Proteínas inhibidoras de la apoptosis: Translating Basic Knowledge into Clinical Practice

Clase 1 de proteínas inhibidoras de la apoptosis.

Las IAP de clase 1 contienen dominios BIR homólogos y un motivo de dedo RING. La IAP ligada al X tiene tres dominios BIR y un dedo RING. Fue la primera IAP de esta clase en ser identificada y sigue siendo la mejor caracterizada. Duckett et al. (24) identificaron XIAP en 1996 en una búsqueda de genes de mamíferos homólogos al IAP de baculovirus. Se une e inhibe las caspasas 3, 7 y 9 con afinidad nanomolar, pero no se une ni inhibe la caspasa 8 (25, 26). cIAP1 (también conocido como MIHB, hiap2 y BIRC2) y cIAP2 (también conocido como MIHC, hiap2 y BIRC3) están estructuralmente relacionados con XIAP con tres dominios BIR y un dedo RING. Estas IAP se identificaron mediante la purificación bioquímica de proteínas asociadas al receptor de muerte TNF-R2, pero su función en este receptor sigue sin estar clara (27). cIAP1 y cIAP2 se expresan en la mayoría de los tejidos humanos, pero la expresión de cIAP1 es mayor en el timo, los testículos y el ovario, y la de cIAP2 es mayor en el bazo y el timo (27). cIAP1 y cIAP2 se unen e inhiben las caspasas 3 y 7, aunque con menos fuerza que XIAP (25). No inhiben las caspasas 1, 6 y 8. ML-IAP (también conocida como livina, KIAP y BIRC7) e ILP-2 tienen un dedo RING y sólo un dominio BIR, pero su dominio BIR es más homólogo al dominio BIR3 de XIAP, cIAP1 y cIAP2 (de ahí su inclusión en esta clase). La ML-IAP se expresa en el hígado fetal normal, el riñón y los testículos y el timo adultos, así como en líneas celulares de melanoma y linfoma. ML-IAP inhibe las caspasas 3 y 9 con una afinidad similar a la de cIAP1 pero no se une ni inhibe las caspasas 1, 2, 6 u 8 (28). La expresión de ILP-2 está normalmente restringida a los testículos adultos, pero también se ha documentado en una línea celular linfoblastoide. La ILP-2 inhibe la caspasa 9, pero no las caspasas 3, 7 u 8 (29). Queda por determinar si las variaciones en la afinidad por las caspasas entre las diferentes IAPs están relacionadas con sus funciones intracelulares endógenas.

Proteínas inhibidoras de la apoptosis de clase 2.

El miembro de la familia IAP de clase 2, NAIP, tiene tres dominios BIR pero ningún motivo de dedo RING. Sus dominios BIR están más distanciados de los dominios BIR de las IAP de clase 1. El NAIP fue identificado en 1995 por Roy et al. (30), mientras buscaban el gen en 5q13 responsable de las atrofias musculares espinales infantiles. La NAIP se expresa en el hígado adulto, la placenta y el sistema nervioso central. Inhibe las caspasas 3 y 7, pero no las caspasas 1, 4, 5 u 8 (31).

Proteínas inhibidoras de la apoptosis de clase 3.

Los miembros de la IAP de clase 3, como la survivina, sólo contienen un único dominio BIR y ningún dedo RING. La survivina se expresa en el hígado, riñón, pulmón y tracto gastrointestinal del feto, pero no se expresa en la mayoría de los tejidos normales del adulto (32). La expresión preferente de survivina en el tejido fetal sugiere que desempeña un papel en el desarrollo. La survivina se sobreexpresa con frecuencia en diversos tumores malignos, como los adenocarcinomas de pulmón, páncreas, colon, mama y próstata (32, 33, 34, 35, 36).

La expresión diferencial entre las células normales y las malignas puede aprovecharse con fines terapéuticos. Por ejemplo, el promotor de la survivina podría utilizarse como promotor específico del tumor en el que un gen de interés se activa en las células malignas, pero no en las normales. Esta orientación transcripcional puede ser útil para la terapia génica del cáncer (37). Alternativamente, la expresión de survivina podría utilizarse como marcador tumoral para la identificación temprana de la malignidad, como se discute en detalle más adelante.

Las proteínas inhibidoras de la apoptosis inhiben las caspasas activas

La inhibición de las caspasas es el mecanismo mejor conocido por el que las PAIs previenen la apoptosis. En reacciones enzimáticas, la XIAP recombinante inhibe las caspasas 3, 7 y 9, pero no la caspasa 8. In vitro, la sobreexpresión de XIAP en células 293T previene la escisión de la procaspasa 3 y la apoptosis inducida por BAX y FAS (38). El efecto de la XIAP sobre la activación de las caspasas se ha asignado a sus dominios BIR, siendo el dominio BIR2 el que inhibe las caspasas 3 y 7, y el dominio BIR3 RING el que inhibe la caspaza 9.

Base estructural de la inhibición de caspasas por la proteína inhibidora de la apoptosis ligada al cromosoma X.

Dados los datos celulares y enzimáticos que indican que las IAPs inhiben las caspasas, se emprendieron esfuerzos para explorar las interacciones físicas entre las IAPs y las caspasas. La mayoría de los estudios se han centrado en la XIAP porque puede producirse en forma recombinante y cristalizarse. La XIAP inhibe las caspasas 3 y 7 y la caspasa 9 a través de dominios separados. Su dominio BIR2 (aminoácidos 163-240) con su extensión NH2-terminal (aminoácidos 124-162) inhibe las caspasas 3 y 7, mientras que su dominio BIR3 (aminoácidos 241-356) inhibe la caspasa 9 (39). Estos estudios proporcionaron la base para el desarrollo de inhibidores de la IAP dirigidos a los bolsillos de unión a caspasas de la molécula.

El dominio BIR2 inhibe la proteína inhibidora de la apoptosis ligada al cromosoma X.

Se ha propuesto un modelo de «anzuelo, sedal y plomada» para explicar cómo la XIAP inhibe la caspasa 3 (Fig. 3)⇓. El «gancho» (residuos 138-146 del extremo NH2) inhibe la caspasa 3 al situarse en el sitio activo de la caspasa, bloqueando así el bolsillo de unión al sustrato de la caspasa 3 activa. La «línea» representa dos enlaces peptídicos en Val147 que conectan el gancho con el disipador. El «sinker» (residuos 148-150) estabiliza la interacción entre XIAP y la caspasa 3 (40). En este modelo, la XIAP inhibe la caspasa 3 por impedimento estérico. Como tal, inhibe las caspasas 3 y 7 a través de un mecanismo distinto de los inhibidores de la caspasa peptidil como la benciloxicarbonil-VAD-fluorometilcetona que compiten con el sustrato de la caspasa por el bolsillo de unión.

El dominio BIR3 inhibe la proteína inhibidora de la apoptosis ligada al cromosoma X.

Los primeros estudios determinaron que el dominio BIR3 de XIAP podía inhibir la caspasa 9 (26, 41), pero sólo recientemente se ha dilucidado el mecanismo. El dominio BIR3 de XIAP forma un heterodímero con la caspasa 9 monomérica, impidiendo así la dimerización y activación de la caspasa 9. Además de atrapar a la caspasa 9 en forma monomérica, también mantiene el sitio activo de la caspasa 9 en una conformación inactiva (42). Así, es interesante observar que XIAP inhibe la caspasa 9 sin tocar físicamente el sitio activo.

En una extensión de los estudios estructurales, se han examinado los efectos de las mutaciones en los dominios BIR sobre los efectos antiapoptóticos de XIAP. Las mutaciones que afectan a la extensión NH2-terminal de BIR2 (por ejemplo, D148A) suprimen el papel protector de XIAP en la prevención del ligando Fas (un estímulo de la vía extrínseca de activación de caspasas) o de la apoptosis inducida por Bax (un estímulo de la vía intrínseca de activación de caspasas). En cambio, las mutaciones que afectan al dominio BIR3 (por ejemplo, W310A) reducen la inhibición de la apoptosis inducida por BAX mediada por XIAP, pero no por CD95 (43). Así, estas mutaciones apoyan los estudios estructurales que demuestran que el dominio BIR2 es necesario para la inhibición de la caspasa 3 y que el dominio BIR3 inhibe la caspasa 9.

Survivin.

Mientras que XIAP inhibe las caspasas 3, 7 y 9 a través de interacciones directas, el mecanismo por el que survivin inhibe las caspasas está menos claro. Según algunos estudios (44, 45), la survivina se une e inhibe las caspasas 3 y 7 activas, pero no la caspasa 8. En cambio, otros (46) no detectan una interacción de la survivina con la caspasa 3. Un estudio de Marusawa et al. (47) informó que la survivina no inhibe las caspasas 3, 7 o 9 recombinantes en reacciones enzimáticas o en extractos citosólicos previamente estimulados con citocromo c y dATP. Sin embargo, cuando se añade survivina a los extractos citosólicos antes de la activación de la caspasa 9 por adición de citocromo c y dATP, impide la activación de la caspasa 3/7. Así, estos resultados sugieren que la survivina inhibe la caspasa 9 activa, pero no las caspasas 3 y 7 activas, y que la inhibición de la caspasa 9 requiere un cofactor. Para identificar dicho cofactor, Marusawa et al. (47) utilizaron un cribado de dos híbridos para identificar proteínas de unión a survivina e identificaron el HBXIP. En reacciones enzimáticas, la survivina y la HBXIP en combinación (pero ninguna de las dos proteínas por separado) inhibieron la actividad de la caspasa 9. Serán necesarios estudios adicionales para resolver estas discrepancias y descifrar el mecanismo por el que la survivina inhibe las caspasas. Además, para generalizar la importancia del HBXIP como cofactor necesario para la survivina, será necesario evaluarlo en otros sistemas celulares. Este trabajo será un paso importante hacia el desarrollo de inhibidores químicos de survivina.

Más allá de la inhibición de caspasas

La mayor parte de la atención se ha centrado en las PAIs como inhibidores de caspasas, pero múltiples líneas de evidencia indican que las PAIs pueden inhibir la apoptosis a través de efectos sobre la progresión del ciclo celular, la división celular y la transducción de señales.

Las proteínas inhibidoras de la apoptosis regulan la división celular.

Las proteínas IAP probablemente desempeñan un papel en la división celular. Por ejemplo, las levaduras carecen de caspasas pero tienen homólogos de IAP que contienen un dominio BIR. La supresión de la IAP de la levadura conduce a la formación ineficaz de esporas, lo que indica que, al menos en la levadura, la IAP desempeña un papel en la meiosis (20, 21, 22). En las células de mamíferos, la survivina se coloca en el aparato mitótico, incluyendo la tubulina B, los microtúbulos, los centrosomas y los cinetocoros (48, 49, 50). La inhibición de survivina con un anticuerpo antisupervivencia da lugar a un retraso de la metafase y produce células mitóticas con husos mitóticos más cortos y menos densos (48, 50).

Las proteínas inhibidoras de la apoptosis regulan la progresión del ciclo celular.

La evidencia también implica a las PAI como reguladoras del ciclo celular. Por ejemplo, la sobreexpresión de XIAP detiene las células en la fase G0-G1 del ciclo celular, y esta detención del crecimiento se asocia con la regulación a la baja de la ciclina A y D1 y la inducción de los inhibidores de la quinasa dependiente de ciclina p21 y p27 (51). Además, XIAP se une a los reguladores del ciclo celular MAGE-D1 y NRAGE, pero la importancia de esta interacción no está clara (52). La survivina también se ha implicado en la regulación del ciclo celular. En las células HeLa, la survivina es prácticamente indetectable en las células G1 y aumenta ∼5 y 40 veces en las células en fase S y G2-M, respectivamente (50). Los cambios en los niveles de ARNm de survivina también se correlacionan con aumentos en la proteína survivina y la actividad del promotor.

Las proteínas inhibidoras de la apoptosis regulan la señalización celular.

La familia de proteínas IAP también desempeña un papel en la señalización celular mediante la activación del factor nuclear (NF)-κB. XIAP y NAIP, por ejemplo, forman un complejo con la quinasa TAK1 y su cofactor, TAB1, que conduce a la activación de la c-Jun-NH2-terminal quinasa 1 (53). La c-Jun-NH2-terminal quinasa 1 activada posteriormente activa el NF-κB a través de la cascada de fosforilación de la proteína quinasa activada por mitógenos (54). Además, el XIAP promueve la translocación de la subunidad p65 del NF-κB al núcleo, que es un requisito previo para la actividad del NF-κB (55). Por último, XIAP promueve la degradación del inhibidor de NF-κB Iκβ (51).

A medida que se aclare el papel de las IAP en la regulación de la división celular, el ciclo celular y la transducción de señales, será importante identificar los dominios de IAP responsables de estas actividades. Si se consigue identificar los dominios separados de las proteínas que inhiben las caspasas, el ciclo celular y la transducción de señales, se podrían fabricar IAP mutantes que disocien estas funciones. Este trabajo podría conducir al desarrollo de inhibidores de IAPs que bloqueen específicamente la inhibición de las caspasas por parte de las IAPs mientras que las IAPs conservan su función como reguladores del ciclo celular y de la transducción de señales.

Regulación de la función de la proteína inhibidora de la apoptosis por parte de las proteínas inhibidoras endógenas

Los miembros de la familia IAP están regulados a nivel del gen, del mensaje y de la proteína, pero los detalles de esta regulación están fuera del alcance de esta revisión. Más bien, esta revisión se centrará en la regulación de las PAI por proteínas inhibidoras endógenas porque sirven como prototipos para los inhibidores químicos terapéuticos de las PAI.

Las proteínas reguladoras de unión a PAI se identificaron por primera vez en Drosophila. Se demostró que las proteínas Reaper, Hid, Grim (56) y Sickle (57) se unen e inhiben la IAP de Drosophila, DIAP1. Posteriormente, se identificaron las versiones humanas de Reaper (Rpr), Hid, Grim (Grm) y Sickle (Skl) y se denominaron SMAC/DIABLO y HTRA2. Estos inhibidores de IAP comparten una secuencia homóloga en su extremo NH2 que es responsable de la unión e inhibición de IAPs (Fig. 4)⇓.

SMAC y HTRA2.

Los SMAC y HTRA2 humanos son proteínas mitocondriales que se liberan junto con el citocromo c durante la disrupción de la mitocondria. Al ser liberadas, se escinden a una forma activa. En su estado activo, SMAC y HTRA2 se unen a las IAP, impidiendo así su asociación con las caspasas (58, 59, 60, 61). Las funciones inhibidoras de IAP de la familia de proteínas SMAC están codificadas en su extremo NH2. Los péptidos correspondientes a los siete aminoácidos del NH2-terminal son capaces de unirse a XIAP (62). La mutación de la alanina del NH2-terminal a glicina suprime la capacidad del péptido SMAC para unirse a las IAP y ejercer su función proapoptótica (63). Cuando se internalizan en las células, los péptidos correspondientes a los siete aminoácidos NH2-terminales del SMAC son capaces de sensibilizar a las células de cáncer de pulmón H460 al cisplatino y al Taxol (64) y a las células de neuroblastoma al ligando inductor de la apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral. Se han observado resultados similares con HTRA2 y los inhibidores de IAP en Drosophila. Las propiedades antitumorales de los péptidos SMAC se han extendido a los xenoinjertos, donde las versiones permeables a las células de estos péptidos reducen los tumores cuando se combinan con cisplatino (64) o TRAIL (65) en xenoinjertos de carcinoma de pulmón y glioma, respectivamente. Así pues, estos péptidos SMAC sirven como prototipos de pequeñas moléculas que imitan las acciones de SMAC e inhiben las IAPs y serían útiles terapéuticamente para una variedad de tumores malignos.

Estudios estructurales.

Dada la potencial utilidad clínica de las moléculas similares a SMAC, se han realizado esfuerzos para comprender las interacciones físicas entre SMAC y IAPs. Los estudios estructurales han demostrado que SMAC se une a XIAP en dos sitios distintos. El extremo NH2 del SMAC activo (residuos 56-59) se une al bolsillo BIR3 de XIAP e inhibe de forma competitiva el dominio BIR3 de la unión a la caspasa 9. Las mutaciones en el dominio BIR3 que impiden la unión a la caspasa 9 (por ejemplo, W310) también impiden que el dominio BIR3 se una a SMAC, lo que sugiere que los sitios de unión de SMAC y la caspasa 9 se solapan. Sin embargo, los sitios de unión no son idénticos porque algunas mutaciones en BIR3 (por ejemplo, H343A) suprimen la unión de BIR3 a la caspasa 9 pero no a SMAC (63, 66).

La proteína completa de SMAC y los péptidos NH2-terminales también se unen al dominio BIR2 de XIAP, pero con una afinidad ∼5- a 10 veces menor que la de BIR3. El mecanismo por el que SMAC interrumpe la asociación de BIR2 de la caspasa 3 no está claro, pero puede estar más relacionado con el impedimento estérico que con la unión competitiva (63).

HTRA2 se une al dominio BIR3 de XIAP, pero con una afinidad más débil que SMAC (67). En su estado activo, HTRA2 existe como un trímero, y las mutaciones que impiden la formación del trímero hacen que HTRA2 sea inactivo. Además de inhibir los IAPs a través de la unión del bolsillo BIR3, HTRA2 también puede escindir e inactivar múltiples IAPs incluyendo XIAP, cIAP1, y cIAP2, pero no survivin (68).

SMAC β.

SMAC y HTRA2 también pueden ejercer su actividad proapoptótica a través de efectos independientes de la unión a IAP. Un estudio de Roberts et al. (69) describió una forma de empalme alternativo de SMAC que se produce de forma natural, denominada SMAC β, que carece de la secuencia de orientación mitocondrial. SMAC β no interactuó con XIAP, cIAP1 o cIAP2, probablemente debido a la pérdida de su terminación NH2. Aunque no es capaz de unirse a IAPs, SMAC β potenció la apoptosis mediada por TRAIL y VP-16 en células 293. Del mismo modo, las versiones mutantes de HTRA2 (67) que son incapaces de unirse a los IAPs siguen siendo capaces de inducir la apoptosis cuando se sobreexpresan en las células de cáncer de mama MCF7. No está claro en este estudio cómo estas formas de empalme alternativas pueden seguir induciendo la apoptosis. Quizás mantengan su capacidad de ubiquitinación de los IAPs, promoviendo así la destrucción de los IAPs. Alternativamente, SMAC y HTRA2 pueden tener socios de unión adicionales no relacionados con los IAPs a través de los cuales ejercen una influencia proapoptótica. En el caso de HTRA2, tiene una actividad de proteasa independiente de su papel en la unión de IAPs, y esta actividad de proteasa puede regular la apoptosis en algunos sistemas (68).

XAF1.

XAF1 es otro inhibidor de IAPs. XAF1 es una proteína nuclear que se une y secuestra a XIAP en el núcleo. En las reacciones bioquímicas, XAF1 se une e inhibe a XIAP. En las células, la sobreexpresión de XAF1 bloquea la inhibición de la apoptosis mediada por XIAP. Sin embargo, sigue sin estar claro si el secuestro de XIAP en el núcleo simplemente separa a la XIAP de las caspasas citosólicas o si existen efectos adicionales de la XIAP localizada en el núcleo (70). Las moléculas que imitan a XAF1 probablemente funcionarían de forma diferente a SMAC y serían una estrategia alternativa al desarrollo de un inhibidor de XIAP.