Precipitación de proteínas con sulfato de amonio: La clave para salar
La precipitación salina puede ser una herramienta muy poderosa para purificar proteínas por precipitación. El sulfato de amonio suele ser la sal elegida ya que es barata, muy soluble en agua y es capaz de hidratarse mucho más (interactuar con más moléculas de agua) que casi cualquier otro disolvente iónico. En la práctica, el sulfato de amonio se añade directamente como sólido o se añade como solución (normalmente) saturada para precipitar las proteínas deseadas.
A bajas concentraciones de sal (<0,15M), la adición de más sal en general tiende a aumentar la solubilidad de las proteínas, ya que los iones protegen a las moléculas de proteínas de las cargas de otras moléculas; esta tendencia se denomina «salazón». En algún momento, la fuerza iónica se vuelve demasiado alta y comienza a tener un efecto negativo en la solubilidad de las proteínas, lo que se denomina «salting-out». Esto ocurre porque la sal disuelta compite con las proteínas por las escasas moléculas de agua, aumentando la tensión superficial del agua y, por tanto, haciendo que la proteína se pliegue más estrechamente. La reducción de la superficie de la proteína se traduce en menos interacciones proteína-agua, lo que permite más interacciones hidrofóbicas entre las moléculas de la proteína, provocando la agregación y, posteriormente, la precipitación.
Las proteínas en solución también pueden fraccionarse, ya que se precipitarán en función de la concentración de sal. De este modo, es posible purificar proteínas específicas añadiendo una cantidad específica de sulfato de amonio para precipitar las proteínas no deseadas, recuperando el sobrenadante y añadiendo después un poco más de sulfato de amonio para precipitar la proteína deseada y guardando después ese pellet de proteína precipitada. Dado que la precipitación de la sal sólo afecta a la solubilidad de las proteínas y no las desnaturaliza, la fracción recuperada puede almacenarse en la solución salina durante períodos prolongados de tiempo sin tener que preocuparse por la contaminación bacteriana, ya que el alto contenido de sal inhibe cualquier crecimiento microbiano o actividad de la proteasa.
Debido a que la precipitación con sulfato de amonio sólo reduce la solubilidad de las proteínas y no las desnaturaliza, las proteínas pueden concentrarse eliminando la solución de sulfato de amonio restante y, a continuación, el pellet de proteínas puede resolverse en tampones estándar o en una concentración menor de sulfato de amonio. La cromatografía de interacción hidrofóbica o la cromatografía de filtración en gel pueden utilizarse entonces para purificar aún más la solución de proteínas. El sulfato de amonio también puede utilizarse para guiar a algunas proteínas desdobladas por desnaturalizantes como la urea de vuelta a sus conformaciones nativas adecuadas aumentando gradualmente la concentración de sulfato de amonio.
Hay algunas prácticas recomendadas que deben tenerse en cuenta cuando se trabaja con sulfato de amonio, tales como:
- Utilizar un mortero y una mano de mortero para romper los grumos y moler de otro modo el sulfato de amonio para facilitar la adición y la disolución.
- Añadir sólo una pequeña cantidad de sulfato de amonio cada vez, esperar a que se disuelva y agitar suavemente para evitar la formación de espuma.
- Utilizar un tampón como HEPES o Tris 50 mM para minimizar la naturaleza acidificante del sulfato de amonio.
- Utilizar sulfato de amonio de grado analítico ya que los grados inferiores suelen presentar contaminación por metales pesados.
El proceso de precipitación de la sal tiene algunas desventajas. La salazón de las proteínas requiere un conocimiento previo de la solubilidad de la proteína. Además, cualquier contaminante presente en la muestra inicial puede seguir estando presente en la fracción que contiene la proteína de interés; este proceso concentra la proteína pero no la purifica. Además, puede ser necesario eliminar la sal de la muestra de proteína, por lo que se requerirá un procesamiento adicional en forma de diálisis o cromatografía.
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