limitada, pero algunas otras antraciclinas, como la doxorrubicina y su derivado idarubicina, impiden la segregación cromosómica e inducen aumentos significativos en las frecuencias de espermatozoides disómicos y diploides . Además, un estudio in vitro demostró que el tratamiento de cultivos de hámsteres chinos con epirubicina inducía aberraciones numéricas en forma de hipodiploidía e hiperdiploidía . Por otra parte, el análisis de citometría de flujo e histológico de la espermatogénesis de los ratones mostró un aumento del coeficiente de variación en el histograma del ADN como medida de aneuploidía, y un aumento de las espermátidas diploides tras el tratamiento con epirubicina . En concordancia con los informes citados anteriormente, el presente experimento demostró que la exposición a la epirubicina causó aumentos significativos dependientes de la dosis en las frecuencias de espermatozoides disómicos y diploides y que la inducción de la aneuploidía fue linealmente sensible a la dosis entre 0 y 12 mg/kg de epirubicina (Fig. 4). Estas observaciones in vivo también coinciden con un informe anterior in vitro sobre linfocitos humanos cultivados a partir de individuos sanos y pacientes con cáncer en los que la exposición a la doxorrubicina provocó un aumento de las trisomías de los cromosomas 7 y 17 . Además, Ganapathi et al. informaron de que las células de leucemia humana HL-60 que llevan la monosomía 8 como único cambio cariotípico adquirieron marcadores 7q21 tras la exposición a la doxorrubicina. Además, los hallazgos citogenéticos mostraron trisomía 8 en pacientes que recibieron cursos de quimioterapia sistémica con antraciclina . Se observó una monosomía 7, 7q-, y una translocación desequilibrada que incluía el cromosoma 7 en pacientes que recibieron quimioterapia con antraciclina . Además, las aberraciones cromosómicas estructurales de los cromosomas 1, 9 y 16 se han relacionado con los fármacos quimioterapéuticos que contienen antraciclina .
Entre otras clases de inhibidores de la topoisomerasa II, el etopósido se ha estudiado previamente en espermatocitos de ratón , . Los resultados de estos estudios indican que el etopósido actúa como agente genotóxico e induce aneuploidías en las células germinales principalmente meióticas tras el tratamiento de las células paquiténicas. Por otro lado, Kallio y Lähdetie, descubrieron que la sensibilidad al etopósido en ratones era mayor durante la diploteno-diaquinesis de los espermatocitos primarios, se reducía durante la paquiteno tardía y era baja durante las etapas de preleptoteno; un patrón muy diferente al de los productos químicos alquilantes del ADN. Estos autores sugirieron que el etopósido provocaba un fallo en la resolución de los brazos cromosómicos recombinados, probablemente asociado a la detención del ciclo celular y al desencadenamiento de la vía apoptótica. En sus detallados estudios citogenéticos, Marchetti et al. informaron de que el paquiteno era la etapa más sensible de la espermatogénesis para la inducción de aberraciones cromosómicas estructurales y aneuploidía. Dado que los datos de Schmid et al. y los de Kallio y Lähdetie pudieron demostrar que el etopósido prolongaba el ciclo celular meiótico, parece posible que los efectos observados en las primeras divisiones de escisión por Marchetti et al. en el grupo de 24,5 días de apareamiento puedan haberse inducido realmente en una fase posterior, es decir durante la diaquinesis meiótica, MMI o MMII en lugar de la paquitectura como sugirieron los autores.
En el estudio actual, planificamos un estudio de FISH de esperma para determinar si el tratamiento subagudo con dosis bajas del inhibidor de la topoisomerasa II, epirubicina, tendría un efecto porque las etapas más tempranas de la profase se incluirían en el tratamiento con epirubicina. Se inyectaron dosis individuales de 0,25, 0,5 y 1 mg/kg de epirubicina en 12 días consecutivos, y se tomaron muestras de esperma 23 días después del último tratamiento con epirubicina. Una dosis total de 12 mg/kg de epirubicina aplicada a toda la profase de la meiosis aumentó significativamente las frecuencias de espermatozoides disómicos y diploides, mientras que una dosis total de 3 y 6 mg/kg de doxorrubicina fue negativa (Fig. 5). Por el contrario, una dosis única de 6 mg/kg de epirubicina aplicada a los espermatocitos durante la MMI/MMII dio un resultado positivo (Fig. 4). Estos datos sugieren que los estadios más tempranos de la profase contribuyen relativamente menos a la aneuploidía inducida por la epirubicina en las células germinales masculinas.
En el presente estudio, se encontró que la epirubicina causó incrementos notables de espermatozoides autodiploides (XX88 y YY88). Tras el tratamiento con epirubicina, los espermatozoides autodiploides resultantes de la detención de la MMII eran más frecuentes que los espermatozoides diploides resultantes de la detención durante la MMI (XY88). Así, la segunda división meiótica fue más sensible al tratamiento con epirubicina que la primera división meiótica. La conclusión de que las segundas divisiones meióticas fueron más sensibles al tratamiento con epirubicina que las primeras divisiones meióticas también está respaldada por las frecuencias observadas de cromosomas sexuales disómicos. Los espermatozoides con señales de XX8 o YY8 fueron más frecuentes que los espermatozoides con señales de XY8. Estas observaciones confirman que el ensayo FISH de esperma para disomía o diploidía es capaz de detectar los efectos inducidos durante ambas divisiones meióticas y de comparar la sensibilidad de ambas divisiones meióticas, como se informó previamente , .
En el presente ensayo FISH de esperma, se encontró que la dosis positiva más baja para causar esperma disómico o diploide fue de 6 mg/kg de epirubicina. Sin embargo, los estudios de MN en médula ósea de ratón mostraron que la exposición a 3 mg/kg de epirubicina produjo un aumento significativo de MNPCE. Esta observación sugiere que las MN en la médula ósea se inducen a dosis más bajas que las disomías o diploidías en los espermatozoides. Por lo tanto, la médula ósea es el tejido más sensible. Sin embargo, los ensayos miden puntos finales diferentes. La pérdida y rotura de cromosomas se mide en el ensayo de MN, y la no disyunción se detecta en el ensayo de FISH en espermatozoides. Por lo tanto, los presentes datos confirman el paradigma general de la evaluación del peligro, según el cual un resultado positivo del ensayo de MN en la médula ósea es un indicador del potencial genotóxico de un compuesto en las células germinales. Sin embargo, la cuantificación de la aneuploidía en las células germinales es importante a efectos de la evaluación de riesgos.
Los inhibidores de la topoisomerasa del ADN tienen una clara tendencia a causar roturas de la doble cadena del ADN, que dan lugar principalmente a la formación de MN negativos en el centrómero. Del mismo modo, la demostración de que la epirubicina es un eficaz inhibidor de la topoisomerasa II sugiere que la epirubicina provoca sus efectos clastogénicos a través de este mecanismo. Los metabolitos de la epirubicina también pueden activar las células para aumentar la producción intracelular de especies reactivas de oxígeno, cuyas formas estables y difusibles pueden dañar el ADN nuclear . Si los mecanismos de reparación celular están sobrecargados, el daño primario del ADN puede dar lugar a una aberración cromosómica estructural o numérica y, finalmente, causar tumores . Esta sugerencia se ve respaldada por el hecho de que los individuos que desarrollaron una segunda neoplasia maligna tras el tratamiento de una primera neoplasia maligna tenían una menor capacidad para reparar las roturas de doble cadena del ADN que aquellos que no desarrollaron una segunda neoplasia maligna, medida por la intensidad de γH2AX . La inducción de MN positivas al centrómero por parte de la epirubicina indica que puede haber otro mecanismo a través del cual la epirubicina induce su efecto genotóxico. Esta observación subraya la importancia de utilizar la modificación FISH del ensayo de MN para determinar el origen de la MN inducida. El mecanismo potencial por el que la epirubicina puede ejercer su efecto aneugénico es a través de la inhibición de la topoisomerasa II, que puede dar lugar a una mala segregación de los cromosomas durante la división celular. Esto ocurre porque la topoisomerasa II del ADN es necesaria para la correcta separación de las cromátidas hermanas durante las divisiones celulares, produciéndose tanto la no disyunción como la rotura en su ausencia , . Por lo tanto, la epirubicina puede ser capaz de inhibir dos funciones clave de la topoisomerasa II; su capacidad para segregar adecuadamente los cromosomas recién replicados, así como su función en la reliquidación de las roturas transitorias de ADN de doble cadena.
En resumen, utilizando el ensayo FISH con una sonda de ADN centromérico para MN de eritrocitos, se demostró que la epirubicina no sólo es clastogénica sino también aneugénica en células somáticas in vivo. Mediante el ensayo de incorporación de BrdU, se demostró que el retraso meiótico causado por la epirubicina era de aproximadamente 48 h. Con el análisis de FISH de esperma, se demostró que la epirubicina induce aneuploidías durante la meiosis que dan lugar a espermatozoides disómicos, así como una detención meiótica completa que crea espermatozoides diploides. La prevalencia de espermatozoides autodiploides (XX88, YY88) y disómicos (XX8 o YY8) indica que la segunda división meiótica es más sensible a la epirubicina que la primera división meiótica. Los resultados también sugieren que las primeras fases de la profase contribuyen relativamente menos a la aneuploidía inducida por la epirubicina. Tanto el potencial clastogénico como el aneugénico de la epirubicina pueden dar lugar al desarrollo de tumores secundarios y a resultados reproductivos anormales en pacientes con cáncer y en el personal médico expuesto a regímenes farmacológicos que incluyen epirubicina. Aunque la epirubicina tiene menos toxicidad sistémica y cardíaca que la doxorrubicina y otras antraciclinas con un espectro de acción antitumoral equivalente, tiene efectos aneuploidogénicos y citotóxicos en las células no tumorales. Este efecto aneuploidogénico del fármaco puede ser responsable de la aparición de resultados reproductivos anormales y de tumores secundarios, que se observan en algunos pacientes con cáncer algún tiempo después del tratamiento exitoso de sus cánceres primarios con quimioterapia que contiene epirubicina.