Raíz adventicia
Métodos de enraizamiento de microbrotes
Si los microbrotes no forman raíces durante la etapa de multiplicación, deben recibir tratamientos especiales para iniciar y hacer crecer un sistema de raíces adventicias. Los microbrotes pueden enraizarse in vitro y luego aclimatarse al medio ambiente, o pueden enraizarse ex vitro, combinando así el enraizamiento y la aclimatación.
La facilidad y la tasa de éxito del enraizamiento determinan qué método se utiliza en un cultivar concreto. El método más rentable es el enraizamiento ex vitro de los microbrotes. El enraizamiento ex vitro ahorra una transferencia adicional in vitro al medio de enraizamiento y acelera la aclimatación haciendo que la micropropagación sea más eficiente. El enraizamiento in vitro se utiliza si se carece de instalaciones de enraizamiento y aclimatación ex vitro, si las tasas de éxito son bajas con el enraizamiento ex vitro, y a discreción del director del laboratorio.
Enraizamiento in vitro. Los ingredientes del medio y las condiciones de incubación son fáciles de cambiar cuando se utilizan condiciones in vitro para promover la iniciación de las raíces y el desarrollo temprano. Las fórmulas de sales nutritivas pueden seguir siendo las mismas, cambiarse o reducirse, a menudo a macrosales de media potencia, y la humedad relativa puede reducirse mediante el uso de tapas ventiladas (Figura 5). Las condiciones de incubación del cultivo de luz y temperatura pueden modificarse para el enraizamiento. Muchos microbrotes se incuban en la oscuridad durante un periodo para la iniciación de las raíces y luego se transfieren a condiciones iluminadas.
Figura 5. La cinta quirúrgica de microporos proporciona ventilación a este recipiente de brotes que se están enraizando; esto ayuda a reducir la humedad relativa y prepara a las nuevas plantas para el entorno del invernadero.
El medio nutritivo de enraizamiento en el que se colocan los microbrotes recién cortados generalmente contiene auxina. Normalmente se añaden concentraciones micromolares de IBA y/o NAA al medio antes del autoclave. La concentración de auxina depende de la especie y del cultivar. Esta información suele estar disponible en línea utilizando un motor de búsqueda académico, como Google Scholar http://scholar.google.com/. Normalmente, el nombre de la planta, las palabras «vitro» y «raíz» (o raíz adventicia) en la cadena de búsqueda arrojarán información específica. Si la literatura es escasa para una planta en particular, utilice parientes cercanos en la búsqueda para determinar cómo respondieron.
Debido a que se reconoce que las mismas concentraciones de auxina que estimulan la iniciación de la raíz adventicia pueden inhibir el desarrollo de la raíz, algunos utilizan un enfoque de dos medios. Cuando los microbrotes de Cotinus coggygria estuvieron en un medio que contenía 10 µM de IBA durante 5 días antes de ser transferidos a un medio libre de auxinas, el 100% enraizó; mientras que sólo el 40% enraizó con el cultivo continuo en un medio con 10 µM de IBA (Metivier et al., 2007). Padilla y Burgos (2010) cultivaron microbrotes de olivo en medios que contenían hasta 4 µM de IBA durante 2 semanas, seguidos de una transferencia a un medio basal sin auxina que dio como resultado un 65-93% de enraizamiento, dependiendo del cultivar.
En algunos casos, se han aplicado soluciones de IBA a los microbrotes como inmersión basal durante un minuto o más. Tsvetkov et al. (2007) obtuvieron el mejor enraizamiento de los microbrotes de Sorbus domestica cuando se sumergieron en una solución de IBA de 14,8 µM durante 80 s antes de colocarlos en el medio basal.
La oscuridad durante o antes del enraizamiento puede aumentar el éxito del enraizamiento y la sincronización del mismo entre los microbrotes. La etiolación, el desarrollo de los brotes sin luz, aumentará la competencia celular para el enraizamiento adventicio (Murray et al., 1994). Cuando los microbrotes de nogal fueron etiolados, el enraizamiento fue mejor con una emergencia más rápida de las raíces que de los brotes verdes (Leslie et al., 2010); sin embargo, los brotes etiolados eran frágiles y requerían un manejo más cuidadoso.
Cultivar los microbrotes verdes en medio de enraizamiento en la oscuridad durante un período relativamente corto puede mejorar en gran medida el enraizamiento. Un periodo de oscuridad de 4 a 7 días en un medio Murashige y Skoog de media potencia que contenía 1 µM de floroglucinol y 1,4 µM de IBA, seguido de la incubación en condiciones de luz, dio como resultado un mejor enraizamiento de los microtallos de manzana ‘Delicious’ que si se cultivaban sólo en la luz o en la oscuridad durante periodos más largos (Zimmerman, 1984). Al cultivar los microtallos de manzana ‘MM106’ en un medio con 4 µM de IBA en la oscuridad durante 0-10 días, se descubrió a través de la investigación histológica que la inducción de la raíz se produjo durante los primeros 3 días o menos en la oscuridad y que los primordios de la raíz cónica eran visibles en el día 7 (Naija et al., 2008). El momento del tratamiento en la oscuridad es crítico y puede necesitar ser determinado para cada cultivo o genotipo; sin embargo, puede mejorar en gran medida el éxito del enraizamiento.
Algunas especies enraízan mejor si la parte superior de los microbrotes está iluminada y la parte basal en el medio está en la oscuridad, de forma similar a como se enraízan los macrobrotes en un medio de invernadero bajo niebla. El oscurecimiento del medio puede lograrse pintando el exterior de los recipientes de cultivo de color negro hasta un nivel ligeramente superior al del medio y cubriendo el medio con gránulos de policarbonato estéril u otra sustancia que excluya la luz, u oscureciendo el propio medio mediante la adición de carbón activado. A veces se utiliza un medio de invernadero, como la vermiculita, que también excluye la luz, para el enraizamiento in vitro después de ser humedecido con el medio nutritivo.
Se demostró que el oscurecimiento de las bases sólo de los microbrotes aumentaba el enraizamiento de la almendra, el melocotón y el olivo (Rugini, 1988) y la manzana (Mencuccini y Rugini, 1993) en comparación con los controles incubados en la oscuridad o bajo luces. Sin embargo, en un estudio separado, Mencuccini y Rugini (1993) informaron de que el oscurecimiento basal tenía poco efecto sobre el enraizamiento de los microbrotes de almendra, albaricoque, castaña, jojoba y olivo, y era inhibitorio para el nogal. Por lo tanto, si el éxito de enraizamiento está por debajo de lo deseable, el oscurecimiento basal puede ser útil.
Enraizamiento ex vitro. Si los porcentajes de enraizamiento son similares, el enraizamiento ex vitro puede ser más eficiente y rentable que el in vitro (Leva, 2011). Los costes son mayores cuando se realiza el enraizamiento in vitro debido a los ingredientes, el tiempo de preparación, los medios de autoclave, la mano de obra para los traslados y el movimiento de los cultivos, y el espacio de incubación. El traslado al invernadero es similar entre el enraizamiento in vitro y ex vitro, y el tiempo de trasplante puede ser similar o más lento cuando hay raíces en los microbrotes (Figuras 4 y 6). El enraizamiento ex vitro es más eficaz. Se ha informado de que la calidad de las raíces de los microplantes de nogal es superior cuando las raíces se forman ex vitro bajo niebla que in vitro en un medio gelificado (Leslie et al., 2010).
Figura 6. (a) y (b) Plántulas de cerezo micropropagadas in vitro listas para ser trasplantadas a un medio de turba de esfagno en invernadero antes de ser colocadas bajo una alta humedad relativa para su aclimatación. (c) Las plántulas de cerezo siendo plantadas como primer paso de la aclimatación en el invernadero. (d) Las plántulas de nogal siendo plantadas en un piso antes de ser colocadas bajo alta humedad relativa en un invernadero.
El enraizamiento ex vitro puede ser una mejora del enraizamiento in vitro. Aunque los microtallos in vitro de Gardenia jasminoides enraizaron en 10 días, en comparación con los 14 de los microtallos ex vitro, todos los microtallos enraizados ex vitro sobrevivieron a la aclimatación en comparación con el 80% de supervivencia de los microtallos enraizados in vitro (Hatzilazarou et al., 2006). También se informó de una menor supervivencia de los microtallos enraizados in vitro en comparación con los microtallos enraizados ex vitro en el caso del nogal (Leslie et al., 2010).
Puede ser necesario tratar los microtallos con auxina antes de plantarlos en el medio de enraizamiento ex vitro. Los microbrotes de pistacho tratados con un 2% de IBA en talco enraizaron ex vitro en un 79% en comparación con el 48% de enraizamiento de los controles (Benmahioul et al., 2012).
También se puede obtener un mejor enraizamiento ex vitro con auxina aplicada como inmersión líquida aplicada a la parte basal de los microbrotes. Un pulso de 15 minutos en 250 µM de IBA hizo que el 90% de los microtallos de la especie arbórea Melia azedarach enraizaran en comparación con la ausencia de enraizamiento en los microtallos de control (Husain y Anis, 2009). Una inmersión de 2 horas en una solución acuosa de 588 µM de IBA provocó el enraizamiento del 90% de los microbrotes de Malus zumi en comparación con el 20% de enraizamiento de los controles (Xu et al., 2008).
Tal vez debido a una reversión a la juventud, el aumento del tiempo de multiplicación in vitro puede aumentar el enraizamiento de los microbrotes. Leva y Petruccelli (2012) probaron el enraizamiento hasta siete subcultivos y encontraron que el enraizamiento era mejor después del séptimo subcultivo.
Las instalaciones, la especie, el método de envío, la demanda de los clientes y las preferencias de los gestores dictan cómo se enraízan los microbrotes. Las especies que enraízan muy fácilmente o que enraízan durante la fase de proliferación de los brotes pueden aclimatarse rápidamente al entorno ex vitro. Son las especies difíciles las que reciben una atención especial, en cuanto a la iluminación, el tratamiento con auxinas, el enraizamiento in vitro o ex vitro, y otros factores. Los clones difíciles de enraizar exigen mayores precios a los clientes porque el enraizamiento es un impedimento para la producción eficiente. El enraizamiento puede mejorarse si se enfoca como un proceso de múltiples pasos de adquisición de competencia, iniciación de la raíz y posterior crecimiento de la misma. Todos estos pasos deben ser considerados y abordados, especialmente con los clones más difíciles de enraizar.